基因芯片技术在结核耐药基因检测中的应用

目的:应用DNA芯片杂交技术快速检测临床分离株中结核分枝杆菌对利福平(RifampicinRFP)和异烟肼(isoniazide INH)的3个耐药相关基因rpoB、katG、inhA基因,并评价其临床应用价值。方法:采用基因芯片技术对我院2010年10月～2011年4月门诊或住院患者的体液标本经培养、分离和鉴定得到的34株结核分枝杆菌样本进行耐药相关基因检测,并将结果与绝对浓度法药敏试验结果进行比较。结果:34株样本中,利福平rpoB基因有7株突变,总突变率为20.6%,其中6株为531(C-T)位点突变,1株526(C-T)位点突变。与药敏试验的符合率为88.2%。异烟肼基因突变有10株,总突变率为29.4%,其中7株为KatG 315(G-C)位点突变,1株为katG 315(G-A)位点突变,2株为inhA-15(C-T)位点突变。与药敏试验的符合率为85.3%。利福平的7株耐药株中,基因芯片检测5株为突变型,突变率为71.4%.,在利福平的27株敏感株中,基因芯片检测2株为突变型,突变率为7.4%。在异烟肼的9株耐药株中,基因芯片检测7株为突变型,突变率为77.8%,在异烟肼的25株敏感株中,基因芯片检测3株为突变型,突变率为12%。耐药基因检测灵敏度和特异度分别为利福平71.4%和92.6%,异烟肼77.8%和88%。结论:用基因芯片技术检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性具有较高的特异性和敏感性,快速准确,可以应用于结核分枝杆菌耐药性的检测。     

应用DNA芯片法检测耐多药结核分枝杆菌的研究

目的应用DNA芯片技术快速检测耐多药结核菌的常见突变位点,初步评价其临床应用价值。方法以结核分枝杆菌标准株H37RV为对照,应用基因芯片技术、聚合酶链反应-单链构象多态性技术、聚合酶链反应-直接测序技术检测46株耐多药结核分枝杆菌临床分离株katG、rpoB基因。结果 46例耐多药菌株中,应用基因芯片检测出katG基因突变28株,检出率为60.9%(28/46);检测出rpoB基因突变37株,检出率为80.4%(37/46);同时检测出二者突变共25株,检出率为54.3%(25/46)。结论基因芯片技术操作简单、检测快速,对异烟肼、利福平耐药基因检出率较高,可作为临床耐药检测的辅助手段。     

反向膜杂交技术检测结核分枝杆菌耐药株的临床价值研究

目的评价反向膜杂交技术对于肺结核病患者的结核分枝杆菌耐药基因检测的临床应用价值。方法利用反向膜杂交技术检测了40株耐药结核分枝杆菌培养分离株、10株非结核分枝杆菌培养分离株、240例肺结核患者痰标本的rpoB、katG,、inhA突变基因。240例痰标本同时进行结核菌培养。106株膜芯片检测阳性样本测序验证。结果特异性方面：膜芯片检测40株结核分枝杆菌培养分离株,均为阳性;10株非结核分枝杆菌培养分离株,均为阴性。灵敏度方面：膜芯片检测240例临床痰标本中,66例结核分枝杆菌阳性,占27.5%。耐药基因准确性方面：106例膜芯片检测阳性的样本进行测序验证,两者结果完全一致。结论反向膜杂交技术可快速检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药突变基因,与常规结核分枝杆菌培养、测序检测耐药基因的结果相符,可应用于临床。     

微流芯片技术在耐药株结核杆菌检测中的应用

目的：探讨微流芯片技术检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变的可行性。方法：根据rpoB基因最为常见的三种突变形式(531TCG→TTG，526CAC→TAC，516GAC→GTC)设计引物，用于微流芯片检测结核分枝杆菌利福平耐药性，同时与常规药敏试验和DNA测序结果进行比较。结果：引物比例1：5，杂交温度52℃，杂交时间10min为最佳条件。在20株常规药敏试验为利福平敏感株中，微流芯片测出2株耐药株，并经DNA测序证实；而28株药敏试验为利福平耐药株中，1株微流芯片测定为敏感株，DNA测序证实为513位CAA→CTA突变。该法与常规药敏试验和DNA测序的总符合率分别为93.8％（45/48）和97.9％（47/48）。结论：微流芯片技术快速、灵敏、准确，可用于结核分枝杆菌利福平耐药性的快速检测。     

SARS冠状病毒检测60 mer寡核苷酸基因芯片的设计及应用

目的设计并应用60 mer寡核苷酸基因芯片实现对SARS冠状病毒的检测.方法根据寡核苷酸基因芯片的设计原则设计出30条60 mer的寡核苷酸片段,覆盖SARS冠状病毒(以TOR2株为参考序列,GENEBANK索取号:AY274119)全基因组,点样制备成12×12的寡核苷酸基因芯片,将临床诊断SARS患者痰液标本抽提病毒RNA,采用限制性显示技术进行标记,将标记好的样品与芯片杂交,洗脱,扫描.初步探索寡核苷酸芯片诊断SARS冠状病毒的敏感性及特异性,并对芯片做进一步的优化.结果来自SARS患者样品与芯片上的多个SARS探针杂交,出现了明显的荧光信号;阴性和空白对照探针上没有杂交信号,而对照样品仅与一个SARS探针有杂交.结论采用60 mer寡核苷酸基因芯片可以从基因水平实现对SARS冠状病毒多段序列的平行检测,对于提高检出率有一定意义,此外,尚可用于监测在发病过程的各个阶段中病毒基因的活动状况.     

基因芯片技术在结核分枝杆菌对利福平敏感性检测中的临床价值

目的 探讨基因芯片技术在结核分枝杆菌(MTB)对利福平敏感性检测中的临床价值.方法 同时采用罗氏固体培养法及基因芯片技术对2015年7月至2016年2月就诊于常州市第三人民医院的76例疑似耐多药结核涂阳患者的痰标本进行MTB对利福平的敏感性检测,以罗氏固体培养法为金标准,对基因芯片技术的检测效果进行评价.结果 76例标本中,经罗氏固体培养法常规培养及药敏试验初步鉴别,12例为非结核分枝杆菌,MTB标本共64例;经基因芯片技术检测,其中野生型54例,突变株10例,突变率为15.63%(10/64),突变株中rpoB526突变5例、rpoB531突变2例、rpoB511突变、rpoB516突变及rpoB511、rpoB516两者联合突变各1例.以罗氏固体培养法的药敏结果为金标准,基因芯片法药敏检测的准确率为98.44%,敏感度为98.18%,特异度为100.00%,阳性预测值为100.00%,阴性预测值为90.00%.结论 采用基因芯片技术检测MTB对利福平的敏感性具有快速、灵敏、准确的特点.     

线性探针技术在海南省结核病诊断及耐药性检测中的应用

目的 探讨线性探针技术在海南省结核病诊断及耐药性检测中临床应用。方法 分别采用结核菌涂片、罗氏培养法、比例法药敏及线性探针技术对海南省疑似结核病患者痰液标本进行检测,并对检测结核分枝杆菌、耐药性及耐药突变特点进行分析。结果 线性探针技术检测结核分枝杆菌阳性率（58.7%）明显高于结核菌涂片（40.2%）和罗氏培养（53.8%）,线性探针法与两种传统方法比较差异有统计学意义（P<0.05）;以比例法药敏为金标准,线性探针法对结核分枝杆菌耐利福平、异烟肼和耐多药结核分枝杆菌检测的特异性为89.27%、94.95%和91.45%,敏感性为94.38%、75.00%和75.68%,阴性预测值为94.62%、80.34%和5.60%,阳性预测值为85.71%、93.32%和84.85%,符合率为90.05%、85.34%和85.34%,线性探针技术与比例法药敏检测结核分枝杆菌利福平耐药性效果比较差异无统计学意义,且具有较好一致性,检测异烟肼耐药性差异有统计学意义,且两种方法之间一致性一般,检测耐多药结核分枝杆菌两种方法差异无统计学意义,但两种方法之间一致性一般;利福平耐药基因突变类型主要是 rpoB H531L,占57.14%,异烟肼耐药基因突变类型主要是katG S315T1,占91.89%,耐多药结核分枝杆菌耐药基因突变类型主要为rpoB S531L+KatG S315T1,占56.06%。结论 线性探针技术可快速准确地从海南省疑似肺结核临床标本鉴定出结核分枝杆菌及耐多药结核分枝杆菌,并可直接快速检测临床标本耐药性从而指导临床用药。     

应用基因芯片技术检测耐利福平结核分枝杆菌基因型

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，用TAMRA标记的引物扩增结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的片断，与DNA芯片杂交，同时以PCR-SSCP和DNA测序法为对照。结果240株结核分枝杆菌临床分离株中，55株全敏感株和66株耐其他药物的利福平敏感株的PCK—SSCP和DNA芯片杂交结果与结核分枝杆菌标准株完全相同；119株耐RFP临床分离株中DNA芯片杂交有117株检测到rpoB基因突变，其中111株单位点突变，78株为531住密码子TCG→TTG（Ser→Leu）、TCG→TGG（Ser→Trp）和TCG→TAC（Ser→Tyr）突变；24株为526位蓉码子CAC→TAC（His→Tyr）、CAC→GAC（His→Asp）、CAC→CCC（His→Pr0）、CAC→CTC（His→Leu）和CAC→CGC（His→A职）突变；4株为516住客码子GAC→GTC（Asp→Val）和GAC→GGC（Asp→Gly）突变；3株为533位密码子CTG→CCG（Leu→Pro）突变；1株为511位密码子CTG→CCG（Leu→Pro）突变；1株为513位密码子CAA→AAA（Gln→Lys）突变；6株为双位点突变，其中3株511和516位联合突变，2株533和515住联合突变，1株517位密码子CAG→CAC（Gln→His）和518位密码子AAC→GAC（Asn→Asp）联合突变。DNA测序结果与DNA芯片杂交结果完全一致。1株516位GAC—TAC（Asp→Tyr）突变的分离株及1株516位GAC—TAC（Ssp→Tyr）和518住AAC—CAC（Asn→His）联合突变的分离株DNA芯片检测阴性，是因为芯片上无相应的探针。结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变。可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

结核分支杆菌异烟肼耐药基因的杂交检测

目的:探讨耐异烟肼结核分支杆菌的编码基因KatG和inhA基因的扩增以及突变情况.方法:采用PCR扩增技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因扩增;利用寡核苷酸探针反相斑点杂交技术对25株敏感株、35株耐药株及25例临床结核病人痰标本进行基因突变检测.结果:25株敏感株、35株耐药株KatG和inhA基因扩增均阳性;25例临床结核病人痰标本中KatG基因扩增阳性率为80%,inhA基因扩增阳性率为68%.结论:耐异烟肼菌株的基因突变率明显高于药物敏感株;PCR-寡核苷酸探针反相斑点杂交技术以其简便、快速、灵敏的特性能够为临床检测结核分支杆菌对异烟肼的耐药性提供初步依据.     

PCR-SSCP方法用于痰标本中结核分支杆菌耐药基因的检测

目的 探讨采用直接检测结核病人痰标本中rpoB基因和KatG基因突变。评价该方法检测结核分支杆菌对利福平(RFP)和异烟肼(INH)的耐药性。方法 用PCR-SSCP技术分析对35例耐INH(或含耐异烟肼)，63例耐RFP(或含耐RFP)的肺结核病人痰标本和20例非结核性肺部疾病组痰标本进行rpoB和KatG基因突变的检测。结果 以结核分支杆菌H37RV为对照，63例耐RFP痰标本中57例PCR扩增阳性，其中46例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，rpoB突变率为65．2％。35例耐INH肺结核病人痰标本有20例扩增阳性，15例SSCP图谱与H37RV标准株有差异，突变率为42．8％。20例非结核病人痰标本rpoB基因和KatG基因扩增均为阴性。结论 PCR-SSCP技术有望成为结核分支杆菌耐药性检测的重要方法之一。     

结核分枝杆菌耐药基因rpoB.katG.inhA突变快速检测方法研究

目的 通过PCR及芯片杂交技术平台,建立临床样品中结核分枝杆菌及耐药基因突变的快速诊断新方法.方法 根据结核分支杆菌标准株H37Rv序列,我们设计了覆盖rpoB基因81个碱基高变区的5个正常探针和6个可以探测特定突变类型的突变探针,制作膜芯片,并检测临床样品中结核杆菌的基突变情况,以此来判断耐药结果.结果 18个利福平培养耐药中的15个样品都在rpoB基因上检出有突变,利福平耐药突变检出率为83.0%（18/15）;25个利福平敏感样品rpoB基因上都未检出突变.20个异烟肼培养耐药的样品中有16个在katG或inhA基因上检出有突变,异烟肼耐药突变检出率为80.0%（16/20）;25个异烟肼敏感样品katG或inhA基因上都未检出突变.结论 用膜芯片检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼的耐药性,具有较高的特异性和敏感性,可用于临床结核杆菌耐药性检测.并具有快速、简便、敏感的特点.     

Rapid Detection of rpoB Gene Mutations in Rif-resistant M.tuberculosis Isolates by Obligonucleotide Microarray

Objective To detect the specific mutations in rpoB gene of Mycobacterium tuberculosis by oligonucleotide microarray.Methods Four wild-type and 8 mutant probes were used to detect rifampin resistant strains.Target DNA of M.tuberculosis was amplified by PCR,hybridized and scanned.Direct sequencing was performed to verify the results of oligonuclcotide microarray.Results of the 102 rifampin-resistant strains 98 (96.1%) had mutations in the rpoB genes. Conclusion Oligonucleotide microarray with mutation-specific probes is a reliable and useful tool for the rapid and accurate diagnosis of rifampin resistance in M.tuberculosis isolates.     

广西百色地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB的突变特征分析

目的分析百色地区结核分枝杆菌(MTB)利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。方法收集128例结核病患者痰液标本,采用改良罗氏培养基分离培养结核分枝杆菌,绝对浓度法检测利福平耐药性,PCR技术检测耐药结核分枝杆菌rpoB基因序列并测序分析利福平耐药相关基因rpoB的突变特征。结果分离培养获得98例MTB,98例MTB出现36株利福平耐药,耐药率为36.73%,36株耐利福平菌株中有27株rpoB基因发生突变,基因突变率为75.00%,其中516位点突变率为3.70%(1/27),531位点突变率为59.26%(16/27),526位点突变率为29.63%(8/27),533位点突变率为7.41%(2/27)。突变热点依次为rpoB531、rpoB526和rpoB533。结论百色地区耐利福平结核分枝杆菌耐药性产生的主要分子机制是因为rpoB的基因发生突变。     

91株耐利福平结核分枝杆菌的rpoB基因突变分析

目的分析利福平耐药结核菌株rpoB基因突变特点,探讨DNA序列分析在药敏测定中的意义。方法对101株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的PCR产物进行测序分析,观察其rpoB基因突变的规律。结果 101株临床分离株中,耐利福平91株,经DNA序列分析有85.71%(78/91)菌株存在rpoB基因突变的突变,主要集中在531位(44.87%)和526位(28.21%),未检测到发生缺失或插入碱基突变的菌株,10株敏感株均无突变。结论 rpoB基因核心突变区发生突变是结核分枝杆菌对利福平耐药的主要原因,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

结核分枝杆菌rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度的相关性

目的 研究结核分枝杆菌，rpoB基因突变与多重耐药及利福平耐药程度强弱之间的关系。方法应用绝对浓度法测定58株结核分枝杆菌对4种－线抗结核药物的药敏特性，对耐利福平结核分枝杆菌的耐药谱进行分析。同时对含有核心突变区的结核分枝杆菌，rpoB基因片段进行PCR扩增和DNA测序，分析rpoB基因突变与多重耐药的关系，以及突变位点和突变性质与利福平耐药强弱的相关性。结果58株结核分枝杆菌中，利福平耐药株36株，敏感株22株。36株耐药株均存在，rpoB基因突变，其中88．9％(32／36)至少对利福平和异烟肼同时耐药。90．O％的利福平高度耐药株(18/20)与rpoB基因531位和526位密码子突变相关。密码子531位和526位各有1株双碱基突变，且均为多重耐药株。结论结核分枝杆菌，rpoB基因突变所致的利福平耐药株大部分对异烟肼耐药，因此单独检测rpoB基因突变即可初步筛选多重耐药的结核分枝杆菌；而rpoB基因的突变位点与利福平耐药程度之间具有一定的相关性。     

Rapid Detection of Rifampin-resistant Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis by Reverse Dot Blot Hybridization

Objective A PCR-reverse dot blot hybridization (RDBH) assay was developed for rapid detection of rpoB gene mutations in‘hot mutation region’ of Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis).
Methods 12 oligonucleotide probes based on the wild-type and mutant genotype rpoB sequences of M. tuberculosis were designed to screen the most frequent wild-type and mutant genotypes for diagnosing RIF resistance. 300 M. tuberculosis clinical isolates were detected by RDBH, conventional drug-susceptibility testing (DST) and DNA sequencing to evaluate the RDBH assay.
Results The sensitivity and specificity of the RDBH assay were 91.2%(165/181) and 98.3%(117/119), respectively, as compared to DST. When compared with DNA sequencing, the accuracy, positive predictive value (PPV) and negative predictive value (NPV) of the RDBH assay were 97.7%(293/300), 98.2%(164/167), and 97.0%(129/133), respectively. Furthermore, the results indicated that the most common mutations were in codons 531 (48.6%), 526 (25.4%), 516 (8.8%), and 511 (6.6%), and the combinative mutation rate was 15 (8.3%). One and two strains of insertion and deletion were found among all strains, respectively.
Conclusion Our findings demonstrate that the RDBH assay is a rapid, simple and sensitive method for diagnosing RIF-resistant tuberculosis.     

结核分支杆菌rpoB基因突变和耐利福平的相关性研究

研究结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因突变及其与利福平（ＲＦＰ）耐药性的关系,建立快速检测耐药基因型的分子药敏试验方法。用ＰＣＲ—ＳＳＣＰ分析结核分支杆菌ｒｐｏＢ基因。结果显示ＰＣＲ扩增ｒｐｏＢ基因为属特异性。８１株结核分支杆菌的ＰＣＲ－ＳＳＣＰ图谱与Ｈ３７Ｒｖ为对照,３５株敏感菌仅有一株位置有区别;４６株耐药菌有４２株有明显区别;检测阳性率为９１．３％;特异性９７．１％。证明ｒｐｏＢ基因突变是结核分支杆菌耐利福平的主要机理,ＰＣＲ—ＳＳＣＰ可简便快速地检出ｒｐｏＢ基因的突变,有助于结核分支杆菌耐药性的快速检测和研究。     

结核分支杆菌耐利福平耐药基因检测研究

目的评价应用DNA序列分析方法和聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)技术检测rPOB基因突变在结核分支杆菌耐利福平(RFP)耐药性测定中的应用价值.方法采用DNA序列分析法和PCR-SSCP法对80株结核分支杆菌临床分离株(其中药物敏感株32株,耐RFP或含耐RFP耐多药株48株)rpoB基因核心区域的突变情况进行检测.结果以结核分支杆菌H37RV为对照,所有32株药物敏感株的rPOB基因均无突变.用DNA序列分析方法检测48株耐药株中44株发生突变,敏感性为91.7%(44/48),其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸.PCR-SSCP检测48株耐RFP分离株中,45株rPOB基因SSCP图谱异常,其敏感性为93.1%(45/48).结论DNA序列分析可指导临床用药,PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性.     

γ-干扰素释放试验与结核分枝杆菌耐药基因特征研究

目的 分析γ-干扰素释放试验（interferon gamma release assay, IGRA）与结核分枝杆菌耐药基因的特征性,为临床诊治耐多药结核提供参考依据。方法 选取2019年1月1日-2020年1月1日在海南医学院第二附属医院住院的肺结核49例（肺结核组）和肺炎51例（肺炎组）为研究对象,另选取同期进行健康体检者40例为对照组,采用γ-干扰素释放试验检测γ-干扰素水平,同时采用DNA微阵列芯片法对肺结核组进行耐药基因检测,所得数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析。结果 肺结核组、肺炎组和对照组IGRA阳性率分别为57.1%（28/49）、29.4%（15/51）和2.5%（1/40）,3组差异有统计学意义（P<0.01）。rpoB基因检出率和突变率分别为34.7%（17/49）和35.3%（6/17）,常见的突变位点分别为531、513、526、511,rpoB基因突变类型分别为531位点（C->T）、513位点（C->A）、526位点（A->T）及511位点（T->C）;katG315基因检出率和突变率分别为34.7%（17/49）和17.6%（3/17）,突变类型为katG315位点AGC->ACC;检出和未检出rpoB基因的IGRA阳性率分别为82.4%（14/17）和43.8%（14/32）,差异有统计学意义（P<0.01）。检出和未检出katG315基因的IGRA阳性率分别为82.4%（14/17）和46.8%（15/32）,差异有统计学意义（P<0.05）。结论 rpoB突变位点呈多样性,而katG315呈单一性;联合IGRA和基因的检测结果对临床结核的诊断和治疗更有意义。