恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的　为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７）,本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因,并纯化及鉴定了表达蛋白。方法　将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １,形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌,纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果　成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７,转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ）,纯化后纯度达７２％ ,ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论　成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白,为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７ 打下基础     

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2的原核表达、纯化及表达产物的鉴定

目的 为将恶性疟原虫的富组氨酸蛋白２（ＨＲＰ２）应用于疟疾诊断和疫苗研究,本文原核表达、纯化及鉴定了恶性疟原虫的ＨＲＰ２。方法 将ＨＲＰ２基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２;诱导ｐＧＥＸ－４Ｔ－１／ＨＲＰ２转化的ＢＬ２１菌,纯化表达产物并免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠;以免疫色谱法鉴定表达产物,以免疫小鼠血清对受染红细胞（ＩＲＢＣ）进行Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析。结果 成功构建了ｐＧＥ     

重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

结核分支杆菌katG蛋白的高表达与纯化

目的 表达与纯化结核分支杆菌ｋａｔＧ蛋白,为深入研究异烟肼耐药机制奠定基础。方法 将含有ｋａｔＧ基因的;ｐＥＴ２４ｂ－ｋａｔＧ表达载体转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株,在异丙基硫代β－Ｄ－半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导下表达,分别对不同诱导时间的表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ以及考马斯亮蓝染色。获得稳定的高表达菌株后采用Ｘｐ;ｒｅｓｓ＾ＴＭ蛋白纯化系统对超声破菌液进行纯化。     

弓形虫主要表面抗原基因（P30）大肠杆菌中以融合蛋白形 …

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（Ｐ３０）的基因的序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出Ｐ３０基因,将Ｐ３０基因克隆入表达质粒ｐＧＥＭＥＸ－１中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌ＪＭ１０９（ＤＥ３）,宿主菌经ＩＰＴＧ诱导表达后,产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析。结果显示,Ｐ３０基因以融合蛋白的形式表达,实物具有特异的免疫反应性。     

在大肠杆菌中高效表达人I型免疫缺陷病毒p24蛋白

目的 表达人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白ｐ２４，为制备抗ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原奠定基础。方法 将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４＾ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建重组表达质粒，转化大肠肝菌ＢＬ２（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及点免疫印迹分析，结果 构建成功重组表达质粒ｐＥＴ２４经Ｉ     

弓形虫主要表面抗原基因( P30)大肠杆菌中以融合蛋白形式的初步表达(英文)

根据已发表的弓形虫主要表面抗原（ Ｐ３０）的基因序列,设计合成了一对引物,通过聚合酶链反应,扩增出 Ｐ３０ 基因,将 Ｐ３０ 基因克隆入表达质粒ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｅ Ｘ１ 中,经酶切鉴定后,阳性重组质粒转化宿主菌 Ｊ Ｍ １０９（ Ｄ Ｅ３ ）,宿主菌经 Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱导表达后,产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ和 Ｗ ｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析。结果显示, Ｐ３０ 基因以融合蛋白的形式表达,表达产物具有特异的免疫反应性。     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

日本血吸虫（中国大陆株）FABPc重组抗原高效融合表达,纯化及 …

目的 构建Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ表达克隆,获得大量纯化ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ重组（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）抗原,了解其作为侯选疫苗抗原的潜能。方法 以ＰＣＲ法从Ｓｊ－ｃＤＮＡ库中扩增出目的基因片段后亚克隆入表达载体ｐＧＥＸ－６Ｐ－１进行融合表达,经Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱和ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ＾ＴＭ Ｐｒｏｔｅａｓｅ酶切后纯化出ｒＳｊ－ＦＡＢＰｃ,Ｗｅｓｔｅｒｎ     

克隆有恶性疟原虫MSP1基因片断的pQE质粒在减毒鼠伤寒杆菌X4 …

为探讨克隆有恶性疟原虫ＭＳＰ１基因片断的重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌中的 表达。使用转化和转导的方法构建减毒鼠伤塞杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）和减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的表达。实验结果成功地构建了减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１），Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的诱导型表达量高     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

克隆有恶性疟原虫MSP1基因片断的pQE质粒在减毒鼠伤寒杆菌X4064株中的表达

为探讨克隆有恶性疟原虫ＭＳＰ１基因片断的重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌中的表达。使用转化和转导的方法构建减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）；通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）和减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的表达。实验结果成功地构建了减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１），Ｘ４０６４（ｐＲＥＰ４／ｐＱＥＭ１）的诱导型表达量高于Ｘ４０６４（ｐＱＥＭ１）的组成型表达量。结果指出不受调控的表达将降低重组ｐＱＥＭ１质粒在减毒鼠伤寒杆菌Ｘ４０６４中的表达量     

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白基因片段,经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体,并转化大肠杆菌ＴＧ１、ＪＭ１０３及ＪＭ１０９。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＣＳＰ融合蛋白的表达,结果显示仅ｐＷＲ－ＣＳＰ／ＴＧ１工程菌在菌体浓度ＯＤ５９０值达０．７～０．８时,加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导,可表达一８８ｋＤａ的融合蛋白。ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分析表明ＣＳ蛋白表达产物能被抗ＣＳ蛋白重复区单克隆抗体所识别     

恶性疟原虫疫苗研究：VI.多价保护性抗原的免疫原性

利用工程菌ＰＷＲ－１／ＪＭ１０９以融合蛋白的形式表达人工合成的恶性疟重组基因ｐｆＣＭＲ。经培养，ＩＰＴＧ诱导后收集菌体，超声波破菌，透析，电泳纯化等步骤，分离表达蛋白，结果在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中显示６５ｋＤ蛋白诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的体液免疫和细胞免疫反应进行了观察，结果表明，纯化后的蛋白免疫鼠血清能与表达产物粗提物产生特异的免疫反尖，其抗体滴度达高１：５１０２；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ６５ｋＤ处亦产生     

HBV反义全基因真核细胞表达载体的构建及在肝癌细胞内的表达

１．材料与方法：乳哺动物细胞表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ,长约４．５ｋｂ,带有Ｔ_７公用序列。ｐＣＰ１０是ｐＢＲ３２２ＥｃｏＲＩ位点中插入双拷贝头尾相接的ＨＢＶａｙｗ亚型全基因ＨＢＶＤＮＡ重组质粒。ＰＣＲ引物ＸＩ１：１４２８－１４４８ｎｔ５'ＣＧＴ　ＣＣＣＧＴＣ　ＧＧＣＧＣＴＧＡＡＴＣＣ３',ＸＩ_２：１６７２－１６５３ｎｔ５'ＡＧＴＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＴＣＴＴＡＡＧ３'。人肝癌细胞系ＳＭＭＣ－７７２１,出上海细胞所提供。将ＥｃｏＲＩ酶切后回收的全基因ＨＢＶ片段。在Ｔ_４ＤＮＡ连接酶作用下,与ＥｃｏＲＩ酶切…     

恶性疟原虫疫苗研究Ⅵ．多价保护性抗原的免疫原性

利用工程菌ＰＷＲ－１／ＪＭ１０９以融合蛋白的形式表达人工合成的恶性疟重组基因ｐｆＣＭＲ。经培养、ＩＰＴＧ诱导后收集菌体、超声波破菌、透析、电泳纯化等步骤，分离表达蛋白。结果在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ中显示６５ｋＤ蛋白诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠的体液免疫和细胞免疫反应进行了观察。结果表明，纯化后的蛋白免疫鼠血清能与表达产物粗提物产生特异的免疫反应，其抗体滴度高达１∶５１０２；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ在６５ｋＤ处亦产生特异免疫反应；另在体外用ＰＨＡ和粗提物以及纯化蛋白刺激免疫鼠脾细胞，其Ｔ淋巴细胞转化率分别高达４４．２０±５．２６％、２４．００±４．７４％和３３．５０±３．８４％。提示融合蛋白中含有恶性疟原虫抗原Ｔ－／Ｂ－细胞位点。     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

引形虫P30抗原基因的体外扩增,克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养在初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ抗原基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白的活性鉴定研究

目的恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）是疟原虫红内期生活史过程中从感染红细胞分泌至血浆中的水溶性抗原,是重要的诊断用抗原。本文通过实现恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在大肠杆菌中的表达,为研制用于疟疾诊断的抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体奠定基础。方法将含有ＨＲＰⅡ抗原基因的重组表达质粒ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ用钙法转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,重组子经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢａｍＨＩ与ＢｇｌⅡ双酶切鉴定。重组子ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）在２８℃条件下,用１ｍＭＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析表达产物。结果成功构建ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ重组质粒,在低温条件下经ＩＰＴＧ诱导,ＨＲＰⅡ呈可溶性、非融合性表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明表达产物的分子量约３３ｋＤａ,薄层扫描显示表达蛋白占菌体总蛋白的２０．７６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹表明,表达产物能被抗ＨＲＰⅡ人工合成九肽单克隆抗体特异识别。结论恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在原核表达系统ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得成功表达,为基因工程大规模制备生产ＨＲＰⅡ抗原奠定基础     

弓形虫P30抗原基因的体外扩增、克隆及原核表达

根据已知弓形虫主要表面抗原Ｐ３０的基因序列，用已合成的一对引物，通过聚合酶链反应，从弓形虫ＲＨ、ＺＳ１和ＺＳ２株中扩增了Ｐ３０的编码基因，经纯化及相应酶切后插入质粒ｐｃＤＮＡ３中并转化大肠杆菌ＴＧ１。经含氨苄青霉素ＬＢ培养基初筛后，挑菌扩增双酶切鉴定，阳性克隆子在ＴＧ１中表达，产物经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析显示，Ｐ３０基因在大肠杆菌中高效表达。