壳聚糖-负载增强型绿色荧光蛋白基因的质粒DNA纳米微球体外转染软骨细胞的能力及影响因素

目的 探讨壳聚糖介导体外基因转染软骨细胞的能力及不同条件下基因转染率的变化,以筛选最佳转染条件.方法 将壳聚糖与负载增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒DNA(pDNA)以复凝聚法制成壳聚糖/pEGFP纳米微球,用扫描电镜检测纳米微球的形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位及分散度.以脂质体为对照,观察对软骨细胞的毒性.体外转染兔关节软骨细胞,以裸pDNA及脂质体为对照,流式细胞仪及荧光显微镜检测基因转染率.检测在不同pH值、N/P比值及pDNA剂量下壳聚糖/pEGFP纳米微球介导对软骨细胞的转染率变化.结果 壳聚糖/pEGFP纳米微球呈球形,平均粒径为(141.5±26.7)nm,表面Zeta电位平均为(17.8±3.9)mV,分散度平均为0.227±0.025.细胞毒性试验显示壳聚糖/pEGFP纳米微球与软骨细胞相容性良好,与脂质体比较差异有统计学意义(P＜0.05).体外转染实验证实壳聚糖/pEGFP纳米微球能转染软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,在pH值为7.0、N/P为5、pDNA浓度为4.0μg/mL时基因转染率最高,48 h转染率达10.9％±0.2％.结论 复凝聚法制备的壳聚糖/pEGFP纳米微球是一种有效的非病毒基因转染系统,细胞毒性小,对软骨细胞有一定基因转染能力,其转染率与pH值、N/P比值及pDNA剂量等密切相关,pH值为7.0、N/P为5、pDNA浓度为4.0 μg/mL是其最佳转染条件.     

透明质酸修饰壳聚糖/pDNA纳米微球的制备及体外转染软骨细胞

目的 以透明质酸(HA)修饰基因载体壳聚糖(CS)纳米微球,制作一种新型的HA/CS/pDNA基因转染系统,观察其结构特征及体外对软骨细胞的转染能力.方法 将不同比例的HA和CS与负载增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)的质粒DNA(pDNA)以复凝聚法制成纳米微球,以扫描电镜检测纳米微球形态,Zeta电位粒度分析仪测定其粒径、表面电位;凝胶电泳阻滞实验观察CS和pDNA的结合力;体外转染兔关节软骨细胞,以流式细胞仪及荧光显微镜检测转染效率.结果 HA/CS/pDNA纳米微球多呈球形,粒径为(223±51)nm,表面Zeta电位为(17.4±6.1)mV,可有效保护pDNA免受 DNaseⅠ的降解.体外转染实验证明HA/CS/pDNA纳米微球能介导pEGFP转染软骨细胞并在细胞内表达绿色荧光蛋白,转染率达(15.450±0.404)%,比裸pDNA组和CS/pDNA组有更高的转染效率(P<0.05).结论 复凝聚法制备的HA/CS/pDNA纳米微球是一种有效的新型非病毒基因转染系统,对软骨细胞有着潜在的靶向基因转染能力.

Abstract：

Objective To prepare hyaluronic acid (HA)-modified chitosan (CS)/pDNA (HA/CS/pDNA) nanoparticles as novel gene vectors, study their structural characteristics and gene transfection efficiency for chondrocytes in vitro in rabbits. Methods The HA/CS/pDNA nanoparticles were prepared by a DNA (pDNA), which load enhanced green fluorescent protein (EGFP) gene. The morphology of the nanoparticles was observed under the transmission electron microscopy. The sizes and zeta-potentials of the nanoparticles were measured by a Marven-nano laser diffractometer. The binding of pDNA was evaluated by agarose gel electrophoresis analysis. The gene transfection experiments in vitro were performed with the chondrocytes of rabbits. The gene transfection efficiency was measured by using flow cytometry and under the fluorescence microscopy. Results HA/CS/pDNA nanoparticles were mainly spherical, with an average size of (223±51) nm, and zeta-potential of (17.4±6.1) mV. The agarose gel electrophoresis analysis confirmed that they could effectively protect pDNA from degradation against DNase I. Gene transfection in vitro proved that HA/CS/pDNA nanoparticles could be efficiently transfected into chondrocytes of rabbits, the expression of green fluorescent proteins was observed under the fluorescent microscopy, and the transfection efficiency reached as high as (15.450±0.404)%, significantly higher than that of the naked pDNA or the CS/pDNA nanoparticles (P<0.05). Conclusion HA/CS/pDNA nanoparticles were an effective novel non-viral gene transfer vector, which possessed the potential targeting transfection ability on chondrocytes.     

壳聚糖酶基因在软骨细胞中的表达及对壳聚糖介导基因转染的影响

[目的]探讨携带壳聚糖酶(CSN)基因的重组慢病毒感染软骨细胞后影响CSN活性的因素,及CSN在壳聚糖(CS)/DNA纳米粒介导基因转染软骨细胞中的作用。[方法]构建携带CSN和红色荧光带白(RFP)基因的重组慢病毒(LV-CSN)并感染兔关节软骨细胞,流式细胞仪及荧光显微镜检测其感染率;二硝基水杨酸比色法(DNS)检测对CSN活性的影响因素;以CS/DNA纳米粒介导体外基因转染软骨细胞,检测CSN对CS/DNA纳米粒介导基因转染软骨细胞的作用。[结果]带RFP基因的LV-CSN感染软骨细胞后48 h和第7 d,RFP表达率分别为(91.40±0.98)%和(91.67±1.00)%,二者差异无统计学意义(P=0.583)。p H值、温度及铜离子浓度对CSN的活性有明显影响。LV-CSN感染软骨细胞后CS/DNA组的基因转染效率显著高于裸p DNA组和CS/DNA组(P<0.05),但铜离子可以拮抗这种作用。[结论]在一定时间内LV-CSN感染软骨细胞后可稳定表达CSN,CSN的活性受p H值、温度及铜离子浓度的影响;CSN可提高CS/DNA对软骨细胞的基因转染效率,铜离子则可拮抗这种作用。     

核定位信号肽偶联核激酶底物短肽修饰壳聚糖介导微小RNA-140对兔关节软骨细胞作用的研究

目的探讨核定位信号肽偶联核激酶底物短肽(nucleus localization signal linked nucleic kinase substrate short peptide,NNS)修饰壳聚糖(chitosan,CS)(~(NNS)CS),介导人微小RNA-140(micro RNA-140,miR-140)基因转染,对体外培养的兔关节软骨细胞的作用。方法将重组质粒GV268-miR-140和空质粒GV268分别与~(NNS)CS复合形成~(NNS)CS/pDNA纳米复合物。取新生新西兰大耳白兔膝关节软骨,采用胰蛋白酶和胶原酶联合消化法分离培养原代软骨细胞。取第2代软骨细胞分为3组:正常细胞对照组(A组)、~(NNS)CS/GV268空质粒转染组(B组)、~(NNS)CS/GV268-miR-140转染组(C组),B、C组细胞分别以~(NNS)CS/GV268及~(NNS)CS/GV268-miR-140纳米复合物瞬时转染。转染后,实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,RT-qPCR)检测外源mi R-140的表达;AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法及MTT法分别检测外源miR-140对软骨细胞凋亡及增殖活力的影响;RT-qPCR检测软骨细胞中Sox9、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)、组蛋白去乙酰化酶4(histone deacetylase 4,Hdac4)基因表达。结果 RT-qPCR检测示,C组外源miR-140表达水平较A、B组明显上调(P0.05)。与A、B组比较,C组软骨细胞凋亡率明显降低,细胞增殖活力明显增加,细胞内Sox9、Aggrecan基因相对表达量明显上调、Hdac4基因相对表达量明显下调(P0.05);A、B组间以上指标比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论 ~(NNS)CS可携带外源基因进入软骨细胞并高效表达,高表达的miR-140能提高体外培养软骨细胞的生物活性,为其用于治疗软骨损伤性疾病提供了实验依据。     

慢病毒介导绿色荧光蛋白基因转染大鼠软骨细胞表达的研究

[目的]构建携带绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein,GFP)的慢病毒载体系统,通过感染大鼠软骨细胞,观察其感染能力及GFP的表达情况.[方法]以载体质粒pLentiLox 3.7、包装质粒pRSV-REV、pMDL g/p RRE及包膜质粒VSV-G共转染293T细胞制备慢病毒.分离、培养大鼠关节软骨细胞,将制备好的慢病毒颗粒感染软骨细胞,在荧光显微镜下观察报告基因GFP的表达情况.[结果]重组慢病毒载体系统转染293T细胞96 h后可观测到较强的绿色荧光蛋白的表达,收集上清测得病毒滴度约为3.0×103ifu/μl,并且在80%大鼠软骨细胞中观察到GFP的表达.[结论]成功构建了携带GFP的重组慢病毒载体系统,对大鼠关节软骨细胞转染效果良好,为将来结合RNA干扰技术对软骨细胞进行基因改造提供了基础.     

增强绿色荧光蛋白标记比较腺病毒、腺相关病毒体外转染兔软骨细胞的效果

目的 通过增强绿色荧光蛋白(eGFP)标记,比较腺病毒(Ad)、腺相关病毒(AAV)对体外培养软骨细胞的转染效果.方法 体外培养正常3月龄新西兰兔关节软骨细胞,以rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP分别转染原代关节软骨细胞,计算最佳传染复数.之后以最佳传染复数的病毒重组体转染软骨细胞,分别应用流式细胞仪检测绘制转染率的时间一反应曲线,倒置荧光显微镜下观察转染后细胞的大体形态、绿色荧光的表达情况并应用荧光定量PCR检测转染前后软骨细胞Ⅱ型胶原mRNA表达水平的变化.结果 rAd5-eGFP、rAAV2-eGFP的最佳传染复数分别为1×103 vp/cell和1×105 vg/cell.分别应用最佳传染复数体外转染原代培养的软骨细胞后,rAd5-eGFP在转染后1～2 d荧光表达即可达到高峰,但之后迅速衰减,在转染后第28天基本检测不到荧光表达.rAAV2-eGFP在转染第7天荧光表达达高峰,随之缓慢衰减,在转染后第56天仍可检测到绿色荧光表达.荧光定量PCR检测显示,rAd5-eGFP在转染软骨细胞后,软骨细胞合成Ⅱ型胶原mRNA的水平明显下降,而rAAV2-eGFP则影响不显著.结论 Ad转染体外培养的关节软骨细胞后,目的基因的表达迅速,但维持时间短,对软骨细胞表型的影响较明显;AAV转染软骨细胞后,目的基因的表达缓慢,但维持时间长,且对软骨细胞表型的影响较小.AAV更适于作为软骨细胞的体外转染载体.     

壳聚糖季铵盐/累托石纳米粒作为基因载体的转染活性

目的 观察壳聚糖季铵盐/累托石纳米粒载体的体内外转染活性,探讨其作为基因治疗载体的可行性.方法 采用溶液插层法合成壳聚糖季铵盐/累托石复合物(QC/REC)纳米粒,包裹绿色荧光蛋向(GFP)基因质粒DNA.透射电镜、凝胶电泳和吸附实验研究其包裹效率;转染人肝癌细胞HCCLM6,测定其转染率.通过裸裸鼠胃肠道及肌肉注射途径给药,研究其体内转染效果及安全性.结果 QC/REC可有效包裹质粒DNA,形成纳米粒的直径小于100 nm.壳聚糖季铵盐、累托石、质粒DNA质量比为1:2:1.5时,120 h的转染率近100%.体内实验中,QC/REC-DNA纳米粒胃肠道和肌肉给药,均可见到明显荧光表达,主要在胃和十二指肠表达,裸鼠未出现明显毒性反应.结论 QC/REC纳米粒有较好的转染活性和安全性,有望作为基因治疗的非病毒载体.     

壳聚糖微球介导人IL-1Ra与TGF-β1基因转染兔软骨细胞的研究

目的 探讨壳聚糖微球介导人IL-1Ra与TGF-β1基因转染兔软骨细胞.方法 制备壳聚糖微球介导IL-1Ra质粒与TGF-β1质粒转染系统,检测其载药、体外释药、降解,转染体外培养的兔膝软骨细胞,荧光显微镜、荧光定量PCR、MTT检测.结果 壳聚糖-IL-1Ra DNA和壳聚糖-TGF-β1 DNA微球平均径粒(2.8±0.2)μm和(2.6±0.1)μm,包封率(88.3±4.1)%和(87.2±2.6)%;缓释分3个阶段.荧光显微镜观察、荧光定量PCR证实软骨细胞转染基因得到30 d表达.MTT提示转染促进软骨细胞增殖.结论 壳聚糖微球介导IL-1Ra与TGF-β1基因转染软骨细胞可获得较长期目的基因表达,可促进软骨细胞增殖,为用于基因治疗软骨退变和促进软骨修复提供基础.     

超声微泡介导白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因体外转染兔软骨细胞的研究

目的 观察超声介导下携白细胞介素-1受体拮抗蛋白基因(IL-1Ra)的微泡体外转染兔软骨细胞的效率和表达.方法 体外分离培养兔软骨细胞,分为单纯质粒组(P)、微泡+质粒组(M+P)、超声+质粒组(U+P)和超声+微泡+质粒组(U+M+P),照射后48 h,荧光显微镜和流式细胞术检测转染效率,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测IL-1Ra基因的mRNA和蛋白表达,台盼兰染色检测细胞生存率.结果 U+M+P组转染效率较其他三组明显提高,为(11.6±1.0)%;且eGFP-C1-IL-1Ra质粒经超声微泡介导转染后可表达IL-1Ra的mRNA和蛋白.结论 超声微泡可介导IL-1Ra基因在兔软骨细胞内的转染和表达,可望成为软骨损伤基因治疗的新方法.     

全营养液促脂质体介导质粒DNA转染结肠直肠癌细胞的实验研究

目的　探讨全营养液 (TNA)促进脂质体介导质粒DNA转染结直肠癌细胞的作用。方法　采用细胞培养方法 ,利用绿色荧光蛋白基因做报告基因 ,配制不同转染液 :脂质体加pEGFP N1、TNA加脂质体加pEGFP N1、TNA加pEGFP N1、单纯脂质体、单纯TNA ,分别处理人结肠癌细胞LoVo、人直肠癌细胞HR 8348,检测癌细胞中绿色荧光蛋白的表达。　结果　未加pEGFP N1质粒DNA的单纯脂质体和单纯TNA处理的细胞不表达绿色荧光蛋白。TNA加脂质体加pEGFP N1对LoVo、HR 8348细胞的转染效率分别为 33%、38% ;脂质体加pEGFP N1组的转染效率为 2 2 %、2 4% ;TNA加pEGFP N1组的转染效率均为 1%。TNA加脂质体加pEGFP N1组转染效率高于其他转染组 (P <0 0 1)。质粒DNA对TNA溶液的稳定性无显著影响。　结论　TNA可促进脂质体介导质粒DNA转染结直肠癌细胞 ,将营养支持与基因治疗相结合 ,有望提高对肿瘤患者支持治疗效果。     

壳聚糖纳米粒作为消化道给药基因治疗载体的研究

目的 观察壳聚糖纳米粒载体的体内外基因转染活性,寻找最佳转染条件.方法 以编码GFP的质粒DNA作报告基因,3种不同壳聚糖[季铵化壳聚糖(TMO-60%),壳聚糖(43×103～45×103,87%),壳聚糖(230×103,90%)]分别与质粒DNA混合,用复凝聚法制备壳聚糖/DNA复合物.检测纳米粒形态和直径,壳聚糖对DNA包裹力,体外转染效率,纳米粒包裹质粒饲喂裸鼠后报告基因在消化道黏膜的表达率.结果 壳聚糖纳米粒能高效稳定包裹质粒DNA;TMO-60%与DNA的比例为3.2∶ 1.0时,体外转染效率最高,达28.9%;TMO-60%/质粒DNA复合物灌胃后,全胃肠道均有GFP表达,尤其在胃和小肠上段最强.结论 季铵化壳聚糖纳米粒在体内、体外均有较高的转染活性,是基因治疗的可取载体.     

巯基烷基化壳聚糖介导共表达质粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4体外转染的研究

目的 以新型巯基烷基化壳聚糖(TACS)为载体介导重组共表达质粒pIRES-hVEGFl2lcDNA/hBMP4体外转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),探讨TACS用作骨组织工程中基因载体的可行性.方法 复凝聚法制备TACS-基因纳米粒,检测其形态和粒径;全骨髓培养法分离、培养大鼠MSCs;将纳米粒转染第3代大鼠MSCs,并设壳聚糖组、脂质体组及裸质粒组分别为实验对照、阳性对照及阴性对照,噻唑蓝(MTT)比色法测定TACS的细胞毒性.分别于转染后3、4 d提取MSCs的总RNA、总蛋白,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测目的 基因的表达.结果 TACS能有效包裹和保护共表达质粒,TACS组细胞存活率(73.18±6.56)%,明显高于脂质体组(45.92±4.93)%(P<0.01).除阴性对照组外,RT-PCR和Western blot均检测到转染后MSCs中hVEGF121及hBMP4的表达,TACS组目的 蛋白表达量低于脂质体组(P<0.05),但明显高于壳聚糖组(P<0.01).结论 共表达质粒在TACS介导下成功转染大鼠MSCs并获得表达.TACS细胞毒性小,且较未改性壳聚糖转染效率明显提高.     

超声微泡造影剂介导基因转染的研究进展

基因治疗疾病的有效性主要取决于基因转染率,基因转染载体包括病毒载体和非病毒载体。超声微泡造影剂为一种新型非病毒载体,介导基因转染具有安全、靶向、目的基因转染率高等优点,本文对近年来超声微泡造影剂介导基因转染的研究进展进行综述。     

Water-soluble lipopolymer as a gene carrier to corpus cavernosum

Adenovirus or naked plasmid DNA (pDNA) has been used to deliver the therapeutic gene into corpus cavernosum. However, the potential risks of viral vector and inefficiency of naked pDNA have limited their clinical application. In this study, water-soluble lipopolymer (WSLP) was evaluated as a gene carrier to corpus cavernosum. The WSLP/pDNA complex was transfected to smooth muscle cells in vitro. WSLP had high transfection efficiency, which was comparable to poly(ethylenimine) (PEI). In addition, WSLP had much less cytotoxicity than PEI, suggesting that WSLP is a safer carrier than PEI. To evaluate the transfection efficiency to corpus cavernosum, the WSLP/pDNA complex was injected into the rat corpus cavernosum. As a result, the WSLP/pDNA complex showed higher transfection efficiency than naked pDNA. In addition, the gene expression was dependent upon the dose of the complex. The results suggest that WSLP may be useful for gene therapy of erectile dysfunction.     

Hyaluronan does not affect cytokine and chemokine expression in osteoarthritic chondrocytes and synoviocytes

OBJECTIVE: Many studies have evidenced the clinical efficacy of hyaluronan (HA) in the treatment of osteoarthritis (OA). However, human and animal studies have described proinflammatory effects of HA on cells not involved in OA. We therefore investigated whether different molecular weight HA preparations can affect proinflammatory cytokine (IL1beta and TNFalpha) or chemokine (IL8, MCP-1 and RANTES) expression in human chondrocytes and synoviocytes isolated from OA patients. DESIGN: Human chondrocytes and synoviocytes were cultured in vitro in the presence or absence of three different purified HA pharmaceutical preparations (1x10(6) Kd, 5x10(5) Kd and 6.5x10(4) Kd) and assessed for the production of proinflammatory cytokines and chemokines and their mRNA expression. RESULTS: basal conditions, both chondrocytes and synoviocytes produce only MCP-1 and IL8, along with low quantities of IL1beta and TNFalpha, but not RANTES. IL8 production was generally about 100 times higher in chondrocytes than in synoviocytes, while MCP-1 was roughly twice as high in synoviocytes than in chondrocytes. At the mRNA level, expression of IL1beta, TNFalpha, IL8, MCP-1 and RANTES did not change in the presence of the three HA preparations either in synoviocytes or in chondrocytes with respect to basal condition. None of the three different HA preparations significantly affected production of IL8 or MCP-1. CONCLUSIONS: These data demonstrate that preparations of HA of the same origin but with different MWs do not induce proinflammatory cytokines and chemokines expressed by chondrocytes and synoviocytes that are either directly or indirectly involved in OA progression.