抗凝血酶基因A9850G突变导致一个新的遗传性抗凝血酶缺陷症家系

目的对一个遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症家系进行临床表型诊断和基因突变检测。方法用AT活性（AT：A）和抗原含量（AT：Ag）作实验诊断;用聚合酶链反应（PCR）对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变（His369Arg）,为国际首次报道。结果先证者表现为AT基因外显子5区的第9850位有A—G的杂合突变。结论该突变是遗传性AT缺陷症的一个新的突变位点,可以导致血栓形成。     

一种新的抗凝血酶基因突变导致遗传性抗凝血酶缺陷症

目的对1例遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员AT活性（AT：A）、AT抗原含量（AT：Ag）进行检测及基因分析，探讨该遗传性AT缺陷症发病的分子机制。方法采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT：A和AT：Ag，提取外周血基因组DNA，PCR法扩增AT基因的全部7个外显子及侧翼序列，DNA序列分析AT的基因异常。结果先证者AT：A和AT：Ag分别为45％和97mg／L，为Ⅰ型AT缺陷症。AT基因外显子5区第9833位核苷酸发生杂合性T→A突变，引起Tyr363Stop（Y363X）无义突变。其他家系成员基因测序结果显示有4人（Ⅱ2、Ⅱ6、Ⅲ7、Ⅲ14）存在该突变。结论该家系为I型遗传性AT缺陷症。AT基因外显子5区杂合性9833T—A无义突变引起AT缺陷，导致静脉血栓是该遗传性AT缺陷症的分子致病机制。该突变在国际上尚未见报道。     

抗凝血酶基因杂合突变导致的抗凝血酶缺陷症

目的 对1例先天性抗凝血酶（AT）缺陷症患者及其家系成员进行AT表型及基因突变检测。方法 采用发色底物法和免疫比浊法分别检测先证者及其家系成员血浆AT活性（AT：A）和AT抗原含量（AT：Ag），并采用PCR法对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序检测基因突变。结果 先证者的AT：Ag正常，但AT：A为正常值的65％，表现为Ⅱ型AT缺陷，其AT基因外显子6区第13830位核苷酸发生了G—A杂合突变，引起Arg393His错义突变。同样突变也见于该家系其他3名成员。结论 该家系成员的Ⅱ型AT缺陷由AT基因G13830A杂合突变所致，可致血栓形成。     

抗凝血酶基因G13328A杂合突变导致血栓形成

目的对1个遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症家系进行AT抗原（AT：Ag）、活性（AT：A）和基因突变检测并对该突变导致的AT结构和功能的变化进行研究。方法采用免疫比浊法和发色底物法分别检测AT：Ag和AT：A，用PCR法对先证者AT基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序，检测其基因突变。根据基因检测结果，对家系成员相应外显子进行PCR扩增，扩增产物直接测序用大引物法构建突变的AT表达质粒并瞬时转染COS-7细胞，用ELISA法检测细胞培养上清液和细胞内提取物巾AT：Ag。结果先证者的AT：Ag和AT：A分别为179mg／L和42．3％，为Ⅰ型AT缺陷；AT基因测序显示在AT外显子6区存在G13328A杂合突变，导致Ala（GCC）404→Thr（ACC）对家系成员进行的基因测序显示有3人（Ⅱ2、Ⅱ3、Ⅲ2）存在该突变。突变质粒在细胞培养上清液和细胞内的AT：Ag分别为正常人的40％和68％。结论该家系为Ⅰ型遗传性AT缺陷症；G13328A杂合突变是导致先证者血栓形成的原因．     

AT基因13387-9delG突变引起遗传性抗凝血酶缺陷症的分子病理机制研究

目的　研究AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制。方法　用大引物法构建 13387 9delG突变体AT重组表达质粒 (ATM) ,并将其和正常AT重组表达质粒 (ATN)分别用Superfect 试剂转染COS7细胞或CHO细胞 ,进行体外表达试验、脉冲追踪试验以及细胞免疫荧光染色。结果　ATM转染的COS7细胞培养上清液中检测不到AT抗原 ,而在细胞裂解液中 ,其AT抗原仅为转染ATN的 2 7 13%。脉冲追踪试验发现 ,在ATM转染的COS7细胞培养上清液中 ,检测不到3 5S标记的AT蛋白 ,在chase 0min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白只有ATN的 2 7 8% ;在chase 180min时 ,ATM细胞内3 5S标记的AT蛋白为 0min时的 5 0 %左右。细胞免疫荧光试验的结果表明 ,ATM转染的CHO细胞内荧光强度明显低于ATN转染的CHO细胞。结论　编码的突变AT蛋白分泌障碍和细胞内快速降解 ,是AT基因 13387 9delG突变引起AT缺陷症的分子病理机制     

3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系的表型和基因型关系的研究

目的探讨遗传性抗凝血酶缺陷症家系表型和和基因型的关系。方法对3个遗传性抗凝血酶缺陷症家系(家系1~3)作表型和基因型诊断:常规检测活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、纤维蛋白原(Fg)、凝血酶时间(TT)以筛查凝血功能,发色底物法检测蛋白C、蛋白S和抗凝血酶活性(PC∶A,PS∶A及AT∶A),免疫比浊法检测抗凝血酶抗原(AT∶Ag),Western blot检测血浆中抗凝血酶的分子量和含量;PCR扩增AT基因所有外显子及侧翼序列,DNA测序并进行基因分析。针对新基因突变,在100例正常人中检测相应突变以排除多态性,用TA克隆PCR产物测序鉴定杂合碱基缺失突变。结果 3名先证者均为反复发作的静脉血栓患者,凝血指标及PC∶A和PS∶A都正常,AT∶A分别为正常人(100%)的60%、52%和60%,AT∶Ag分别为16.9、14.1和11.4 mg/dl,Western blot显示3位先证者的血浆AT蛋白分子量正常(58 kD)而含量低于正常;基因分析发现3名先证者各携带1个杂合突变,分别为g.8263 C>T(Leu340Phe)、g.5894-6 del TTC(Phe122del)和g.5898 T>G(Phe123Cys)。3个家系中与先证者表型相似的成员,则携带有相同的AT基因突变;但除家系2先证者的父亲有静脉血栓外,家系1和3中含有相应AT基因突变的家庭成员均无血栓发生。结论 3名先证者遗传性抗凝血酶缺陷症分别由Leu340Phe、Phe122del和Phe123Cys突变所致,其中Leu340Phe和Phe123Cys突变为国际上首次报道。     

遗传性抗凝血酶缺乏症研究进展

抗凝血酶(AT)属serpin超家族成员,是体内凝血酶等的主要抑制物。遗传性AT缺乏症的分子机制研究近年来获得了较大的进展,在AT突变数据库中,已有127种与遗传性AT缺乏相关的AT基因突变。遗传性AT缺乏也是静脉血栓形成的主要危险性遗传因素之一。本文对遗传性AT缺乏症的分子机制及其在静脉血栓形成中的作用进行综述。     

凝血因子Ⅹ基因两种新的突变导致的遗传性凝血因子Ⅹ缺陷症

目的　探讨 1个遗传性凝血因子Ⅹ (FⅩ )缺陷症家系的分子发病机制。方法　测定活化部分凝血活酶时间、凝血酶原时间、FⅩ促凝活性以及FⅩ抗原进行表型诊断 ;用PCR方法对先证者的FⅩ基因 8个外显子及其侧翼序列和 5′端非翻译区 (5′UTR)序列进行扩增 ,产物纯化后直接测序检测其基因突变。应用等位基因特异性PCR验证测序所发现的突变。结果　先证者表型诊断为FⅩ缺陷症 (Ⅱ型 ) ;FⅩ基因分析发现 2个杂合突变 :第 1内含子 5′端剪接位点供位GT→AT(IVS1 1G→A)和第 8外显子 1185G→A(Arg347His)。 结论　双重杂合性突变IVS1 1G→A和Arg347His是导致该例遗传性FⅩ缺陷症的原因。     

一个新的剪接位点突变g.13776_13777insAGGT导致Ⅰ型遗传性抗凝血酶缺陷症

目的:对1例Ⅰ型抗凝血酶(AT)缺陷症患者及其家系进行表型诊断、基因分析及分子发病机制研究。方法:常规筛查检测AT缺陷症患者及其家系人员的凝血功能,采用血栓弹力图评估其高凝状态,用ELISA法检测抗心磷脂抗体(ACA)、抗β2GPI抗体,稀释的蝰蛇毒法检测狼疮抗凝物质(LA),发色底物法检测抗凝血酶(AT:A)和蛋白C活性(PC:A),凝固法检测蛋白S活性(PS:A),荧光偏振免疫法测定同型半胱氨酸(Hcy),免疫比浊法定量检测抗凝血酶抗原(AT:Ag),蛋白印迹分析血浆中AT的含量及相对分子质量,PCR法扩增AT基因的全部外显子及侧翼序列,DNA直接测序法进行基因分析。针对新的非经典剪接位点突变,提取患者的RNA,通过反转录反应结合巢式PCR扩增法,检测患者外周血中的AT异位转录本。结果:先证者的凝血筛查指标均正常,血栓弹力图指标显示其存在高凝状态,ACA、抗β2GPI抗体、LA、PC:A、PS:A及Hcy检测均正常;而其AT:A和AT:Ag同等下降,分别为45%和145 mg/L。血浆蛋白印迹检测结果显示,先证者血浆AT含量较正常混合血浆减少,但相对分子质量正常;基因分析发现,在5号内含子3’端剪接位点发生了杂合突变(g.13776_13777insAGGT);巢式PCR产物直接测序检测到异位转录本,TA克隆分析发现,异常转录本与正常转录本的比例为1∶5。结论:剪接位点突变g.13776_13777insAGGT可导致AT基因异常转录,影响AT蛋白正常表达,导致该家系发生Ⅰ型遗传性AT缺陷症,此剪接位点突变为国际首次报道。     

抗凝血酶基因13389G缺失导致的I型抗凝血酶缺乏症

目的：对一先天性I型抗凝血酶缺乏症家系进行基因突变的检测。方法：用PCR法对先证者抗凝血酶基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行 扩增，PCR产物纯化后直接测序，检测其基因突变。结果：先证者表现为抗凝血酶基因外显子6区13389G缺失，引起移码突变。结论：该突变是先天性抗凝血酶缺乏症的一个新的突变位点，可以导致血栓形成。     

抗凝血酶基因C2759T(Leu99Phe)突变导致抗凝血酶缺陷症的分子机制研究

目的研究抗凝血酶(AT)基因C2759T(Leu99Phe)突变引起AT缺陷症的分子机制。方法用大引物法构建C2759T突变体AT重组表达质粒(ATM2759)，并将其和正常AT重组质粒(ATN)分别用Superfect试剂转染COS7细胞或CHO细胞，进行体外表达试验和细胞免疫荧光染色。、结果转染ATM2759的COS7细胞，培养上清液和细胞裂解液中的AT抗原(AT：Ag)分别为ATN的35．63％和174．97％，而培养上清液中的AT活性(AT：A)为ATN的47．73％。细胞免疫荧光试验证实，转染ATM2759的CHO细胞，其荧光强度明显高于转染ATN的CHO细胞。结论Leu99Phe 突变可能不是由于影响AT与肝素的结合而导致AT缺陷，而是由于突变导致AT分泌障碍和细胞内滞留所致。     

I型遗传性抗凝血酶缺陷症两种新基因突变

目的 对两例遗传性抗凝血酶(AT)缺陷症先证者及其家系进行表型诊断和基因诊断,并探讨其分子发病机制.方法 检测凝血与抗凝指标,并进行易栓症筛查和表型诊断.采用免疫比浊法和发色底物法分别检测先证者及其家系成员AT抗原(AT:Ag)和AT活性(AT:A),抽提外周血基因组DNA,PCR扩增AT基因(GI号28906)7个外显子及其侧翼序列、5'及3'端非翻译区,利用直接测序法进行基因序列分析.针对先证者的突变位点,对其家系成员进行相应基因突变检测,同时在正常人群中筛查以排除多态性.结果 先证者1和先证者2 AT:Ag分别为126 mg/L和117 mg/L,AT:A分别为49%和48%.先证者1和先证者2的AT基因2号外显子分别发现了杂合缺失突变3239～3240delCT和杂合无义突变3206A→T(K70Stop),其家系部分成员检测到相应的杂合突变.结论 两例先证者均为I型遗传性AT缺陷症,由AT基因3239-32ZlOdelCT和3206A→T(K70Stop)突变所致.     

抗凝血酶基因13389G缺失导致的Ⅰ型抗凝血酶缺乏症

目的对一先天性Ⅰ型抗凝血酶缺乏症家系进行基因突变的检测.方法用PCR法对先证者抗凝血酶基因的7个外显子及其侧翼内含子序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.结果先证者表现为抗凝血酶基因外显子6区13389G缺失,引起移码突变.结论该突变是先天性抗凝血酶缺乏症的一个新的突变位点,可以导致血栓形成.     

Glu29→Gly纯合子突变导致的遗传性凝血酶原缺乏症

目的 对1个遗传性凝血酶原缺乏症家系进行凝血酶原(FⅡ)基因突变的检测。方法 用活化的部分凝血活酶时间（APTT)，凝血酶原时间(PT)及FⅡ促凝活性(FⅡ：C)、FⅡ抗原(FⅡ：Ag)测定进行表型诊断；用PCR法对先证的FⅡ基因14个外显子及其侧翼序列和5′端非翻译区(5′UTR)、3′端非翻译区(3′UTR)序列进行扩增，PCR产物纯化后直接测序，检测其基因突变。家系成员DNA在先证FⅡ基因突变区域扩增后测序。突变位点经限制性内切酶分析证实。103名健康献血作对照。结果 先证表型诊断为凝血酶原缺乏症(Ⅰ型)；FⅡ外显子区共发现3个与献报道的FⅡ基因序列不同的位点，其中位于第2外显子区的为纯合突变A601G。家系分析表明先证父亲、母亲和外祖母均为A601G杂合子。结论 纯合错义突变A601G引起的Glu29→Gly是导致该例遗传性凝血酶原缺乏的原因。