弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段,克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１;经亚克隆,筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒,亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒,为下一步研究奠定了基础     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：I.pcDNA3 …

目的 构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法 用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果 从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的　用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒,经肌肉注射免疫小鼠,观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法　碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒,免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,每只鼠注射１００ｕｇ,两周后同量加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０ 天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达;ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果　免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应;血清ＩｇＧ抗体９０天后测定为阳性;皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果,无显著性差异。结论　ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒ＤＮＡ 免疫小鼠后,肌组织内有重组蛋白表达,并能诱导机体产生ＩｇＧ抗体     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：Ⅲ免 …

用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＰＯＰ１真核表达重组质粒，经肌肉注射免疫小鼠，观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每只鼠，注射１００ｕｇ，两周后同时加强免疫一次，以ｐｃＤＮＡ３空间粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０天用间接免疫酶法检注射局部肌组织重组蛋白的表达ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果免疫鼠肌组织     

恶性疟原虫疫苗研究X.MSP1中类表皮生长因子1与PfCMR基因？…

目的 克隆并表达恶性疟原虫重组复合抗原，为疟疾疫苗研究奠定基础。方法 将恶性疟原虫ＭＳＰ１中类表皮生长因子１（ＥＧＦ－１）基因与人工化学合成的抗原复合基因ＰｆＣＭＲ串接，插入高效非融合型蛋白表达载体ｐＢＶ２２０，转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，转化菌经４２℃热诱导表达，表达产物用Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ分析。结果 构建成功重组质粒ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＥＧＦ－１，经热诱导后表达出含外     

应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的克隆与测定

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：Ⅴ.I …

构建ＩＦＮ－γ基因真核表达重组质粒作为基因佐剂,观察其与ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１（ｐｃ－ＲＯＰ１）ＤＮＡ共同免疫小鼠所诱导的免疫应答。方法将ＩＦＮ－γ基因片段定向插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３,双酶切鉴定,获得ｐｃＩＦＮ重组子;碱裂解法大量制备,经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／小鼠,每只鼠注射ｐｃＩＦＮ、ｐｃ－ＲＯＰ１各１００μｇ,两周后同时加强免疫一次,以ｐｃＤＮＡ３空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第     

应用聚合酶链反应技术建立弓形虫表面抗原基因的…

弓形虫主要表面抗原Ｐ３０存在于弓形虫表膜及纳虫泡内的一种蛋白，是刺激机体产生免疫反应的主要抗原。以自行设计合成的一对引物，用聚合酶链反应的方法，从弓形虫基因组ＤＮＡ中将Ｐ３０编码基因调出，经纯化及相应酶切后，插入质粒ｐＢＶ２２０中构成重组质粒ｐＢＶ２２０－Ｐ３０。经Ｓａｎｇｅｒ双脱氧链终止法测序确证该重组质粒中的插入片段即为Ｐ３０基因。     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫Ｐ３０蛋白，采用定向克隆的方法，自行设计引物通过ＰＣＲ扩增得到Ｐ３０基因片段，用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切后，连接到同样酸切的原核表达载体（ｐＢＶ２２０和ｐＭＡＬＰ２）上，转化大肠杆菌ＤＨ５α，分别得到含重组闰ｐＢＶ２２０－Ｐ３０和ｐＭＡＬＰ２－Ｐ３０的工程菌，扩菌提取质粒经过酶切分析和ＰＣＲ扩增鉴定后，证实Ｐ３０基因的两个原核表达载体构建成功，为其在原核系统中的表达作