不同胎龄人胎脑室下区神经干细胞生长特征及增殖分化实验研究

目的 探讨不同胎龄人胎脑室下区神经干细胞（NSCs）的生长特征。方法 收集胎龄16～36周的胎儿90例,每例研究对象取室下区脑组织作为实验材料。所有研究对象产前经B超诊断患有先天性心脏病或消化道畸形,均无脑发育异常,孕妇及其丈夫要求终止妊娠。采用免疫组化技术对人胎脑室下区NSCs的形态、存在方式以及数量进行检测,采用细胞培养技术对其进行培养、传代、分化观察,并应用免疫组化技术对培养及分化的细胞进行鉴定。结果人胎脑室下区NSCs具有星形、圆形、椭圆形及梭形等形态,以星形最多。细胞胞浆相对较少;核呈圆形,染色质疏松,1-4个核仁不等。可见NSCs对称分裂和不对称分裂现象,NSCs多数单个散在分布,有的NSCs与别的NSCs形成突触联系。不同胎龄人胎脑室下区NSCs随着胎龄的增加而减少（x^2=4644．602,P〈0．01）。不同胎龄以及同一胎龄不同个体的NSCs在上述方面存在一定的差别。从人胎脑室下区分离的细胞在无血清培养时呈悬浮状态生长,形成神经球。该细胞可传代培养,表达神经巢蛋白抗原（Nestin）;而在含血清培养时能分化,分化细胞表达神经元细胞、少突及星形胶质细胞的特异性抗原。结论 不同胎龄人胎脑室下区均存在NSCs,且在形态、存在方式及数量上存在一定的差异。不同胎龄人胎脑室下区均能在体外培养出NSCs。     

32周胎龄人胎脑神经干细胞发育状态的研究

目的探讨人同一胎龄胎脑不同部位神经干细胞的发育状态。方法收集胎龄32周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位的神经干细胞(NSCs)的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果32周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs。NSCs呈圆形、椭圆形及星形,以圆形及星形多见;细胞有0~2个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1~2个核仁不等。NSCs呈明显的区域性分布,可见群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式,有的NSCs与其他NSCs形成突触联系。不同部位上述特点有所不同。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少,检出率差异非常显著。结论人胎脑的海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等部位均存在NSCs;且同一胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。     

36周胎龄人胎脑不同部位神经干细胞变化特征研究

目的观察同胎龄不同部位人胎脑神经干细胞(NSCs)的变化特征。方法收集胎龄36周的水囊引产胎儿15例,采用免疫组织化学技术对人胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位NSCs的分布、形态、生长方式以及数量进行检测。结果36周胎脑海马、纹状体、室下区、额叶、颞叶、枕叶、顶叶等部位均存在NSCs,NSCs呈圆形、椭圆形、星形、多角形及梭形,以圆形及星形多见;细胞0～4个突起不等,胞浆丰富,核呈圆形,染色质疏松,1～2个核仁不等。可见NSCs呈群状、集落样、对称分裂、单个存在等生长方式。海马、室下区、纹状体、额叶、颞叶、顶叶、枕叶等7个部位NSCs逐渐减少。结论36周胎龄不同部位NSCs在分布、形态、生长方式及数量上存在差异。     

人胎脑Nestin阳性神经元的发育

目的：观察人胎脑有无Nestin阳性细胞存在及其发育。方法：收集胎龄为16～32周不等的自愿终止妊娠引产的正常胚胎15例。应用HE染 色和免疫细胞化学方法观察不同胎龄的人胎脑脑室管膜下区、海马、纹状体的Nestin阳性细 胞。结果：分别在胎龄16周、17周、20+3周、22周、23周、24+ 5 周、25周和27周的胎脑上述3个部位中发现有数量不等的Nestin阳性表达细胞,且呈现两 种不同形态。结论：人胎脑的脑室管膜下区、海马、纹状体存在Nestin阳 性表达细胞,且呈两种不同形态。     

不同胎龄人胎脑皮质枕叶神经干细胞的发育特征

目的探讨不同胎龄胎脑皮质枕叶神经干细胞（NSCs）的发育特征。方法收集胎龄16～36周的水囊引产胎儿90例，采用免疫组织化学及光镜技术对人胎脑皮质枕叶NSCs的分布、形态、生长方式及数量进行检测。结果NSCs主要分布在锥体细胞层及内颗粒细胞层．呈圆形，中等大小，0、1个突起，核相对较大，2—4个核仁，染色质疏松。NSCs呈明显的区域性分布，大部分NSCs以群状、簇状或数个细胞形成的小集落样生长方式存在，少数NSCs以单个形式存在于其他神经细胞中，各胎龄组NSCs在分布、形态、种类、生长方式等方面无明显差异。随着胎龄的增加，皮质枕叶NSCs逐渐减少。结论不同胎龄人胎脑皮质枕叶存在NSCs，其数量随着胎龄的增加而减少。     

不同实验方法在人胎脑海马神经干细胞检测中的应用

目的探讨精确可靠的检测人胎脑神经干细胞(NSCs)的方法。方法收集胎龄32周的水囊引产胎儿10例,灌注固定后分别予石蜡包埋和冷冻切片,采用HE检测Nestin蛋白表达免疫组织化学染色和光镜技术对人胎脑海马部位两种切片组织结构的改变和NSCs进行检测。结果石蜡切片海马组织Nestin蛋白表达阳性NSCs数较少,每个NSCs中Nestin蛋白表达的量也较少:而冷冻切片Nestin蛋白表达阳性NSCs数较多,且每个NSCs中Nestin蛋白表达的量也较多,石蜡切片中组织及细胞结构完整性优于冷冻切片。结论水囊引产、灌注固定及冷冻切片三结合研究人胎脑组织NSCs,是一种可靠、精确而敏感的实验方法。     

人胎脑海马部位神经干细胞形态学观察

目的 探讨人胎脑海马部位神经干细胞的形态学发育特点。方法 收集胎龄20～36周的自愿水囊引产胎儿75例，采用免疫组织化学和光镜观察技术对胎脑海马部位神经干细胞的分布、形态、存在方式进行检测。结果 神经干细胞主要分布于海马多形细胞层、锥体细胞层及颗粒细胞层，分子层也可见，细胞呈圆形、椭圆形、三角形及星形，以圆形细胞多见，0～2个突起不等，以1个突起多见。细胞胞浆丰富；核呈圆形及椭圆形，染色质疏松，2～5个核仁不等。多数单个散在分布，可见对称分裂现象，有的干细胞呈簇状分布，有的干细胞突起与别的细胞保持联系。结论 人胎脑海马部位各层均存在神经干细胞，海马可能存在齿状回之外的神经干细胞生发中心。     

不同疗程高压氧对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的 探讨不同疗程高压氧(HBO)对缺氧缺血脑损伤(HIBD)新生大鼠神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法 7日龄SD大鼠随机分为正常对照组(CON组)、HIBD组、HBO组,其中HBO组义分为HBO l疗程组[HBO-1,在HIBD 2 h开始HBO治疗,HBO压力为0.1 MPa(2 ATA),稳压60 min,1次/d,7次为1疗程],2疗程组(HBO-2,予2个疗程HBO)和3疗程组(HBO-3,予3个疗程HBO).疗程结束后(鼠龄35 d)取脑组织标本,采用5-溴-2-脱氧嘧啶核昔(BrdU)/神经巢蛋向(Nestin)免疫荧光双标法检测缺血侧侧脑室室管膜下区(SVZ区)和海马齿状回区(DG区)的内源性NSCs的变化.Western blot法检测缺血侧大脑半球Nes-tin蛋白变化.BrdU/神经元特异性烯醇化酶(NSE)和BrdU/胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光双标法检测大脑皮层神经元和星形胶质细胞数量;TUNEL法检测皮层神经细胞凋亡;并进行T迷宫试验、放射臂迷宫测试、足错误等行为学测试.结果 1.HBO治疗后SVZ区BrdU+/Nestin+细胞随疗程增加而逐渐增加,以HBO-3组的阳性细胞数最多;2.各组大鼠的海马DG区均仅有极少垦的BrdU+/Nestin+细胞表达,且随着HBO疗程的增加,BrdU+/Nestin+细胞表达无增加;3.大脑皮层BrdU+/NSE+细胞表达随HBO疗程增加逐渐增多,其中以HBO-3组的阳性细胞数最多;4.HIBD组可见较多GFAP+细胞,高于CON组和HBO组;且各组均仅有个别BrdU+/GFAP+细胞表达;5.Western blot显示HBO-3组Nestin蛋白表达高于其余各组;6.T迷宫、放射臂迷宫和足错误测试结果 均表明随着HBO疗程的增加,疗效愈加显著.结论 增加HBO疗程可促进HIBD新生大鼠SVZ区内源性NSCs皮层神经元细胞的增殖和分化.     

小鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及其机制研究

目的探讨小鼠巨细胞病毒(MCMV)对体外培养的神经干细胞(NSCs)分化的影响及其机制。方法体外分离、培养BABL／c胎鼠NSCs,利用NSCs向神经细胞分化模型,用感染复数(MOI)为1的含Lacz报告基因的重组MCMV毒株RM461进行感染,通过免疫组化、流式细胞术和RT-PCR检测MCMV感染后Nestin、GFAP和NSE阳性细胞比率及对神经干细胞分化相关信号分子Wnt-1和neurogenin 1(Ngn1)基因表达的影响。结果体外分离培养的NSCs,神经干细胞特异性标志Nestin表达强阳性,并可进一步分化为GFAP阳性的星形胶质细胞和NF-200、NSE阳性的神经元。当NSCs分化培养2 d,感染组和未感染组Nestin阳性细胞分别为(62．2±1．8)％和(37．2±2．4)％(t= 4．62,P<0．01),差异有统计学意义;而GFAP阳性细胞的比例分别为(37．4±1．6)％和(50．3±1．8)％(t=9．89,P<0．01),NSE阳性细胞的比例分别为(8．9±0．8)％和(23．4±1．3)％(t=5．09, P<0．01),差异均有统计学意义。感染组和未感染组Wnt-1基因的相对表达量分别为0．14±0．03和0．32±0．04(t=7．21,P<0．01),Ngn1基因的相对表达量分别为0．09±0．01和0．21±0．02(t= 10．73,P<0．01),差异均有统计学意义。结论(1)CMV可抑制NSCs分化,这可能是CMV致脑发育异常的重要机制;(2)CMV感染可抑制Wnt-1和Ngn-1的基因表达而影响NSCs分化,人为调控这两条通路可能为探寻防治CMV感染致脑发育异常的方法提供新策略。     

胶质细胞源性神经营养因子联合神经干细胞移植治疗脑室周围白质软化新生大鼠的疗效观察

目的 探讨在移植物中加入胶质细胞源性神经营养因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF),能否增强外源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)经脑室移植治疗脑室周围白质软化(periven-tricularleukomalacia,PVL)新生大鼠的移植效果.方法 采用E14胎鼠大脑皮质制备NSCs.2日龄新生大鼠随机分为PVL对照组(PVL组),PVL+NSCs移植组(PVL+NSCs组),PVL+NSCs移植+GDNF组(PVL+NSCs+GNDF组),假手术对照组(Sham组).Sham+NSCs移植组(Sham+NSCs组),以及Sham+NSCs移植+GDNF组(Sham+NSCs+GDNF组).对PVL新生大鼠在建模后72 h进行立体定位仪下经脑室NSCs移植,分别于移植术后7、14、21 d进行免疫荧光、光镜及电镜病理检测,评估在NSCs中加入GDNF对移植效果的可能影响.结果 经脑室植入的外源性NSCs在脑内具有良好的迁移能力,3 d内大部分移行至脑室周围,2周左右在脑室周围主要分化为少突胶质细胞前体,部份分化为神经元及星形胶质细胞.三种分化细胞在加入GDNF移植组显著多于未加GDNF移植组(P均<0.05).移植后21 d光镜下脑病理显示,两个移植组的脑白质病理均获明显改善,尤其加人GDNF移植组的脑白质重度病变发生率较未加GDNF移植组下降了25.5%(P<0.01).移植后21 d的电镜显示,PVL组罕见髓鞘形成,两个移植组的髓鞘形成明显增加,尤其加入GDNF移植组的髓鞘形成明显多于未加GDNF移植组.结论 在外源性NSCs移植物内加入GDNF,可明显增强NSCs经脑室移植治疗PVL新生大鼠的移植疗效.     

不同褪黑素治疗方案对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞增殖的影响

目的 探讨不同褪黑素治疗方案对缺氧缺血性脑损伤（HIBD）新生大鼠脑内源性神经干细胞（NSCs）增殖及远期组织学的影响,以寻求褪黑素治疗的较优方案。方法 将96只7日龄Sprague-Dawley大鼠随机分为正常对照组、缺氧缺血性脑损伤（HIBD）组、单剂量即刻褪黑素治疗（SDIT）组及7日连续褪黑素治疗（7DCT）组（n=24）。HIBD大鼠模型采用分离并电凝大鼠右侧颈总动脉,低氧舱（氧气浓度为8%±0.01%）内缺氧2 h的方法建立。造模后7 d,采用增殖细胞核抗原（PCNA）/巢蛋白（Nestin）免疫荧光双标法检测各组大鼠侧脑室室管膜下区（SVZ）及海马齿状回（DG）区内源性NSCs的增殖情况（n=8）;采用Western blot法检测各组大鼠脑Nestin蛋白的表达水平（n=8）。造模后28 d,采用苏木精-伊红染色（HE）和尼氏染色法观察海马CA1区的组织病理学及锥体细胞数的变化（n=8）。结果 免疫荧光染色结果显示：SDIT组和7DCT组PCNA⁺Nestin⁺DAPI⁺细胞数均较HIBD组增加,且7DCT组显著多于SDIT组（P < 0.01）;Western blot结果显示：SDIT组与7DCT组Nestin蛋白的表达水平均显著高于HIBD组,且7DCT组显著高于SDIT组（P < 0.05）;HE染色结果显示：SDIT组及7DCT组细胞损伤减轻;尼氏染色结果显示：SDIT组和7DCT组锥体细胞数均较HIBD组增加,且7DCT组显著高于SDIT组（P < 0.01）。结论 SDIT和7DCT均可促进HIBD新生大鼠脑内源性NSCs的增殖,减轻远期组织学损伤,且7DCT疗效优于SDIT。     

人胎脑神经干细胞体外培养及分化研究

目的研究人胚胎神经干细胞体外长期培养的条件、不同部位脑组织神经干细胞数量及其分化能力和特点。方法分离人胚胎海马、皮质、室周、纹状体脑组织，培养在含碱性成纤维细胞生长因子（b-FGF）、表皮生长因子（EGF）、B27、N2掭加剂的无血清培养基中，形成神经球，用有限稀释法进行克隆、传代。计算神经球数量，用溴脱氧尿苷（BrdU）标记神经球，使用免疫细胞化学法鉴定神经干细胞自主分化能力。结粜人胚胎海马、皮质、室周、纹状体部位脑组织均能培养出具有自我增殖能力的神经干细胞，其中海马所含神经干细胞最丰富。室周次之。BrdU检测有正在分裂、增殖的细胞。液氮冻存6个月的细胞复苏后仍具增殖分化能力。细胞贴壁分化后可形成Nestin、胶质原性纤维酸性蛋白（GFAP）、微管相关蛋白2（MAP2）表达阳性细胞。结论胚胎脑组织具有丰富的神经干细胞。具有自我更新和增殖能力，可长期培养。含b-FOF、EGF的无血清培养基能促进神经干细胞连续稳定增殖，保持神经干细胞特性。分离培养的神经干细胞可向神经元、胶质细胞分化。     

Birth weight charts for gestational age in 63 620 healthy infants born in Peruvian public hospitals at low and at high altitude

Aim: To construct distribution curves for birth weight, length and head circumference using a large sample of infants born at low (150 m) and high (3000–4400 m) altitude.
Methods: Cross-sectional analysis of a perinatal database. All live singleton deliveries from public hospitals during 2001–2006 (gestational age from 26 to 42 weeks) with no history of perinatal deaths or smoking and no current obstetric complications (n = 63 620) were included. Fractional polynomial regression models were used to smooth curves for each gestational age.
Results: Mean and median birth weight differences between those born at low and high altitudes reached statistical significance after 35 and 33 weeks, respectively. Values of the 10th percentile were higher at low altitude from 36 weeks, whereas values at the 90th percentile were different from 34 weeks. In the Peruvian growth curves, birth weight was greater at each gestational age than in the curves derived by Lubchenco.
Conclusion: Altitude affects growth patterns; these growth standards will provide useful references for the care of the newborn in highland populations. In addition, the data have implications for the antepartum management of pregnant patients undergoing sonographic evaluation of fetal weight in whom new definitions of what represents small or large for gestational age in utero can result in differences in time or mode of delivery.     

人胰岛素样生长因子-1基因修饰的神经干细胞移植对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠的治疗作用

目的 探讨胰岛素样生长因子-1(IGF-1)基因修饰神经干细胞(NSCs-IGF-1)移植对缺氧缺血性脑损伤(HIBD)新生大鼠脑功能恢复的治疗作用.方法 采用结扎大鼠左侧颈总动脉,低氧箱中缺氧处理的方法,制成新生大鼠HIBD模型,随机分为正常对照组、模型对照组、神经干细胞(NSCs)移植组和NSCs-IGF-1移植组,尾静脉注入法进行干细胞移植.分别于移植1 d、7 d、14 d、21 d 取5只大鼠脑组织进行病理切片,通过5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)、巢蛋白(Nestin)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)免疫组织化学染色观察NSCs在宿主脑内存活及增殖和分化情况,并通过Y-迷宫实验和运动功能检测对剩余大鼠脑功能恢复情况进行观察.结果 移植7 d后,NSCs移植组和NSCs-IGF-1移植组均可见到BrdU阳性细胞,二组比较差异有统计学意义(P<0.05).在观测时间点内,NSCs-IGF-1移植组Nestin阳性细胞表达量早期升高,移植后14 d达峰值,后逐渐下降;NSE阳性细胞表达量逐渐升高.模型对照组在移植7 d后Nestin及NSE阳性细胞表达量逐渐降低,2组比较差异均有统计学意义(Pa<0.01).移植14 d,NSCs-IGF-1移植组Nestin及NSE阳性细胞表达量均明显高于NSCs移植组(Pa<0.01).大鼠学习记忆功能检测及运动功能检测结果均显示NSCs-IGF-1移植组明显优于模型对照组及NSCs移植组,二者差异均具有统计学意义(Pa<0.01,0.05).结论 NSCs及NSCs-IGF-1可以在脑内存活、增殖及分化,并可部分促进缺氧缺血大鼠脑功能的恢复;NSCs-IGF-1较单独移植NSCs效果好.