钙浓度变化对体外培养人表皮角质细胞增殖的影响

目的:比较不同钙浓度培养的人表皮角质细胞(HEKs)增殖能力的差异,确定体外培养表皮角质细胞的最适钙浓度.方法:根据培养液中CaCl2浓度不同,将HEKs分为无钙培养组和0.1、0.3、0.5、1.0 mmol/L CaCl2培养组.细胞培养3 h后,加钙离子荧光染料Fluo-3-AM,显微镜观察细胞内的荧光强度,以反映细胞内钙离子浓度的变化;细胞培养2 d后加Hochest33258核染液,荧光显微镜下观察细胞生长形态;培养3 d时镜下观察细胞的生长情况,并分别用流式细胞术和MTT法分析细胞的增殖情况.结果:钙培养可使细胞内钙离子浓度增加,表现为细胞内Fluo-3-AM荧光强度增强,且随着CaCl2浓度的增加,荧光强度亦随之增加;在钙浓度为0.3mmol/L时,细胞的增殖指数最高,为(51.98±14.31)%,增殖活性最强;0.1mmol/L组次之;随着钙浓度的增加,细胞的增殖指数下降,增殖活性受到抑制,0.5～1.0mmol/L钙培养组的增殖指数和增殖活性均明显低于无钙培养组(P均<0.01).结论:不同钙浓度培养影响表皮角质细胞的增殖能力,钙浓度为0.3 mmol/L时细胞的增殖能力最强.     

高钙培养促进人表皮角质细胞间的黏附和聚集

目的观察细胞外钙浓度变化对表皮角质细胞黏附聚集的影响，并探讨其可能的调控机制。方法本实验分为两组：低钙培养组（60μmol／L）；高钙（2mmol／L）培养组。培养3d后，镜下观察细胞的黏附和聚集现象；然后利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）的方法测定E-钙调素和P-钙调素mRNA的表达水平；最后借助免疫荧光法检测E-钙调素和P-钙调素蛋白在细胞内的表达和分布。结果高钙培养3d后细胞分层并出现明显的黏附和聚集，E-钙调素也在高钙培养的条件下表达明显增加（P〈0．01），而P-钙调素的表达没有明显的变化。结论高钙培养促进人表皮角质细胞的黏附和聚集，E-钙调素的表达可能在其中发挥重要作用。     

人表皮角质细胞系培养过程中细胞生物学行为和表型的变化

目的:获得较高比例的已分化表皮细胞,为表皮细胞去分化研究奠定基础.方法:采用常规表皮细胞培养方法对人表皮角质细胞系(HEK)进行培养和传代.每一代细胞均通过免疫细胞化学染色和Western blot 方法进行表皮干细胞和表皮细胞相应标志物的检测,包括β1整合素、角蛋白19(K19)、角蛋白10(K10)等指标.结果:第1代HEK呈克隆样生长,表皮干细胞标志物β1整合素、K19均有高表达,而K10的表达为阴性.经过数次传代,细胞克隆形成数目减少,细胞逐渐呈分散分布,K10的表达逐渐增高,而β1整合素、K19的表达呈下降趋势,比例减少.细胞培养至第5～6代时,为其生长的一个转折点,即此时细胞增殖能力开始明显降低,但形态良好,K10表达阳性细胞比例明显增高,而β1整合素、K19表达阳性细胞比例迅速降低.细胞培养至10～11代时,为其生长的第二个转折点,此时细胞几乎丧失增殖能力,数量显著减少,体积变大,核浆比明显减小,完全见不到β1整合素、K19表达阳性细胞,K10染色均为阳性.结论:可以选取适当代数的HEK用于去分化研究,为增加HEK的新用途提供了实验基础.     

单侧膈神经切断对幼猪肺内表皮生长因子及角质细胞生长因子基因表达的影响

目的研究膈神经切断后幼猪肺内表皮生长因子（epidermal growth factor,EGF）mRNA及角质细胞生长因子（keratinocyte growth factor,KGF）mRNA表达的变化及其意义。方法健康雄性幼猪36只,按手术时日龄10、30和50d分为三组,每组12只,再随机分为实验组（膈神经切断,n=6）和对照组（n=6）。实验组于颈部将左侧膈神经切断,对照组仅行左侧膈神经暴露。分别于术后2周处死动物,采用RT-PCR方法对肺组织中EGF及KGF mRNA的表达水平进行检测分析。结果RT-PCR的融解曲线示EGF、KGF和内参基因GAPDH分别在80.0、84.5和89.0℃附近各有一单峰,融解温度均一。单侧膈神经切断术后2周,10d和30d实验组幼猪肺内EGF mRNA相对表达水平分别为3.53±0.36和1.73±0.29,KGF mRNA的相对表达水平为4.71±0.42和2.77±0.29,均较相同日龄对照组（EGF mRNA表达水平4.60±0.41、2.18±0.24和KGF mRNA表达水平6.05±0.42、3.58±0.31）低,比较差异有统计学意义（P〈0.05）;50d实验组幼猪肺内EGF及KGF mRNA的表达水平（0.72±0.15和1.83±0.22）与对照组（0.74±0.18和2.09±0.23）比较差异无统计学意义（P〉0.05）。对照组间比较显示幼猪肺内EGF及KGF mRNA的表达水平差异有统计学意义（P〈0.01）,随幼猪年龄增长肺内EGF及KGF mRNA的表达水平下降。结论单侧膈神经切断将导致术时日龄〈30d幼猪肺内生长因子表达水平的下降,进而影响肺组织的正常发育,提示年龄较小的患儿应慎行膈神经移位术。     

牵拉培养对表皮细胞生长及EGF分泌的影响

目的：研究牵拉培养对表皮细胞生长的影响以及内源性EGF的分泌情况。方法：用酶消化法对表皮细胞进行原代培养，将实验分为二组：实验组和对照组，实验组采用细胞负压牵引装置培养，对照组细胞不受牵拉，连续观察72小时，分别于12、24、36、48、60、72小时，收集细胞培养液，同时于72小时观察表皮细胞在牵拉条件下和非牵拉条件下的生长情况：用ELISA法测定表皮细胞在牵拉条件下和非牵拉条件下分泌EGF的情况。结果：实验组表皮细胞经72小时牵拉后生长良好，而对照组的细胞死亡，实验组牵拉36小时EGF浓度为16．03μg／mL，其他时间点未测到，而非牵拉组各时间点均未测出EGF。结论：牵拉不但可促进表皮细胞的增殖和生长，而且可促进表皮细胞分泌EGF．     

烧伤大鼠创面再上皮化过程中表皮角质形成细胞基底膜相关基因的表达

目的　检测烧伤大鼠创面再上皮化过程中表皮角质形成细胞(KCs)基底膜(BM)相关基因的表达。　方法　24只SD大鼠造成背部45cm2 深Ⅱ度烫伤, 按照基因表达检测时间随机分为A组(伤后3d)、B组(伤后10d)、C组(伤后14d)、D组(创面完成再上皮化后),每组6只。伤后3、10、14d取距创缘1cm处皮肤标本,创面完成再上皮化后取创面中心皮肤标本,分别制备KCs悬液。另取6只SD大鼠背部皮肤作为正常对照组。利用基因芯片技术检测各组大鼠创面再上皮化不同阶段KCsBM相关基因的差异性表达。　结果　伤后3d,KCs层粘连蛋白γ1、整合素β8基因表达上调,基因表达数据与正常对照比值分别为2. 068和2. 200。再上皮化过程中(伤后10、14d)层粘连蛋白受体1、整合素β1基因表达上调,β2、β7表达下调,基因表达数据与正常对照的比值分别为2. 472、2. 658、0. 419和0. 462。Ⅳ胶型原α1、α3基因各组均上调,基因表达数据与正常对照的比值为2. 547和2 036。　结论　创面再上皮化过程中整合素β1、层粘连蛋白γ1、层粘连蛋白受体1、Ⅳ型胶原α1、α3基因表达上调,有利于新生皮肤BM的构建和KCs与BM之间形成稳定的连接。     

纤维连接蛋白调理的人表皮角质细胞粘附、迁移功能

目的观察纤维连接蛋白(FN)对人表皮角质细胞(EKC)在体外培养过程中有无粘附、迁移作用.方法利用不同剂量的FN,对新鲜EKC及体外培养7～10d的EKC进行粘附、迁移功能测定.应用间接免疫荧光染色法,检测α5β1受体在细胞培养前后的表达.结果(1)新鲜EKC在FN调理下的粘附、迁移值明显低于体外培养7～10d的EKC,粘附值分别为(0.9±0.5)%、(37.26±8.34)%(P＜0.01),迁移指数分别为17.5±2.5、48.7±3.2(P＜0.01).(2)培养1d的EKC及组织块体外培养后增生的表皮细胞,α5β1受体的表达染色阳性;培养7d的EKC及组织块增生表皮外周边缘染色呈强阳性;新鲜EKC染色阴性或弱阳性.结论(1)新鲜EKC与培养7～10d的EKC生物学功能间差异有显著性意义.(2)EKC生物学功能活跃的阶段(培养7d)和部位(组织块边缘增生的表皮细胞)α5β1受体表达最强.(3)体外培养能有效地诱导和激活EKC的粘附、迁移功能,使生物学功能相对静止的EKC变成了功能活跃的EKC细胞.     

抗角蛋白14单克隆抗体对无血清培养角质形成细胞增殖的影响

目的：建立一种无血清传代培养人角质形成细胞（KC）的方法,并观察角蛋白14单克隆抗体（anti-K14 mAb）对无血清培养人角质形成细胞体外增殖的影响。方法：应用角质形成细胞无血清培养基（KC-SFM）添加重组表皮生长因子（EGF）和牛垂体浸出液（BPE）传代培养角质形成细胞,培养均至第3代时于培养基中加人不同浓度的anti-K14 mAb,用MTT法观察对角质形成细胞增殖的影响。结果：应用无血清培养基成功地传代培养了角质形成细胞,MTT法结果显示各浓度组对培养的角质形成细胞的增殖有显著抑制作用并有浓度依赖性。结论：建立了一种无血清培养人角质形成细胞的方法a,nti-K14mAb对人角质形成细胞体外的增殖有显著抑制作用。     

双氯灭痛对豚鼠表皮角质形成细胞/黑素细胞比值及前列腺素E2含量影响的实验观察

目的 研究双氯灭痛对豚鼠皮肤前列腺素E2含量变化及自体全厚皮片表皮内角质形成细胞／黑色素细胞(KC／MC)比值与色素沉着的影响。方法 借助放射免疫分析方法动态观察皮片内前列腺素E2(PGE2)含量的变化及双氯灭痛的影响；借助组织学及组织化学方法观察皮片表皮内KC／MC比值变化。结果 在手术对照组，移植早期PGE2含量升高伴随着KC／MC比值的升高；而实验后期KC与MC的比值(KMR)减小。在双氯灭痛组，早期PGE不升反降，KMR减小；相应的实验后期KMR增大，皮片色泽较浅。结论 在移植早期应用双氯灭痛可以减轻炎症反应对表皮黑色素单位的损伤，减弱其增殖反应，从而降低KMR，减轻皮片色素沉着的程度。     

High glucose inhibits human epidermal keratinocyte proliferation for cellular studies on diabetes mellitus

In order to more clarify the delayed wound healing in diabetes mellitus, we cultured the human epidermal keratinocytes in both 6 mM (control group) and 12 mM glucose (high-glucose group) of "complete" MCDB 153 medium. Hyperglycaemia slowed the rate of their proliferation and inhibited their DNA synthesis and the production of total proteins. By 1 month after primary seeding in high-glucose group, the cells ceased their proliferation, whereas the cells in control group grew for more than 40 days. Mean population doublings in high-glucose group was 5.27 (vs. 7.25 in control, P = 0.001), and mean population doubling time during 1 month in high glucose group was 5.43 days (vs. 3.65 days in control, P = 0.02). They indicate that prolonged exposure to high glucose decreases the replicative life span of human epidermal keratinocytes in vitro. Furthermore, analysis of fatty acid contents in membrane phospholipids with thin-layer and gas chromatography showed no difference between the cultured keratinocytes in both conditions. Immunocytochemical staining of glucose transporter 1 shows that 28.1% of cells in high-glucose group were almost twice positive of those in control group (13.2%, P = 0.008). The mechanism of the ill effects of high glucose on epidermal keratinocytes is not so far clear, but it indicates the possibility of any direct effect of hyperglycaemia on glucose metabolism without changing lipid metabolism on cell membrane. The high-glucose group presented in this report can be available as an in vitro valuable study model of skin epidermal condition on diabetes mellitus.     

低氧诱导因子-1的病毒载体制备及感染效果

目的 制备低氧诱导因子(HIF)-1腺病毒载体并评价其对表皮角质细胞的感染效果.方法 Ad/HIF-1质粒经酶切鉴定后,以4μg质粒转染1.2×106个HEK293细胞,2 d后荧光显微镜下观察转染效率.1周后收集细胞及上清并感染HEK293细胞进行病毒扩增,待扩增的细胞及上清量达300 ml时进行病毒纯化及滴度测定.最后用制备的病毒载体感染表皮角质细胞,流式测定其感染效果.结果 Ad/HIF-1质粒酶切鉴定正确;转染或感染HEK293细胞后有绿色荧光蛋白(GFP)表达;获得的腺病毒滴度为1.8×1011PFu/ml.病毒以MOI=50感染表皮细胞,2 d后GFP阳性细胞的比例为97.46%.结论 成功制备了HIF-1腺病毒载体,且感染表皮角质细胞后能得到较高的感染效率,从而为腺病毒介导的基因功能研究提供理论基础.     

Low concentration amino-bisphosphonates stimulate human keratinocyte proliferation and in vitro wound healing

Amino-bisphosphonates (N-BPs) are widely used to treat a great variety of clinical conditions involving altered calcium metabolism, as well as to prevent bone metastases. The use of N-BPs, however, display well-known side effects, including cellular toxicity, mainly at soft tissue and mucosal level, that arise from N-BPs ability to induce cell apoptosis when administered at clinically relevant concentrations. The aim of this study was to evaluate, in an in vitro wound healing model, the effect of N-BPs low concentration (10 nM-10 μM) stimulation on keratinocyte cellular behaviour. Human keratinocytes were treated with neridronate and zoledronate, two N-BPs with different chemical structure and clinical potency, but sharing a common pharmacological target: farnesyl pyrophosphate (FPP) synthase. Surprisingly, at the tested concentrations, both drugs stimulated keratinocytes proliferation, upregulating cytokeratin 5 while downregulating filaggrin expression, and wound healing ability, without any significant effect on matrix metalloproteinase (MMP)-9 activity. The lack of N-BPs effect on MMP-9 activity indicates that wound closure, in our experimental model, is mainly due to an increase in cell proliferation rather than to an increase in cell migration. Therefore, it can be hypothesised that the observed wound healing results could be ascribed to an N-BPs mediated reduction of FPP endogenous levels, thus suggesting new possible clinical applications for these compounds.     

表皮生长因子对大肠癌细胞游离Ca2+和环磷酸酰苷的影响

目的　探讨表皮生长因子 (EGF)对大肠癌LoVo细胞内Ca2 和环磷酸酰苷 (cAMP)的影响。方法　采用激光扫描共聚焦显微镜图像分析技术测定EGF对LoVo细胞Ca2 的影响 ;放射免疫技术测定EGF对LoVo细胞内cAMP的影响。结果　EGF能非剂量依赖性引起LoVo细胞[Ca2 ]i升高 ,40～ 6 0s达到峰值 ,平均升高分别为 (143± 14) %、(147± 15 ) %、(146± 11) % ;加入EGF后 ,LoVo细胞内cAMP快速下降 ,10～ 2 0min降至最低值 ,然后缓慢回升 ,约 90min恢复至基础水平 ,cAMP基础水平平均值为 (48.0 2± 4.6 1)× 10 -8mol/L。结论　EGF可引起LoVo细胞内Ca2 和cAMP代谢失调。     

血管紧张素转化酶抑制剂对表皮干细胞增殖、分化、迁移的影响

目的 观察血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂卡托普利对表皮干细胞(ESCs)增殖、迁移、分化的影响,探讨ACE在维持ESCs生物学功能中的作用.方法 利用差速贴壁法获得10例儿童的ESCs,进行离体培养,检测ACE在ESCs的表达.用XTT法检测不同浓度(1 ×l0-5、1×10-6、l×10-7、1×10-8mol/L) ACEI卡托普利对ESCs增殖的影响;体外创伤模型观察1×10-6mol/L的卡托普利对ESCs 6、12、18、24h各时间段的迁移能力;流式细胞仪检测K10的表达观察1×10-6mol/L的卡托普利对ESCs分化的影响.结果 培养的细胞经β1-整合素和K19免疫荧光双重标记染色,83.55％细胞为双标记阳性细胞,即ESCs.免疫荧光染色和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)结果显示ESCs表达ACE.流式细胞仪定量检测培养的细胞ACE阳性率为74.2％.1×10-6mol/L的卡托普利可明显抑制ESCs的增殖(P＜0.05),且在第5天达到峰值.1×10-6 mol/L的卡托普利可明显抑制细胞的迁移能力(P＜0.05)和克隆能力(P＜0.05).流式细胞仪检测结果表明,l×10-6 mol/L的卡托普利并不影响K10的表达(P＞0.05).结论 ACE通过影响ESCs的增殖,迁移从而影响皮肤的损伤修复和自我更新.     

表皮生长因子与三苯氧胺对兔子宫内膜细胞生长的影响

本实验以兔子宫内膜细胞株为样品进行培养实验，观察雌二醇（Ｅ２）、表皮生长因子（ＥＧＦ）对兔子宫内膜细胞的生长及ＤＮＡ合成的影响。结果表明：单独给予Ｅ２或ＥＧＦ兔子宫内膜细胞的增殖及ＤＮＡ合成没有明显变化，如同时加入上述两种药物则有明显的加强作用，然而这种作用又能被三苯氧胺（Ｔａｍｏｘｉｆｅｎ）所阻断。提示三苯氧胺能翻转Ｅ２、ＥＧＦ在刺激细胞的增殖过程中的协同作用。     

Effects of keratinocyte growth factor on skin epithelial differentiation of human amnion epithelial cells

The aim of the present study was to determine the effects of KGF on the differentiation of cultured human amnion epithelial cells (HAECs) towards skin keratinocyte. HAECs at passage 1 were cultured in medium HAM's F12: Dulbecco's Modified Eagles Medium (1:1) supplemented with different concentrations of KGF (0, 5, 10, 20, 30 and 50 ng/ml KGF). Dose–response of KGF on HAECs was determined by morphological assessment; growth kinetic evaluation; immunocytochemical analysis; stemness and epithelial gene expression quantification with two step real time RT-PCR. KGF promotes the proliferation of HAECs with maximal effect observed at 10 ng/ml KGF. However, KGF decreased the stemness genes expression: Oct-3/4, Sox-2, Nanog3, Rex-1, FGF-4, FZD-9 and BST-1. KGF also down-regulates epithelial genes expression: CK3, CK18, CK19, Integrin-β1, p63 and involucrin in cultured HAECs. No significant difference on the gene expression was detected for each Nestin, ABCG-2, CK1 and CK14 in KGF-treated HAECs. Immunocytochemical analysis for both control and KGF-treated HAECs demonstrated positive staining against CK14 and CK18 but negative staining against involucrin. The results suggested that KGF stimulates an early differentiation of HAECs towards epidermal cells. Differentiation of KGF-treated HAECs to corneal lineage is unfavourable. Therefore, further studies are needed to elucidate the roles of KGF in the differentiation of HAECs towards skin keratinocytes.     

压应力对表皮干细胞增殖与分化的影响

目的：初步观察压应力对表皮干细胞增殖分化的影响。方法：以大鼠的皮肤扩张动物模型为在体观察对象;4、8、12kPa的压应力予体外培养的大鼠表皮干细胞进行间歇加压（每天3次,每次2h,共1周）为离体观察对象。利用免疫组化染色、免疫荧光双染、细胞克隆形成率等技术与方法检测β1整合素、角蛋白19（K19）、角蛋白14（K14）、角蛋白10（K10）、α6整合素、CD71的表达特征,以及压应力对表皮千细胞增殖分化的影响。结果：组织学观察显示,扩张皮肤的表皮层明显增厚;表皮层的β1整合素、K19、K14阳性细胞数量于扩张的第5天开始增多,至15d达峰值后下降,扩张完成后20d趋于正常;棘层和颗粒层不仅可见上述阳性细胞,且出现α6整合素^bri／CD71^dim细胞的表达。体外培养的表皮干细胞,8kPa、12kPa的压应力作用1周后,细胞克隆形成率分别为48．67％、49．36％,明显高于4kPa组（23．17％）与对照组（23．00％）,8kPa、12kPa组可见K10阳性细胞表达。结论：表皮干细胞具有压应力敏感性,适当的压应力可诱导表皮干细胞增殖与分化。