Antibiotic penetration into rabbit nucleus pulposus

A rabbit model was used to determine the penetration of four commonly used antibiotics (clindamycin, tobramycin, cephalothin, and oxacillin) into the nucleus pulposus after receiving an 8-hour course of intramuscular antibiotic injections. Clindamycin and tobramycin achieved therapeutic levels in the nucleus pulposus and both were present in greater than 50% of serum levels. Cephalothin was not detected in the nucleus pulposus and penetrated at less than 4% of serum levels at 1 hour after injection. The data were inconclusive regarding oxacillin penetration.     

Antibiotic penetration into rabbit nucleus pulposus with discitis

Objective

To assess the penetration into nucleus pulposus (NP) of cephazolin and clindamycin in a discitis model.

Materials and methods

Twenty New Zealand white rabbits were inoculated with 103 Staphylococcus aureus at lumbar disc space. The rabbits with discitis confirmed by MRI 10 days after inoculation were divided into two groups. One was given cephazolin by intravenous (IV) at 80 mg/kg/day at 1.5 h interval for 5 half-lives; the other was given clindamycin by IV at 30 mg/kg/day at 2.5-h interval for 5 half-lives. Thirty minutes after completion of the last dose, NP and serum were sent to measure antibiotic concentration.

Results

Two rabbits died during inoculation. After 10 days, 18 rabbits were confirmed discitis in the inoculated levels. The cephazolin and clindamycin can diffuse throughout the infected, sham-infected and normal NP. The serum concentration of cephazolin and clindamycin was 251.3 ± 40.5 and 21.6 ± 4.71 mg/l, respectively. The cephazolin concentration in infected NP (1.93 ± 0.84 mg/l) was higher than that in sham-infected (1.73 ± 0.61 mg/l) and normal NP (1.68 ± 0.65 mg/l), but the difference showed no statistically significant (P > 0.05). The cephazolin penetration into NP averaged 0.68–0.77 % of serum level. The clindamycin concentration in infected NP (4.32 ± 1.54 mg/l) was higher than that in sham-infected NP (2.63 ± 1.26 mg/l) and normal NP (2.59 ± 1.01 mg/l) (P < 0.05). The penetration into NP averaged 11.9–20 % of serum level. There was no significance difference between sham-infected and normal NP in clindamycin and cephazolin concentration (P > 0.05).

Conclusions

This study demonstrates cephazolin and clindamycin can penetrate the infected and normal NP. The antibiotics charge influences the delivery. Furthermore, infection condition selectively promotes antibiotic distribution within NP.     

新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的实验研究

[目的]观察以新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外构建组织工程化髓核的可行性。[方法]分离培养兔髓核细胞,与丝素蛋白多孔支架在体外复合培养,建立组织工程化髓核模型,通过扫描电镜、HE染色、甲苯胺蓝染色、Ⅱ型胶原免疫组化以及酶联免疫吸附测定观察细胞在支架上1周和3周的生长及增殖情况。[结果]培养1周后,扫描电镜显示细胞呈球状均匀地贴附在支架内部。细胞-支架复合体HE染色可见支架内部有大量髓核细胞,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。培养3周后,扫描电镜显示细胞成层黏附于支架表面,细胞重叠生长,分泌大量细胞外基质,HE染色可见支架内部有大量髓核细胞填满支架孔隙并分泌大量细胞外基质,甲苯胺兰染色阳性,Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。酶联免疫吸附测定:3周组蛋白多糖含量(52.4±4.5)ng/ml明显高于1周组(29.3±3.6)ng/ml,P<0.05,3周组的II型胶原含量(24.3±1.8)ng/ml明显高于1周组(15.16±1.5)ng/ml,P<0.05。[结论]新型丝素蛋白多孔支架复合兔髓核细胞体外培养生长良好,分泌大量类似髓核样细胞外基质,可以用于体外构建组织工程化髓核。     

人髓核细胞诱导人尿源性干细胞向髓核样细胞分化作用的研究

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)诱导对人尿源性干细胞(USCs)向髓核样细胞分化的作用。方法 :手术时获取腰椎间盘突出症患者L4/5的髓核组织,并采用贴壁法体外分离培养NPCs;从健康成年人尿液中获取USCs并进行体外培养,通过倒置显微镜观察细胞形态,并采用成骨、成脂、成软骨三系诱导分化及蛋白免疫印迹技术(Western blot,WB)对所获取的USCs进行形态、分化潜能及细胞表面标志蛋白鉴定。使用Transwell小室将P3代NPCs与USCs培养以建立共培养体系,设实验组、对照组及NPCs组,实验组为NPCs与USCs共培养组,对照组为单独USCs培养,NPCs组为单独NPCs培养;培养14d后应用倒置显微镜观察细胞形态;应用定量实时聚合酶链反应(qRT-PCR)及WB分别检测实验组USCs、对照组USCs与NPCs组NPCs中蛋白多糖(ACAN)、SOX-9(SRY-related high mobility groupbox gene 9)、Ⅱ型胶原(COL2)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA及蛋白的表达情况;免疫荧光染色观察3组COL2A1及ACAN荧光表达。...     

髓核细胞来源外泌体对骨髓间充质干细胞向髓核样细胞分化的作用

目的:探讨人髓核细胞(NPCs)外泌体对人骨髓间充质干细胞(BMSCs)向髓核样细胞分化的作用。方法:取腰椎间盘突出症患者手术切除的髓核组织,体外分离培养人NPCs,采用差速离心法提取NPCs的外泌体,利用透射电镜及Western blot对外泌体进行大小形态及标志蛋白的检测,同时用PKH67荧光染料标记外泌体后与BMSCs共孵育0.5h、2h、4h,在激光共聚焦显微镜下观察BMSCs对NPCs外泌体的摄取情况;取人BMSCs经NPCs外泌体诱导3d、7d、10d、14d后应用RT-PCR检测BMSCs中蛋白聚糖(ACAN)、SOX-9、Ⅱ型胶原(COL2A1)、角蛋白19(KRT19)及缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的m RNA表达情况。结果:提取的人NPCs外泌体为直径为30~100nm的圆形或椭圆形结构,其表达CD63和Tsg101,不表达Calnexin蛋白。经PKH67标记的NPCs外泌体可以被BMSCs摄取;经NPCs外泌体诱导后7d开始BMSCs中的ACAN、SOX-9、COL2A1、KRT19及HIF-1α基因m RNA表达均显著性高于未经诱导的BMSCs(P0.05)。结论:在体外实验中,人NPCs可以分泌外泌体并被BMSCs所摄取,诱导BMSCs分化为髓核样细胞,可为椎间盘退变的组织工程修复提供更为简单有效的NPCs来源。     

地塞米松对兔髓核细胞增殖及聚集蛋白聚糖表达的影响

目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞分泌聚集蛋白聚糖(Aggrecan)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为两组,实验组给于1～10000 nmol/L地塞米松进行培养,对照组不给于地塞米松,分别培养不同的时间段.采用噻唑蓝(MTT)比色法检测地塞米松对兔髓核细胞增殖的影响;采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内Aggrecan mRNA表达的影响.结果 MTT检测结果表明地塞米松对兔髓核细胞增殖有促进作用,最佳作用浓度为100nmol/L,最佳作用时间为48 h;RT-PCR检测结果表明经地塞米松处理的髓核细胞其Aggrecan表达明显较对照组高,是对照组的2.04倍(0.92/0.45),差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内Aggrecan表达增高.     

地塞米松对兔髓核细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响

目的 观察地塞米松对兔椎间盘髓核细胞增殖的影响,以及对髓核细胞表达增殖细胞核抗原(PCNA)的影响.方法 无菌条件下取兔椎间盘,常规分离消化髓核细胞进行培养;传代培养第2代髓核细胞7 d,随机分为4组,实验组给予l～100 nmol/L地塞米松进行培养,对照组给与等量磷酸盐缓冲液(PBS),培养5 d后收集细胞.采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测地塞米松对兔髓核细胞内PCNA mRNA表达的影响;并提取蛋白用Western blot方法检测PCNA蛋白表达.结果 RT-PCR及Western blot检测结果表明,1～100 nmol/L地塞米松可增加兔髓核细胞内PCNA的表达,当地塞米松浓度为100 nmol/L时效果最显著,分别增加了0.42和1.37倍,差异有统计学意义(P<0.05).结论 地塞米松可以促进兔椎间盘髓核细胞的增殖,并可使兔髓核细胞内PCNA的表达增高.     

不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性比较

目的:比较不同代次兔髓核细胞冻存后的生物学特性,找出适合作为种子细胞冻存的兔髓核细胞代次。方法:取3～4月龄新西兰大白兔10只,麻醉后在严格无菌条件下分离胸腰椎间盘(T1/2～L7/S1)髓核细胞,体外传代培养,分别取一、二、三、四、五代细胞冻存2～3个月后复苏,取一代未冻存细胞作为对照组(A组,n=10);一、二、三、四、五代冻存后复苏的细胞作为实验组(分别为B、C、D、E、F组,各组n=10),在相同条件下培养2周,培养第2天时采用台盼蓝染色测定细胞成活率;培养第2d、5d、10d、14d时采用MTT法检测细胞生长活性,采用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖(PG)含量;培养第14d时采用阿利新兰染色法测定糖胺聚糖(GAG)合成总量,用RT-PCR法检测各组细胞Ⅱ型胶原基因的表达情况。检测细胞浓度均为1×105个/ml。采用SPSS 13.0软件进行统计学分析。结果:培养第2d时B、C组细胞成活率接近A组(P>0.05);D、E、F三组细胞成活率明显低于A、B、C组(P<0.05)。不同时间点各组细胞均有不同程度的增殖,A、B、C、D四组生长趋势较接近,A、B、C三组相同时间点生长活性比较差异无统计学意义(P>0.05),D组与同一时间点A组比较有显著性差异(P<0.05),E组第10d和第14d以及F组各时间点间比较差异无显著性(P>0.05);A、B、C三组各时间点的PG含量及GAG含量高于相应时间点D、E、F组(P<0.05);A、B、C三组的Ⅱ型胶原基因表达量高于D、E组(P<0.05),明显高于F组(P<0.01)。结论:不同代次兔髓核细胞冻存后生物学特性不同,第一、二代细胞冻存后能较好保持髓核细胞特性,可作为种子细胞进行低温保存。