联合转染人VEGF165和ANG-1双基因对大鼠骨髓基质干细胞成骨分化的影响

[目的]研究联合转染入血管内皮细胞生长因子165(VEGF165)和血管紧张素-1(ANG-1)双基因对大鼠骨髓基质干细胞(BMSCs)成骨分化潜能的影响.[方法]将本室构建的编码人VEGF165和ANG-1双基因腺病毒质粒pAd-VIA在QBI-293A细胞内进行包装和扩增,获得腺病毒载体pAd-VIA,将其体外转染大鼠BMSCs,应用诱导培养液定向诱导向成骨细胞分化.实验分为4组:A.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs并诱导组;B.BMSCs诱导组;C.腺病毒载体pAd-VIA转染BMSCs组;D.单纯BMSCs组.通过碱性磷酸酶(ALP)染色和活性的测定、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色来评价联合转染双基因对BMSCs成骨分化潜能的影响.[结果]重组腺病毒质粒pAdVIA在QBI-293A细胞内成功包装和扩增,有大量的绿色荧光蛋白表达,体外转染大鼠BMSCs后,A、B组的ALP染色、Ⅰ型胶原免疫荧光染色、茜素红染色为阳性,而C组和D组为阴性.ALP活性表达具有时间相关性,3 d开始表达,7 d到达高峰,在7、14 d,A、B组与C、D组之间ALP表达均具有统计学差异(P＜0.01),A组和B组之间,在各个时间点均无统计学差异(P＞0.05).[结论]腺病毒载体pAd-VIA转染大鼠BMSCs后,未明显影响其体外成骨分化潜能.     

三七总皂甙对骨髓基质细胞成骨分化及成骨作用的调节

目的 探讨三七总皂甙对骨髓基质细胞体外成骨分化及成骨作用的影响.方法 分离、纯化大鼠骨髓基质细胞(bone marrow strowal cells,BMSCs),采用常规培养液、成骨诱导液及含100 mg/L PNS的成骨诱导液培养,对各组细胞进行形态学观察,采用MTT法、对硝基苯磷酸盐法、茜素红染色方法及ELISA法观察各组细胞增殖、ALP活性、矿化结节的形成及RANKL的表达.结果 骨诱导组、PNS组较培养液组细胞增殖明显(P<0.05),而PNS组高于骨诱导组(P<0.05);骨诱导组、PNS组ALP活性、钙结节形成高于培养液组 (P<0.01),PNS组高于骨诱导组(P<0.05);骨诱导组、PNS组RANKL表达低于培养液组(P<0.05),PNS组低于骨诱导组(P<0.05).结论 BMSCs成骨诱导过程中,PNS可促进其成骨分化、下调其RANKL表达从而具有抑制破骨细胞生成的潜能.     

血小板裂解液对大鼠BMSCs成骨分化的干预效应

目的 观察血小板裂解液(platelet lysate,PL)对大鼠BMSCs成骨诱导分化的干预效应.方法 成年健康清洁级Wistar大鼠24只,体重250～300 g,雌雄不限.取16只大鼠心内采血,采用3次离心结合反复冻融法制备PL,ELISA法测定PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量.另取8只大鼠,采用全骨髓分离培养法扩增传代BMSCs,取第4代细胞按1×104/cm2接种行成骨诱导培养.按诱导培养液的不同,实验分为3组,A、B组基础诱导培养基中分别含终浓度为5%和1%的PL,C组仅含基础诱导培养基.倒置相差显微镜动态观察各组细胞形态变化及生长状况;诱导培养7d,各组行ALP染色;诱导培养2、8、10d,ALP/总蛋白含量确定ALP活性;诱导培养20 d,茜素红染色观察矿化结节形成并定量分析.结果 PL中PDGF、TGF-β1、IGF-1和VEGF含量分别为(300±30)、(140±25)、(80±35)和(70±20)pg/mL.倒置相差显微镜观察,各组BMSCs形态逐渐发生改变,出现类成骨细胞样形态特征;A组细胞形态变化不及B、C组明显,但细胞增殖较快:20 d A组细胞仍密集生长,ECM中形成的矿物沉积显著少于B、C组.诱导培养7 d,A组细胞胞浆中有少量颗粒,ALP染色呈弱阳性;B、C组细胞胞浆中有大量棕褐色颗粒,ALP染色呈强阳性.诱导培养2、8、10d,ALP活性定量分析示A组显著低于B组和C组(P<0.05).诱导培养20d,茜素红染色显示A、B、C组钙结节数量分别为(7.67±1.10)、(12.87±0.81)和(15.59±1.25)个;矿化结节面积分别为(161 778.70±44 550.80)、(337 349.70±56 083.24)和(415 921.70±71 725.39)像素;A组均明显低于B组和C组(P<0.05),B、C组间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论 PL 是多种生长因子的承载体系,以剂量依赖方式抑制BMSCs成骨诱导中ALP活性和矿化结节形成.     

双基因pCDNA 3.1-NGF-IRES-BMP2真核质粒转染大鼠BMSCs诱导成骨的研究

[目的]研究双基因NGF与BMP2转染大鼠BMSCs并诱导BMSCs成骨分化后表达情况。[方法]将第三代大鼠BMSCs,分为五组,单基因pCDNA3.1-NGF转染组(A组),单基因pCDNA3.1-BMP2转染组(B组),双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2转染组(C组),空质粒对照组(D组)、阴性对照组(E组)。运用Lipofectamine2000介导将各组基因转染BMSCs,Western-blot检测目的基因蛋白表达情况,免疫组织化学染色检测I型胶原蛋白表达含量并测定灰度值。ALP试剂盒检测ALP表达含量,茜素红染色测定转染后各组钙结节并计数。[结果]各组基因转染BMSCs后,Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜素红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。[结论]转染双基因pCDNA3.1-NGF-IRES-BMP2组BMSCs可同时表达两种目的蛋白,能诱导BMSCs向成骨细胞分化,NGF的加入能够增强BMP2的成骨作用。     

人小涎腺成纤维样单克隆细胞的成骨分化

目的：探索人小涎腺成纤维样单克隆细胞的体外培养、扩增方法,鉴定其性质,研究向成骨细胞分化的潜能。方法：组织块贴壁法原代培养人小涎腺细胞,收集成纤维样细胞,用96孔板稀释铺板法克隆培养,免疫荧光和RT-PCR检测细胞表型,并进行成骨诱导分化,通过骨钙素、一型胶原免疫细胞化学染色及碱性磷酸酶、茜素红钙结节染色鉴定成骨分化。结果：成功的在体外扩增培养出人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫荧光证实细胞表达CD13、CD29、CD106和CD44,RT-PCR显示CK18、α-SMA、vimentin、CD106、nestin基因表达与人骨髓间充质干细胞相似。成骨诱导8天后,碱性磷酸酶表达阳性率100%,19天后骨钙素和一型胶原大量表达,并形成钙结节。结论：所建立的分离培养体系能够获得大量人小涎腺成纤维样单克隆细胞,免疫表型类似于间充质干细胞。在成骨诱导培养条件下具有良好的向成骨细胞分化的潜能。     

载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

目的制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导BMSCs定向成骨分化能力。方法采用接枝共聚的方法合成LNPs,探讨合成时不同pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对LNPs及LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠BMSCs细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的LNPs,再用其负载pBMP-2-GFP基因转染大鼠BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达BMP-2蛋白水平和ALP活性、钙结节生成情况来评价LNPs/pBMP-2-GFP对BMSCs成骨分化的影响。结果 pH为8.5时合成的LNPs含氮量、粒径及zeta电位均低于其余pH值组,其细胞毒性最低(细胞成活率96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs经LNPs/pBMP-2-GFP转染诱导处理后,在前4 d内,其BMP-2蛋白表达量均明显高于Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP组、支链型聚乙烯亚胺25K/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05)。诱导后14 d其ALP活性高于Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组(P0.05),与成骨诱导液处理组相当(P0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而Lipo/pBMP-2-GFP组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后21 d镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。结论 pH为8.5时合成的LNPs具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导BMP-2基因转染大鼠BMSCs,并成功诱导BMSCs成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。     

腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

目的比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。结果 A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P<0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P<0.05),其余3组间差异无统计学意义(P>0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P<0.05),A组高于B组(P<0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P<0.05)。结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。     

不同组织来源间充质干细胞体外成骨分化能力的比较研究

目的比较成人脂肪间充质干细胞(ASCs)、脐带间充质干细胞(UC-MSCs)和成人骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨能力,选择优势干细胞种类作为应用于骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。方法采用含10%胎牛血清的DMEM/Ham’s F-12培养液培养3种MSCs。取3种MSCs的P3代,通过CCK8方法检测其增殖能力;通过流式细胞仪进行鉴定;通过碱性磷酸酶(ALP)和茜素红染色检测骨分化蛋白ALP的分泌和矿化钙结节的沉积,并对钙结节进行定量分析;通过实时荧光定量PCR(RT-q PCR)方法检测骨再生相关基因的表达。结果 3种P3代MSCs在3~5d之间增殖均处于对数生长期;流式鉴定3种细胞的表面标志物阳性率:CD44、CD90和CD105均高于97%,阴性率:CD14、CD34和CD45均低于1%;ALP染色结果显示3种MSCs成骨诱导9d时,细胞内均表达ALP,茜素红染色结果显示成骨诱导18d时,均呈现较好的矿化能力,BMSCs和UC-MSCs成骨诱导后形成的钙结节无显著性差异;RT-q PCR结果显示3种MSCs成骨诱导组相比较于对照组,成骨再生相关基因Osterix、ALP、I型胶原(COL1)和骨钙素(OCN)均显著性高表达;3种MSCs成骨诱导9d时,UC-MSCs实验组的COLI基因表达显著性高于BMSCs,成骨诱导18d时,ASCs实验组的Osterix基因表达显著性高于BMSCs。结论 ASCs和UC-MSCs具有一定的成骨矿化能力,有望成为骨组织工程治疗骨缺损的种子细胞。     

BMSCs条件培养基改善地塞米松对成骨细胞成骨功能抑制效应的研究

目的探讨BMSCs的旁分泌作用对地塞米松所致成骨细胞成骨功能抑制作用的影响。方法首先通过培养小鼠BMSCs 24 h制备无血清条件培养基备用。将小鼠MC3T3-E1细胞株复苏并传至第3代用于实验,分为4组:A组为对照组;B组于细胞中添加1μmol/L地塞米松;C组于细胞中按1∶1比例添加1μmol/L地塞米松和BMSCs条件培养基;D组仅添加BMSCs条件培养基。培养24 h后收集细胞测定ALP含量,Western blot测定细胞内RUNX2、骨钙素(Osteocalcin)蛋白表达,实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR)测定细胞内α1-Ⅰ型胶原(collagen typeⅠ-α1,COL1A1)、RUNX2、ALP、Osteocalcin基因表达;21 d后行茜素红染色观察钙结节形成情况。结果培养24 h后,B、C、D组ALP含量均显著低于A组,B组低于C、D组(P0.05),C、D组间差异无统计学意义(P0.05)。Western blot检测示,B组RUNX2蛋白相对表达量显著低于A、C、D组(P0.05),A、C、D组间比较差异无统计学意义(P0.05);B组Osteocalcin蛋白相对表达量均显著低于A、C、D组,A、C组低于D组(P0.05),A、C组间差异无统计学意义(P0.05)。RT-q PCR检测示,B、C、D组RUNX2、Osteocalcin、COL1A1、ALP基因相对表达量均显著低于A组(P0.05);D组RUNX2、Osteocalcin、ALP基因相对表达量均显著高于B、C组,C组显著高于B组(P0.05);D组COL1A1基因相对表达量显著高于B组(P0.05),B、C组间及C、D组间比较差异均无统计学意义(P0.05)。培养6 d时A组细胞死亡;21 d时B、C、D组均可见钙结节阳性染色,且逐渐增强。结论小鼠BMSCs条件培养基能改善地塞米松对成骨细胞成骨功能的抑制效应。     

BMSCs来源成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架构建血管化组织工程骨研究

目的探讨大鼠BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞复合壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架植入大鼠桡骨缺损处的成骨作用和成血管作用。方法取分离培养至第3代的SD大鼠BMSCs行成骨和成内皮细胞诱导并鉴定。分别将内皮细胞(A组)、成骨细胞(B组)、混合细胞(成骨细胞和内皮细胞比例为1∶1,C组)均匀滴加于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架上制备3组细胞-支架复合物,MTT检测支架内细胞增殖活性。取2月龄雄性SD大鼠30只,制作大鼠桡骨5 mm长缺损模型并分别植入3组细胞-支架复合物(n=10)。术后4、8、12周分别取移植物行HE染色观察,CD34免疫组织化学染色计数微血管密度,RT-PCR法检测骨桥蛋白(osteopontin,OPN)和骨保护素(osteoprotegrin,OPG)mRNA表达。结果 BMSCs成骨诱导7 d后ALP染色可见细胞质内蓝染颗粒,细胞核呈红染;内皮细胞诱导14 d后,CD34免疫细胞化学染色可见细胞内棕色颗粒。MTT检测示3组细胞活性随时间延长逐渐升高。HE染色示,术后12周A组未见明显类骨质形成,而有较密集的微血管结构及较多纤维组织形成;B、C组可见均质的类骨质,呈条索状和岛状分布,可见大量成骨样细胞存在。术后各时间点A、C组微血管密度均显著高于B组(P<0.05);A组术后12周微血管密度高于C组(P<0.05),其余2个时间点A、C组间差异无统计学意义(P>0.05)。A组3个时间点OPN和OPG mRNA表达水平均较低,与B、C组比较差异有统计学意义(P<0.05);B、C组分别于术后8、12周OPN mRNA表达达峰值,4周时OPG mRNA表达达峰值。结论 BMSCs来源的成骨细胞和内皮细胞按1∶1比例共培养于壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架作为组织工程骨移植物,可以促进大鼠桡骨缺损部位骨的形成和血管化,促进骨缺损愈合。     

联合rhBMP-2与成骨细胞诱导骨髓基质细胞成骨分化的实验研究

目的探讨rhBMP-2和成骨细胞联合诱导骨髓基质细胞(BMSCs)的成骨分化能力。方法应用全骨髓贴壁法分离培养4周龄SD大鼠的BMSCs,通过改进酶消化法结合反复贴壁法培养1日龄SD乳鼠成骨细胞。实验分为4组:rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组、单纯培养液组。倒置相差显微镜及扫描电镜观察细胞生长情况;分别收集第3、6、9天细胞培养液上清液定性及定量测定碱性磷酸酶并进行统计学分析。结果 rhBMP-2诱导组、成骨细胞诱导组、rhBMP-2+成骨细胞诱导组均检测出成骨细胞生成,其中,rhBMP-2+成骨细胞诱导组碱性磷酸酶含量明显大于前两组,差异有统计学意义(P0.05)。结论rhBMP-2、成骨细胞、rhBMP-2联合成骨细胞均能提供成骨微环境,并在体外诱导BMSCs向成骨细胞分化,rhBMP-2联合成骨细胞对BMSCs的成骨分化具有更优的诱导能力。     

新型多孔PLGA/HA复合支架体外细胞相容性的实验研究

目的研究新型多孔聚乳酸乙醇酸/羟基磷灰石(PLGA/HA)支架材料的体外细胞相容性。方法采用贴壁法对兔骨髓基质细胞(BMSCs)进行体外矿化诱导培养,扩增后与实验A组(含5%HA的PLGA/HA),实验B组(含10%HA的PLGA/HA)及对照C组(仅含PLGA)分别进行体外复合培养;并通过定性及定量法检测BMSCs在材料表面的粘附能力、增殖活力,验证细胞材料复合体的成骨活性。比较分析各组之间的差异。结果兔BMSCs在每组材料的表面均能生长,经体外诱导后在支架材料的表面形成钙结节,A、B组细胞的粘附及增殖能力均强于C组(P<0.05),A、B组之间无差异。结论兔BMSCs与新型多孔PLGA/HA支架材料有良好的相容性。     

钽涂层对骨髓间充质干细胞的黏附增殖及成骨分化的影响

目的探讨钽涂层金属在体外促进大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)黏附、增殖及成骨分化方面的作用。方法在体外取6只6周龄SD大鼠BMSCs进行原代培养至第3代,使用化学气相沉积系统自行制备钽涂层金属。然后进行流式细胞术鉴定、BMSCs三向诱导、荧光染色、细胞增殖检测及实时荧光定量聚合酶链反应技术(Q-PCR)试验。观察比较BMSCs在钛合金圆片(Ti6Al4V组)和钽金属圆片(Ta组)表面黏附的BMSCs数量、增殖速率、成骨细胞特异性转录因子(OSX)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、骨粘连蛋白(OSN)和骨桥蛋白(OPN)的表达情况。结果流式细胞术结果显示CD44(94.55%)、CD90(95.01%)、CD34(0.06%)。诱导成骨分化14 d后碱性磷酸酶(ALP)染色阳性;诱导成骨分化21 d后出现茜素红钙化结节;成脂诱导21 d后油红O染色呈阳性;成软骨诱导21 d后阿利新蓝染色评估有软骨形成能力。激光共聚焦显微镜结果显示BMSCs在Ti6Al4V组和Ta组金属圆片表面贴附生长,细胞间互相接触、聚集成片,Ta组金属圆片上黏附的BMSCs数量明显多于Ti6Al4V组,并且具有更好的延展性能。细胞增殖检测结果发现,分别共培养1、3、5、7 d后Ta组BMSCs的增殖速率明显快于Ti6Al4V组,差异均有统计学意义(P<0.05)。Q-PCR结果发现,与Ti6Al4V组相比,体外培养7 d后Ta组金属圆片更能促进OSN和OPN的表达,差异有统计学意义(P<0.05);体外共培养21 d后,Ta组金属圆片更能促进OSX、RUNX2、OSN和OPN的表达,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论相比于传统的骨科植入物钛合金而言,钽涂层金属能够更好地促进BMSCs的黏附,增殖和成骨分化。     

成骨细胞与血管内皮细胞体外直接共同培养生物学特性观察

目的 观察骨髓间充质干细胞(BMSCs)诱导的成骨细胞和肾血管内皮细胞直接共同培养的细胞相容性,并探索两者共同培养的合适比例.方法 成骨细胞和血管内皮细胞按1:0、3:1、2:1、1:1、0:1比例分为5组直接共同培养,观察各组细胞形态并计数细胞比较增殖能力,检测碱性磷酸酶(ALP)活性,研究共同培养后成骨细胞成骨能力的改变.结果 共同培养后细胞增殖及成骨细胞ALP染色阳性率高于单一细胞培养,成骨细胞与内皮细胞按2:1比例培养优于按3:1和1:1比例培养,增殖最快,ALP阳性率最高.结论 成骨细胞和血管内皮细胞体外直接共同培养具有良好的相容性,可促进成骨细胞的增殖、分化及ALP的分泌,提高其成骨能力.两者按2:1混合是较佳比例.     

rhBMP-2体外诱导骨质疏松大鼠BMSCs成骨及VEGF表达的研究

目的:观察骨形态发生蛋白-2对骨质疏松时骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨及成骨因子VEGF表达的影响,为骨质疏松证的防治提供新的方法。方法:将20只6月龄,体重(300±20) g雌性SD大鼠双侧卵巢切除,术后3个月利用双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度并与术前比较,确保造模成功,并运用全骨髓贴壁法培养骨质疏松大鼠BMSCs,倒置相差显微镜下观察BMSCs形态。随机把骨质疏松大鼠BMSCs 第2代(p2)细胞分成实验组和对照组,分别加入完全培养基(含rhBMP-2)、成骨诱导液进行成骨诱导。2周后茜素红染色法检测各组细胞钙结节的形成,酶标仪测定碱性磷酸酶活性及RT-PCR法检测VEGF的表达量。结果:(1)大鼠全身骨密度:手术前后大鼠全身骨密度分别为(0.179±0.007),(0.158±0.006) g/cm²,差异有统计学意义(t=4.180,P<0.05).(2)茜素红染色:BMSCs(P2)成骨诱导2周后实验组染色效果明显强与对照组。(3)碱性磷酸酶活性:BMSCs(P2)成骨诱导2周后碱性磷酸酶活性实验组明显高于对照组,分别为(15.62±1.27),(8.62±0.93) μg/prot,差异有统计学意义(t=7.709,P<0.01).(4)BMSCs(P2)成骨诱导2周后VEGF表达:实验组明显高于对照组,分别为3.723±0.143,0.950±0.072,差异有统计学意义(t=29.462,P<0.01).结论:rhBMP-2能提高去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的体外成骨能力,可促进成骨因子VEGF的表达,调控VEGF的表达可能是骨形态发生蛋白-2参与骨代谢的机制之一。     

墨汁灌注法观察细胞-陶瓷颅骨修复过程中血管生成与骨形成的关系

目的 通过双侧颈总动脉墨汁灌注法观察组织工程大鼠颅骨极量骨缺损修复过程中骨形成、血管生成与陶瓷降解之间的关系及血供来源和走行。方法 28只成年雄性SD大鼠随机分成实验组和对照组，在全麻及无菌条件下离断其左侧股，胫骨，将骨髓冲入α-MEM培养基中诱导培养大鼠的自体骨髓基质细胞。实验组将已分化的成骨细胞复合含孔磷钙陶瓷修复与所取细胞对应的大鼠颅骨极量骨缺损，对照组植入无成骨细胞的陶瓷。于术后第4、8、12、16、20、24及28周每线各处死2只大鼠，取材前行双侧颈总动脉墨汁灌注，制成脱钙切片和不脱钙磨片，光学显微镜下观察。结果 实验组大鼠颅骨缺损修复过程中，动脉血供主要来源于周围骨床，纵横直行并呈离心性分布，静脉回流蜿蜒迂曲呈向心性分布。术后16-28周，血管密集处大部分陶瓷已降解并被新骨所取代。对照组虽有大量血管杂乱地渗入陶瓷孔隙，也可见陶瓷为支架的组织工程骨修复过程中，陶瓷内部交通的孔隙有利于血管生成和新骨形成；血管生成与新骨形成及陶瓷降解关系密切。     

Effect of the same mechanical loading on osteogenesis and osteoclastogenesis in vitro

Purpose: To investigate the influence of the same mechanical loading on osteogenesis and osteoclastogenesis in vitro. Methods: Primary osteoblasts, bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs, cultured in osteoinductive medium) and RAW264.7 cells cultured in osteoclast inductive medium were all subjected to a 1000 mstrain (ms) at 1 Hz cyclic mechanical stretch for 30 min (twice a day). Results: After mechanical stimulation, the alkaline phosphatase (ALP) activity, osteocalcin protein level of the osteoblasts and BMSCs were all enhanced, and the mRNA levels of ALP and collagen type I increased. Additionally, extracellular-deposited calcium of both osteoblasts and BMSCs increased. At the same time, the activity of secreted tartrate-resistant acid phosphatase, the number of tartrate-resistant acid phosphatase-positive multinucleated cells, matrix metalloproteinase-9 protein levels of RAW264.7 cells and the extracellular calcium solvency all decreased. Conclusion: The results demonstrated that 1000 ms cyclic mechanical loading enhanced osteoblasts activity, promoted osteobla     

成人间充质干细胞体外诱导分化为成骨细胞的研究

目的 研究成人骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外培养定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性和应用价值.方法 抽取健康成年骨髓,Ficoll密度梯度离心结合贴壁培养法经连续传代后改用含10 nmol/L地塞米松、10 mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50 μmol/L维生素C的条件培养基培养,在相差显微镜下观察细胞形态变化,流式细胞仪细胞表面分子标志鉴定,免疫组化和RT-PCR检测Ⅰ型胶原蛋门的表达,同时测定细胞内碱件磷酸酶的含量.结果 BMSCs原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养后细胞形态向成骨细胞转化,经RT-PCR、流式细胞仪、细胞碱性磷酸酶活性、糖原染色鉴定为成骨细胞.结论 BMSCs经合理的体外诱导培养后符合成骨细胞的形态特征和生物学特性,有望成为理想的骨组织工程种子细胞来源.     

体外诱导糖尿病鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮样细胞分化的研究

目的 观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的体外培养方法和向血管内皮样细胞分化的能力.方法 利用密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法从STZ诱导的糖尿病大鼠骨髓中提纯单个核细胞,体外扩增3代,倒置显微镜观察细胞生长及形态,流式细胞仪检测BMSCs表面抗原表达.取扩增第3代的BMSCs,分为2组,诱导组加入诱导培养剂[含10％胎牛血清、10μg/L血管内皮生长因子(VEGF)、2μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100 U/ml青霉素、100 mg/L链霉素的M199培养基]中诱导分化,对照组则不加任何细胞因子.2周后行细胞形态学观察,免疫细胞化学法检测VEGF受体(VEGFR)-2表达,流式细胞仪测定CD34表达量,紫外线分光光度法测定一氧化碳(NO)含量,电镜观测胞质WeibelPalade小体.结果 STZ腹腔注射可诱导糖尿病大鼠模型.流式细胞仪显示第3代BMSCs表达表面抗原:CD44和CD90阳性细胞表达率分别为(97.8±0.9)％和(96.8±1.4)％,而CD11 b/c和CD34阳性细胞表达率分别为(13.2±0.6)％和(1.2±0.5)％.诱导组大部分细胞形态变化不明显,呈长梭形、杆状、多角形,诱导组VEGFR-2、CD34阳性表达率分别为(97.1±1.0)％和(65.0±3.9)％,而对照组则为(7.0±1.0)％和(0.9±0.3)％,两组比较差异有统计学意义(P＜0.05);诱导组胞外NO含量(94.14±3.25) μmol/L亦明显高于对照组(70.37±2.10) μmol/L(P ＜0.05);电镜两组均未观察到胞质Weibel Palade小体.结论 经密度梯度离心分离和贴壁培养相结合的方法可从骨髓中提纯BMSCs.糖尿病鼠BMSCs可在体外诱导向血管内皮样细胞方向分化,BMSCs有望作为治疗糖尿病下肢缺血性疾病的种子细胞.