同源导入近交系绿色荧光裸小鼠

目的 建立一个能稳定表达EGFP的裸小鼠近交新品系,供包括人脑胶质瘤在内的所有人类肿瘤移植实验用。方法 将♀C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)转基因小鼠和♂Foxn1nu裸小鼠,按同源导入方法进行杂交和回交,用荧光手电筒和匹配的眼镜、多功能活体成像仪、荧光显微镜对是否表达EGFP进行鉴别,传至F10后进行遗传学检测。结果 所建品系命名为 Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University),14个遗传生化位点中13个表型与BALB/c（Foxn1nu）吻合,唯Pep3（肽酶-3）的电泳为b型,而标准的BALB/c近交系为a型;外周血淋巴细胞占全部有核细胞15%,T淋巴细胞仅占0.3%,与亲本的Foxn1nu一致。结论 成功地建立了一个既与亲本C57BL/6-TgN(CAG-EGFP)－样稳定表达EGFP,又与Foxn1nu裸小鼠（BALB/c背景）一样具有T细胞缺乏的荧光裸小鼠新品系- Foxn1nu.B6-CAG-EGFP｜SU ,Pep3为b型是有别于Foxn1nu裸小鼠的生化遗传标记位点。     

绿色荧光裸小鼠的选育初报

目的 选育系统表达绿色荧光蛋白的BALB/c裸小鼠,并对该小鼠各组织器官绿色荧光蛋白表达情况进行观察.方法 根据遗传学原理对C57BL/6-TgN(GFP)小鼠与BALB/c裸小鼠进行杂交、自交和回交,建立稳定表达绿色荧光蛋白的BALB/c裸小鼠,对该小鼠遗传质量进行检测;解剖观察胸腺生长情况以及多组织器官绿色荧光蛋白的表达情况.结果 成功选育出的BALB/c带绿色荧光蛋白的裸小鼠(简称荧光裸小鼠),外观呈黄绿色;胸腺缺失;在荧光显微镜下,脑、心脏、肺脏、肝脏、肾脏及胰腺等组织器官可见明显绿色荧光.结论 成功选育出BALB/c绿色荧光裸小鼠,该小鼠外观呈黄绿色,全身主要组织器官稳定表达绿色荧光蛋白.     

绿色荧光蛋白裸小鼠的培育及应用进展

绿色荧光蛋白(GFP)裸小鼠最初是为肿瘤研究而培育,是同时具有T淋巴细胞缺陷和系统表达GFP基因的裸小鼠.近20年来,学者们对其生物学特性进行了广泛而深入的研究,为该小鼠模型的应用奠定了基础.     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的 研究曲线精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法 选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白（pCMV－EGFP）表达载体，应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质料DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右，雄鼠与雌鼠合笼交配；分娩后3周，剪取仔鼠尾，提取基因组DNA，应用PCR、Southern blotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠，荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果 共注射41只雄性小鼠，存活34只，其中32只具有交配、受精能力，获得仔鼠382只。仔鼠经检测，PCR阳性133只，织冰冻切片中EGFP明显表达。结论 曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。     

用曲细精管微注射法建立绿色荧光蛋白转基因小鼠

目的研究曲细精管微注射法建立转基因小鼠的可行性。方法选取人巨细胞病毒启动子调控的增强型绿色荧光蛋白(pCMV-EGFP)表达载体,应用体视解剖镜和显微注射仪将不同剂量的被脂质体包裹的质粒DNA注射到不同年龄的KM小鼠曲细精管内。在注射后40d左右,雄鼠与雌鼠合笼交配;分娩后3周,剪取仔鼠尾,提取基因组DNA,应用PCR、Southernblotting技术进行整合检测。处死2只首建小鼠,荧光显微镜观察组织冰冻切片中EGFP的表达。结果共注射41只雄性小鼠,存活34只,其中32只具有交配、受精能力,获得仔鼠382只。仔鼠经检测,PCR阳性133只,Southernblotting阳性15只。小鼠的年龄、注射剂量与EGFP的整合率没有明显关系,荧光显微镜观察下没有观察到组织冰冻切片中EGFP明显表达。结论曲细精管微注射法是动物基因转移的一条简便可行的新途径。     

慢病毒载体介导的增强型绿色荧光蛋白转基因小鼠的建立

目的 以慢病毒作为载体,制作增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠,建立慢病毒介导的转基因动物制备技术平台.方法 慢病毒包装采用三质粒系统.3个质粒分别为转基因质粒FUGW、病毒结构蛋白表达质粒psPAX2以及病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G.病毒包装时,用磷酸钙沉淀法将三质粒共转染来源于人胚肾细胞系的293FT细胞,培养48 h后,收取含病毒的上清,并通过高速离心浓缩病毒.将含浓缩病毒液作梯度稀释后感染293FT细胞,通过流式细胞计数仪测定病毒滴度.用显微注射法将浓缩的病毒液注射至FVB/N小鼠1-细胞期胚胎透明带下.在荧光显微镜下观察胚胎EGFP的表达.将注射后发育至2-细胞期的胚胎移植至假孕受体母鼠,得F0代小鼠.通过紫外光照射观测EGFP在小鼠活体内的表达水平.结果 病毒液浓缩前的滴度≥106 TU/ml(transducing unit,TU),经过高速离心对病毒进行浓缩和纯化,其滴度达到109 TU/ml以上.将浓缩病毒液注射至小鼠1-细胞期胚胎透明带下,注射后胚胎的2-细胞期卵裂率为81.8%(1 189/1 453),利用荧光显微镜分别在注射后60、84、132 h观察胚胎,均发现有较强荧光.在2-细胞期,每一视野下胚胎阳性率＞90%,说明包装的病毒成功并高效地转染小鼠胚胎.胚胎移植后假孕母鼠妊娠率为42.9%(12/28),首建鼠阳性率为60.8%(73/120),转基因小鼠的总体研制效率(转基因小鼠数/注射胚胎数)为5.0%(73/1 453).将F0代EGFP转基因小鼠分别与野生型小鼠交配,在其F1、F2、F3代小鼠中均获得了EGFP阳性小鼠,阳性率分别为91.4%(32/35)、93.8%(30/32)、93.1%(27/29).结论 通过慢病毒载体感染小鼠1-细胞期胚胎可有效地制备转基因小鼠.我们已初步建立了慢病毒介导的转基因小鼠制备技术体系.     

人脑胶质瘤干细胞移植于表达绿色荧光蛋白裸小鼠的研究

目的 培育表达绿色荧光蛋白(GFP)的裸小鼠,并探讨将其用于人胶质瘤干细胞(HGSC)移植实验研究.方法 将C57BL/6J-GFP转基因小鼠与NC系裸小鼠进行交配,在继代时严格挑选都表达GFP的无毛雄鼠与有毛母鼠交配,通过肉眼、免疫组织化学和荧光显微镜等方法观察GFP在裸小鼠皮肤和脏器中的表达情况,继将HGSC原位移植于表达GFP的裸小鼠,以观察移植瘤的生长情况.结果 传至8代的裸小鼠,包括脑在内的全身主要器官和细胞都表达GFP.对用于HGSC原位移植的脑,能清晰辨认出不发光的瘤细胞和发光的宿主细胞.而瘤细胞经人特异白细胞抗体(HLA)连接红色荧光剂(PE)的免疫组织化学染色后,在共聚焦显微镜下可清晰显示与宿主脑细胞的组织学关系.结论 用免疫功能健全、表达GFP的转基因鼠与免疫功能缺陷的裸小鼠杂交,可获得脑等组织器官表达GFP的裸小鼠.对其进行HGSC原位移植,因可清晰辨认移植瘤与宿主组织的关系而有望用于肿瘤组织重构的研究.     

转绿色荧光蛋白基因小鼠子宫内膜异位症模型的建立和评价

目的建立小鼠子宫内膜异位症种植模型,探讨荧光检测异位子宫内膜的方法。方法将转绿色荧光蛋白(GFP)基因小鼠的子宫内膜剪碎后,注射入C57BL/6小鼠的腹腔,喂养含17-β-雌二醇的无菌水,3周后剖检小鼠,在活体荧光成像系统下观察腹腔的绿色荧光,并做免疫组化染色。结果在移植转GFP基因小鼠子宫内膜的C57/BLC57BL/6小鼠的腹腔内存在绿色荧光,且免疫组化证实该异位内膜组织中表达GFP,而对照组均阴性。结论转GFP基因小鼠子宫内膜模型可清晰地显示异位内膜病灶,具有良好的应用前景。     

造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选

目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.     

CLCN3/MMTV-PyMT转基因小鼠杂交群体的建立及鉴定

目的 建立并鉴定CLCN3/MMTV-PyMT双转基因小鼠杂交群体,构建氯通道ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型.方法 将CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠分别进行繁殖,选取阳性子代鼠进行配对,培育杂交后代,然后通过PCR鉴定基因型、通过组织免疫荧光方法、Western blot检测转基因小鼠蛋白表达情况.结果 成功繁育CLCN3转基因小鼠和MMTV-PyMT转基因小鼠,经PCR鉴定成功构建CLCN3/MMTV-PyMT双转基因鼠杂交群体,并成功保种和扩群,经组织免疫荧光和Western-blot分析双转基因小鼠的ClC-3蛋白的表达高于MMTV-PyMT转基因小鼠.结论 成功构建ClC-3过表达的自发乳腺肿瘤转基因小鼠模型,为进一步研究ClC-3在肿瘤生长和转移中的功能提供了良好的动物模型.     

绿色荧光蛋白标记的人卵巢癌裸鼠原位移植模型的建立

目的 应用绿色荧光蛋(GFP)基因标记人卵巢癌细胞株H08910,建立新型裸鼠原位移植瘤模型.方法 将处于对数生长期的人卵巢癌细胞株H08910/GFP 2×106个细胞注射于裸鼠腋下,收集瘤块后接种于左侧卵巢包膜下,共6只.术后利用荧光体视显微镜连续观察肿瘤生长情况,4周后处死荷瘤鼠,观察肿瘤生长及转移情况.结果 种植的原位移植瘤成瘤率100%,移植后2周可观察到左侧肋脊角处绿色荧光团,并逐渐增大,4周后,可见肿瘤侵及腹膜、网膜、肠管、脾脏、肝脏、子宫、盆腔淋巴结,转移率达66.7%.结论 成功建立新型裸鼠原位人卵巢癌的动物模型.     

DXB／c近交系小鼠的建立及遗传学检测

将ＤＢＡ／２雌鼠与Ｃ５７ＢＬ／６雄鼠杂交后，利用其Ｆ２代中结进行兄妹交配，建立了ＤＸＢ／ｃ近交系小鼠。目前已近交２８代，历时１３年，经皮肤移植试验、下颌骨形态分析、混合淋巴细胞培养、毛色基因及生化标志基因检测，表明ＤＸＢ／ｃ系小鼠的基因已经纯合，符合一个近交系小鼠的标准，毛色基因及生化标志基因测试结果同时表明ＤＸＢ／ｃ系小鼠的遗传背景组合了两亲代品系的遗传基因。     

一种昆明种属来源的视网膜变性小鼠同源导入C57BL/6J小鼠近交系的表型研究

目的 将本实验室发现的一种昆明种属来源的自发性遗传性视网膜变性小鼠(暂命名为KMrdr/rdf小鼠)的致病基因同源导入C57 BL/6J小鼠,培育一种新的近交系小鼠(暂命名为B6rd/rdf小鼠),并对B6rdf/rdf小鼠进行眼部表型的发育学研究.方法 采用眼底照相、眼底荧光素血管造影、组织形态学和视网膜电图观测不同年龄B6rdf/rdf小鼠的眼部表型.结果 眼底照相和荧光素血管造影发现B6rdf/rdf小鼠表现为进行性视网膜血管退化及脱色素改变,视网膜组织形态学表现为外核层在P14显著变薄,外核层和外网状层至P21已基本消失,视网膜电图自P14已记录不到明显波形.结论 B6rdf/rdf小鼠眼部表型呈快速进行性改变,与KMrdf/rdf小鼠表型相似.     

线粒体钾通道Kcna3基因敲除小鼠初步制备

目的为观察线粒体钾通道在缺血再灌注(I/R)心肌损伤中的作用,探讨其和心衰的关系,制备基因敲除小鼠模型以探讨钾通道单分子作用。方法用BAC载体制备同源重组载体,对129小鼠胚胎干细胞(ES)打靶筛选后,显微注射至C57BL/6J小鼠囊胚获得嵌合小鼠。经尾基因组DNA PCR鉴定和测序,鉴别杂合子小鼠。结果在40只灰色小鼠中初步鉴定出Kcna3+/-基因型F1小鼠8只。结论在国内首先用ES同源重组基因打靶方法,成功育成Kcna3基因敲除鼠杂合子,为下一步获得纯合子鼠奠定了基础。对进一步用钾离子通道病模型研究心肌保护病理生理机制和药物筛选具重要意义。     

人类结肠癌裸鼠移植瘤模型制作及临床1.5TMR成像仪的1H-MRS研究

目的 探索，临床医用1．5T MR成像仪对人类结肠癌荷瘤裸鼠模型行常规MR戍像及氢质子眦频谱（1HMR spectroscopy，1H-MRS）分析的可能性。方法 人类结肠癌SW480肿瘤块种植于25只麻醉状态下的裸鼠皮下制成结肠癌异位移植瘤裸鼠模型。给予荷瘤鼠行MR T1WI,T2WI、1H—MRS扫描，并与病理所见对比。结果25只裸鼠均成瘤．T2WT图像均能清晰显示肿瘤，肿瘤T1WI信号与肌肉等，T2WI为高信号，中央坏死区为更高信号。18只鼠MRS单体素采集成功，22只二维多体素采集成功，25只三维多体素采集成功。结论 临床医用1．5TMR与临床医用线圈对人类结肠癌裸鼠模型可行1H—MRS研究，常规MRI T2WI图像可反映移植瘤的病理改变，研究结果更容易反映临床人类疾病的特点。     

Establishment of a C57BL/6N mouse model of giardiasis

建立人源蓝氏贾第鞭毛虫C57BL/ 6N小鼠动物感染模型。方法　用分离自河北和江苏两地蓝氏贾第鞭毛虫感染者的包囊 (河北株 ,CD和徐州株 ,XZ)分别感染两组C57BL/6N小鼠 ,收集受染鼠粪便 ,用蔗糖梯度离心法分离纯化包囊 ,计算排囊数量 ,分析排囊规律 ;观察小肠病理组织学改变。结果　C57BL/ 6N小鼠对此 2株蓝氏贾第鞭毛虫具有很高的易感性 ,接受具有活力的 1× 1 0 4 个包囊 /只的 3 6只小鼠 ,均获得感染 ,其中呈间歇性排囊者为 3 2只 ( 88 9% ) ,连续性排囊者 4只 ( 1 1 1 % )。排囊潜伏期为接种后第3d ,高峰期为第 6d。 2小时所排粪便含包囊数最高可达 2 3× 1 0 7个 /g粪。小肠粘膜出现表面分泌物增加 ,间质充血、水肿 ,炎性细胞浸润 ,粘膜坏死脱落等病理变化。结论　C57BL/ 6N小鼠可作为建立蓝氏贾第鞭毛虫感染的良好动物模型     

RNAi真核表达载体上报告基因的构建及其在人结肠癌HCT-8细胞中的表达

目的:构建携带绿色荧光蛋白报告基因的pSilencer3.1-H1真核表达载体,并转染真核细胞稳定表达,为进一步应用于RNAi相关研究奠定了基础。方法:应用PCR方法从pEGFP-C1标准质粒中获得GFP基因片段,在克隆载体中鉴定、测序;用DNA重组技术将片段定向插入RNAi常用载体pSilencer3.1-H1质粒中,构建pSilencer3.1-H1/GFP重组表达载体,经PCR及酶切鉴定后,通过脂质体介导转染HCT-8真核细胞;荧光显微镜观察GFP在细胞内的表达。结果:真核表达载体pSilenc-er3.1-H1中正确插入了GFP基因片段,并在人结肠癌HCT-8真核细胞中稳定的表达。结论:成功构建了pSilencer3.1-H1/GFP真核表达载体。     

B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台的搭建及BALB/c小鼠感染模型的建立

目的 利用基因工程技术全基因合成B型流感病毒B/Yamagata/16/88的8个基因节段,并利用反向遗传技术从体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88,同时建立BALB/c小鼠感染模型,为下一步研究B型流感病毒致病机制、传播机制以及开发新型疫苗奠定基础。方法 通过基因合成和反向遗传技术体外拯救B型流感病毒B/Yamagata/16/88。全基因组测序验证拯救病毒基因组序列与Genbank序列的一致性。将拯救病毒以10⁵EID₅₀的攻毒剂量人工感染BALB/c小鼠,通过体重变化、生存率、肺脏病毒复制等方面进行致病性分析,建立小鼠感染模型。结果 成功从体外拯救出B型流感病毒B/Yamagata/16/88,命名为B-S9。全基因组测序结果表明,B-S9基因组序列与Genbank公布序列一致。B-S9能够人工感染BALB/c小鼠,但不致死,对BALB/c小鼠呈现低致病性;攻毒后第3天,B-S9感染小鼠体重出现下降,攻毒后第8天,小鼠体重开始回升;攻毒后第3天和第6天,B-S9感染小鼠的肺脏内均能检测到病毒复制,且攻毒后第3天的小鼠肺脏病毒滴度比攻毒后第6天的小鼠肺脏滴度高132倍。结论 成功搭建B型流感病毒B/Yamagata/16/88反向遗传操作平台,并建立BALB/c小鼠感染模型。目前国内外对B型流感病毒的研究比较少,该反向遗传操作平台的建立为B型流感病毒致病机制和传播机制的研究奠定了基础,同时也为包括B型流感病毒减毒活疫苗在内的新型疫苗的研制开辟了新途径。