恶性疟原虫FCC—1／HN株pcDNA3—EBA175／HRPII重组质粒直？…

为观察恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ重组质粒肌肉途径接种后在宿主体内的表达。ＢＡＬＢ／ｃ小鼠分为３组,１组（实验组）经后腿股四头肌注射重组粒ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ１００μＧ;２组（实验对照组）注射空白质粒ｐｃＤＮＡ３１００μＧ,３组（正常对照组）注射ＰＢＳ（ｐＨ７．４）１００μｌ。每隔２０ｄ加强注射,于第１次接种后２０ｄ和第２次接种后１０ｄ取小鼠双侧     

恶性疟原虫FCC—1／HN株EBA—175和HRP—Ⅱ基因片段的体外扩？…

目的 构建恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株红细胞结合抗原（ＥＢＡ－１７５）和富组氨酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－Ⅱ）抗原的重组质粒并进行初步鉴定。方法 通过聚合酶链反应（ＰＣＲ）对恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株的ＥＢＡ－１７５和ＨＲＰ－Ⅱ基因进行体外扩增，用ＨｉｎｄⅢ／ＢａｍＨＩ和ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ分别消化扩增产物，定向克隆ｐｃＤＮＡ３载体，转化至感受态大肠杆菌ＴＧ１，经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定，再经ＰＣＲ和     

恶性疟原FCC-1 HN株EBA-175和HRP-II基因片段在HeLa细胞中的表达及鉴定

目的　在 Ｈｅ Ｌａ 细胞中表达恶性疟原虫红细胞结合蛋白 Ｅ Ｂ Ａ－ １７５ 和富组氨酸蛋白 Ｈ Ｒ Ｐ－ Ｉ Ｉ, 进一步研究其生物学功能和免疫学特性。方法　将 Ｅ Ｂ Ａ－ １７５ 和 Ｈ Ｒ Ｐ－ Ｉ Ｉ 部分基因串接插入 Ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 真核表达载体, 获得重组表达质粒 Ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３ Ｅ Ｂ Ａ１７５ － Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ。采用磷酸钙－ Ｄ Ｎ Ａ 共沉淀法将重组质粒转染 Ｈｅ Ｌａ 细胞进行体外表达, 对表达产物进行 Ｓ Ｄ Ｓ－ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ、 Ｄｏｔ－ Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 鉴定。结果　表达产物占表达蛋白总量的１６４ ％ , 相对分子量与预设计的４８ｋ Ｄａ 基本相符。表达产物与鼠抗恶性疟原虫血清及构建的重组质粒免疫鼠血清产生特异免疫反应。结论　表达载体 Ｐ Ｃ Ｄ Ｎ Ａ３ 在 Ｈｅ Ｌａ 细胞内可表达出具有一定免疫学活性的恶性疟原虫重组抗原蛋白。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ抗原基因在大肠杆菌中的表达及表达蛋白的活性鉴定研究

目的恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）是疟原虫红内期生活史过程中从感染红细胞分泌至血浆中的水溶性抗原,是重要的诊断用抗原。本文通过实现恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在大肠杆菌中的表达,为研制用于疟疾诊断的抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体奠定基础。方法将含有ＨＲＰⅡ抗原基因的重组表达质粒ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ用钙法转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,重组子经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢａｍＨＩ与ＢｇｌⅡ双酶切鉴定。重组子ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）在２８℃条件下,用１ｍＭＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹分析表达产物。结果成功构建ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ重组质粒,在低温条件下经ＩＰＴＧ诱导,ＨＲＰⅡ呈可溶性、非融合性表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明表达产物的分子量约３３ｋＤａ,薄层扫描显示表达蛋白占菌体总蛋白的２０．７６％。Ｗｅｓｔｅｒｎ免疫印迹表明,表达产物能被抗ＨＲＰⅡ人工合成九肽单克隆抗体特异识别。结论恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在原核表达系统ｐＥＴ８ｃ／ＢＬ２１（ＤＥ３）中获得成功表达,为基因工程大规模制备生产ＨＲＰⅡ抗原奠定基础     

恶性疟原虫海南FCC1/HN株环子孢子蛋白(CSP)基因的克隆与表达

目的　为疟疾疫苗的研制提供靶抗原。方法　根据恶性疟原虫ＩＭＴＭ２２ 株７Ｇ８ 克隆环子孢子蛋白基因编码区序列, 设计一对引物, 采用ＰＣＲ技术从恶性疟原虫ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增ＣＳＰ基因的Ⅰ区、中央重复区和Ⅱ区片段, 全长１－０８ｋｂ; 纯化扩增产物用ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨ Ⅰ双酶切后, 定向克隆入ｐｃＤＮＡ３ 载体, 转化大肠杆菌ＴＧ１ 株, 重组克隆经筛选后, 用ＰＣＲ 扩增和ＨｉｎｄⅢ＋ ＢａｍＨ Ⅰ双酶切进行鉴定： 用磷酸钙贴壁细胞转化法将重组质粒ｐｃＤＮＡ—ＣＳＰ导入ＨｅＬａ细胞, 用Ｇ４１８ 筛选出稳定分泌ＣＳＰ抗原的阳性细胞克隆; 将阳性细胞克隆系扩大培养并用Ｇ４１８ 加压, 以表达重组ＣＳＰ, 分离细胞培养上清和培养细胞, 进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析。结果　（１） 从ＦＣＣ１／ＨＮ株基因组ＤＮＡ中特异扩增出ＣＳＰ基因Ⅰ区, 中央重复区和Ⅱ区编码序列;（２） 将扩增的目的片段正向插入ｐｃＤＮＡ３ＨｉｎｄⅢ和ＢａｍＨⅠ位点; （３） 在人宫颈癌细胞系ＨｅＬａ 细胞中表达重组ＣＳＰ抗原, 其分子量为３８－３ｋＤａ, 蛋白扫描分析表达量占细胞培养上清液中蛋白总含量的１５－７７％ 。结论　成功构建真核表达系统ｐｃＤＮＡ３     

恶性疟原虫FCC—1／HN株不同期基因重组质粒混合接种小鼠 …

寻找有效的抗恶性疟原虫混合基因疫苗，探讨其在宿主体内的免疫反应。将恶性疟原虫重组质粒ｐｃＤＮＡ３－ＥＢＡ１７５／ＨＲＰⅡ经骨肌途径单独注射或与有性期阶段的重组质粒ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆｓ２５混合注射免疫Ｂａｌｂ／ｃ小鼠。对小鼠的骨骼骨肌进行预处理，即于注射前７ｄ在左右肢肌四头肌注射０．５％盐酸布比卡因５０μｌ，注射深度为２ｍｍ。观察免疫后不同时间点小鼠血清ＩｇＧ抗体滴度、脾淋巴细胞增殖反应、ＣＤ＾＋／     

抗恶性疟原虫重组HRP—Ⅱ单克隆抗体的制备与鉴定

采用恶性疟原虫组富组氯酸蛋白Ⅱ（ＨＲＰ－ＩＩ）融合表达蛋免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠,取脾细胞与ＳＰ２／１０细胞融合,经３次ＥＬＩＳＡ筛选,共获得６株分泌抗恶性疟原虫 组ＨＲＰ－ＩＩ单克隆抗体的杂交瘤细胞株（１Ｂ１１、１Ｄ１０、２Ｅ７、３Ａ３、３Ｆ９、４Ｇ５）,用有限稀释法进行克隆,亚克隆及扩大培养,并用杂交瘤细胞经腹腔接种ＢＡＬＢ／ｃ小鼠制备腹水,６株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体（ＭｃＡｂ）经琼脂双扩散鉴     

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体, 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）, 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达, 将纯化的表达产物免疫接种小鼠, 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定, 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００;Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带;表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加, 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答, 并提高小鼠ＮＫ细胞活性的作用     

含日本血吸虫脂肪酸结合蛋白（SjFABPc）基因DNA重组质粒 …

目的 观察裸ＤＮＡ重组质粒ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ在体外转染ＨｅｐＧ２细胞以及质粒ＤＮＡ免疫鼠肌组织中的表达，为进一步应用该质粒进行ＤＮＡ免疫实验奠定基础。方法 用脂质体介导ＤＮＡ转染法将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ转染贴壁细胞ＨｅｐＧ２，Ｇ４１８加压筛选获得阳性克隆细胞并传代培养，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ鉴定目的基因在ＨｅｐＧ２细胞中的表达，将ｐＣＤ－ＳｊＦＡＢＰｃ质粒肌注免疫ＢＡＬＢ     

重组人肝再生增强因子原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 用聚合酶链反应法（ＰＣＲ）和基因重组技术构建重组人肝再生增强因子原核表达载体并在大肠杆菌中进行表达。方法 利用ＰＣＲ方法从我们构建的ＰＵＣ１９－ｈＡＬＲ质粒中扩增出带ＮｄｅⅠ和ＢａｍＨⅠ酶切位点的ｈＡＬＲ编码区ＤＮＡ。ＰＣＲ产物和质粒ｐＥＴ１１ａ分别被相应内切酶消化,然后被Ｔ４ ＤＮＡ连接酶连接以获取重组表达质粒。重组表达质粒ｐＥＴ１１ａ－ｈＡＬＲ经电转化入大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中,在Ｉ     

重组质粒pGEX—6P—1／Sj—FABPc的构建及在大肠杆菌中的表达

目的 构建基因工程菌株、获得重组蛋白Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ（日本血吸虫脂肪酸结合蛋白）。方法 用ＰＣＲ法从日本血吸虫ｃＤＮＡ文库中扩增Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ基因片段，再将该片段重组于ｐＧＥＭ－Ｔ中并进行ＤＮＡ测序鉴定，经酶切后将目的片段构建成重组质粒ｐＧＥＸ－６Ｐ－１／Ｓｊ－ＦＡＢＰｃ，转化于大肠杆菌ＢＬ２１，ＩＰＴＧ诱导表达。用Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ＾ＴＭ ４Ｂ亲和层析柱对表达产物进行纯     

乙型病毒S基因单独和与白细胞介素—12基因联合免疫小鼠诱生的体液免疫应

以ＰＣＲ技术扩增得到乙肝病毒表面抗原的编码基因,构建Ｓ基因真核表达载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋）－Ｓ。以ＰＣＲ方法扩增得到小鼠白细胞介素－１２的全长ｃＤＮＡ序列,构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３－ＩＬ－１２（以下简称ＩＬ－１２）。以Ｓ和Ｓ＋ＩＬ－１２经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠,以空载体ｐｃＤＮＡ３．１（＋为阴性对照,血源ＨＢｓＡｇ蛋白为阳性对照,用ＥＬＩＳＡ方法检测下同时间免疫小鼠血清中的抗０－ＨＢｓ     

弓形虫P30基因MBP融合蛋白的表达

目的　构建弓形虫主要表面抗原Ｐ３０ 基因的原核表达载体并在Ｅ－ｃｏｌｉ 中表达。方法　根据已发表的弓形虫Ｐ３０基因序列,自行设计合成一对引物并在引物５’端分别引入限制性内切酶ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从弓形虫ＲＨ 株基因组ＤＮＡ中扩增Ｐ３０ 基因片段,插入ｐＭＡＬＰ２ 质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａα感受态细胞,于氨苄ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,经过酶切及ＰＣＲ扩增鉴定重组子。将阳性重组子经ＩＰＴＧ诱导表达,ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果　从弓形虫ＲＨ 株ＤＮＡ中扩增出９７６ｂｐ 的Ｐ３０ 基因,构建成功ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒;ＳＤＳ－ ＰＡＧＥ电泳及Ｗｅｓｔｅｒｎ － ｂｌｏｔ 显示ＭＢＰ／Ｐ３０ 融合蛋白条带的分子量约为７７－５ｋＤ,减去ＭＢＰ的分子量４３ｋＤ,得出Ｐ３０ 蛋白分子量为３４－５ｋＤ,且能被弓形虫高免鼠血清识别。结论　从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取Ｐ３０ 基因,并成功构建ｐＭＡＬＰ２ － Ｐ３０ 重组质粒,诱导表达了Ｐ３０ 的融合蛋白。为进一步Ｐ３０ 蛋白的分离纯化及其对动物的免疫原性研究作好准备。     

恶性疟原虫组氨酸富集蛋白II抗原基因在大肠杆菌中的表达 …

目的 恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ（ＨＲＰⅡ）是疟原虫红内期生活史过程中从感染红细胞分泌至血浆中的水溶性抗原,是重要的诊断用抗原。本文通过实现恶性疟原虫ＨＲＰⅡ在大肠杆菌中的表达,为研制用于疟疾诊断的抗ＨＲＰⅡ单克隆抗体奠定基础。方法 将含有ＨＲＰⅡ抗原基因的重组表达质粒ＨＲＰⅡ／ｐＥＴ８ｃ用钙法转化大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）,重组子经聚合酶链反应（ＰＣＲ）和ＢａｍＨＩ与ＢｇｌⅡ双酶切鉴定。重组子Ｈ     

甲胎蛋白增强子—白蛋白白启动子联合转录调控序列的克隆

目的 克隆人肝癌细胞转异的甲脂蛋白增强子（ＥＡＦＰ）－白蛋白启动子（ＰＡＬＢ）联合转录调控序列。方法 用聚合酶链反应（ＰＣＲ）和分子克隆方法，从人染色体基因组中扩增白蛋白启动子，将其融合到甲脂蛋白增强子的下游、此融合序列与白细胞介素－２（ＩＬ－２）ｃＤＮＡ连接，定向克隆人真核表达质粒ｐｃＤＮＡ－３的多克隆位点区。用磷酸钙共沉淀法将质粒转染ＨｅｐＧ２和ＨｅＬａ细胞，用ＭＴＳ／ＰＭＳ法测定细胞培养液中     

乙型肝炎病毒X基因的表达产物对HLA-DR表达的效应

为了解ＨＢＶＸ基因表达产物对ＨＬＡ ＤＲ表达的效应 ,构建带Ｘ基因的重组表达载体 ,研究其在体外肝癌细胞中的表达及其对ＨＬＡ ＤＲ表达的影响。用野生型ＨＢＶＸ基因与真核载体质粒构建重组表达载体质粒 ｐＷＨＸⅡ转染ＨｅｐＧ2细胞。用ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ印迹、ＥＬＩＳＡ及Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹等分析鉴定目的基因ＤＮＡ片段与其在转染细胞中的表达产物ＨＢＶＸ蛋白。将带重组质粒 ｐＷＨＸⅡ的ＨｅｐＧ2细胞和带有ＨＢＶ全基因组的 2 .2 .15细胞 ,在相同条件下用间接免疫荧光分析和免疫酶细胞化学技术检测 ,均清晰地显示在肝细…     

编码弓形虫ROP1蛋白基因的体外扩增、克隆及在E.coli中的表达

目的构建弓形虫棒状体蛋白（ＲＯＰ１）基因重组质粒并在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达。方法用ＲＨ株接种小鼠,收集腹水,纯化速殖子,抽提基因组ＤＮＡ;据ＲＯＰ１基因序列设计合成一对引物,将上、下游引物分别引入ＥｃｏＲＩ,ＢａｍＨＩ酶切位点,用ＰＣＲ技术从ＲＨ株基因组ＤＮＡ中扩增编码ＲＯＰ１的基因片段,插入ｐＢＶ２２０质粒,转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞,于氨苄阳性ＬＢ培养平板上筛选阳性克隆,酶切鉴定;经温度诱导在Ｅ．ｃｏｌｉ中表达,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及免疫印迹分析。结果ＲＯＰ１基因体外扩增产物大小与预期值相符,约７５６ｂｐ;构建成功ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒;ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹显示特异蛋白条带的分子量约４３ｋＤ,表达产量约占菌体蛋白１３．２３％。结论从弓形虫基因组ＤＮＡ中获取ＲＯＰ１基因,并成功构建ｐＢＶ２２０－ＲＯＰ１重组质粒,诱导表达ＲＯＰ１非融合蛋白,为进一步分离纯化、用于对弓形虫侵入机制及免疫特性的研究做好准备。     

HLA—II类基因与红斑狼疮自身抗体相关性研究

目的 分析ＨＬＡ－Ⅱ类等位基因与自身抗体的相关性,探讨系统性红斑狼疮的自身抗体反应类型。方法 应用聚合酶链反应／序列特异寡核苷酸探针杂交（ＰＣＲ－ＳＳＯＰＨ）检测技术对１１３例确诊ＳＬＥ病人进行ＨＬＡ－ＤＲ、ＤＱＡ１和ＤＱＢ１基因分型。结果 抗ｄｓＤＮＡ与ＤＱＢ１＊１６０１和ＤＲＢ３＊０３０１负相关;ＡＮＡ与ＤＲＢ３＊０２０２和ＤＱＡ１＊０５０１正相关;抗ＲＮＰ与ＤＱＡ１＊０３０１正相关,与ＤＱＡ     

弓形虫侵入相关分子ROP1在HepG—2细胞中的表达

弓形虫棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）是与早体侵入相关的重要分子。将含编码ＰＯＰ１蛋白基因的真核表达重组质粒ｐｃＤＮＡ３转梁ＨｅｐＧ－２细胞，为进一步研究做准备，用脂质体介导的真核细胞转梁法，Ｇ４１８筛选阳性克隆，ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ分析鉴定表达产物。结果显示，在所选的克隆化生长的细胞裂解样品电泳图谱中，有一大小约３５～４０ｋＤａ的特异电泳条带，该条带可被弓形虫免疫血清识别，本研究建     

在大肠杆菌中高效表达人I型免疫缺陷病毒p24蛋白

目的 表达人Ｉ型免疫缺陷病毒（ＨＩＶ－１）衣壳蛋白ｐ２４，为制备抗ｐ２４单克隆抗体及其诊断抗原奠定基础。方法 将编码ＨＩＶ－１ｐ２４蛋白的ｐ２４＾ｇａｇ基因片段，克隆到原核表达载体ｐＥＴ－１７ｂ的Ｔ７噬菌体启动子下游，构建重组表达质粒，转化大肠肝菌ＢＬ２（ＤＥ３），ＩＰＴＧ诱导表达，表达产物以ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ及点免疫印迹分析，结果 构建成功重组表达质粒ｐＥＴ２４经Ｉ