弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究

目的　用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠, 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法　大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ, 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度; 免疫鼠血液组织 Ｐ３０ 基因 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增; 弓形虫攻击感染。结果　用 Ｅ Ｌ Ｉ Ａ Ｓ 法检测的抗体 Ｉｇ Ｇ 滴度１∶２５６０ , 免疫后３ 周及６ 个月从免疫鼠血液组织中检测到 Ｐ３０ 基因;攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（ Ｐ＜ ００５） , 结论　重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠可诱导一定的体液免疫应答, 对抗攻击感染具有一定的保护性。     

弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导体液免疫应答及保护性的初步观察

目的观察弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫BALB/c小鼠诱导其体内产生的体液免疫应答及抗虫感染的免疫保护作用. 方法重组质粒pBK-P30用生理盐水稀释后,肌注免疫BALB/c小鼠.分别于免疫后5周和10周,ELISA测定IgG抗体滴度;取免疫鼠的血液、肺、心脏、肝脏、脾、肾脏及肌肉PCR扩增P30基因;免疫鼠腹腔注射弓形虫速殖子攻击感染.结果两次检测,均可测到特异性IgG抗体,且抗体的滴度随免疫时间的延长而增高;免疫后5周,免疫鼠的上述组织均可扩增出P30基因条带,但免疫后10周仅血液扩增出特异P30基因条带;弓形虫速殖子腹腔攻击感染,免疫组鼠的平均存活时间较对照组鼠延长,但统计学差异不显著(P＞0.05). 结论弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生特异性体液免疫应答及部分抗虫免疫保护作用.     

弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究

目的观察弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答.方法大量制备重组真核表达质粒pBK-P30,用生理盐水(NS)稀释至1 μg/μl,1次肌注免疫BALB/c小鼠,分别在免疫后5和10周,通过ConA刺激,MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率;使用间接免疫荧光法,用流式细胞仪对CD4+、CDs+T细胞亚群进行测定.结果ConA刺激小鼠脾T淋巴细胞发生增殖反应,pBK-P30免疫组与两对照组及对照组之间的差异均无显著性(P＞0.05).T细胞亚群CD4+、CD8+动态分析,CD4+T细胞在各组增殖均不明显(P＞0.05),但免疫组CDs+细胞数量升高,CD4+/CDs+比率下降,与空质粒pBK-CMV对照组和NS对照组之间差异均有显著性(P＜0.05,P＜0.01),pBK-CMV对照组与NS对照组之间差异也有显著性(P＜0.01).免疫后10周,与NS对照组相比较,免疫组和pBK-CMV对照组CDs+细胞仍升高(P＜0.01),但它们之间的差异无显著性(P＞0.05).结论弓形虫表面抗原P30 DNA疫苗能诱导BALB/c小鼠产生一定的细胞免疫应答.     

弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导的细胞免疫应答

目的用pcDNA_3－P30真核表达质粒直接免疫小鼠,观察所诱导的小鼠细胞免疫应答。方法大量制备量级质粒pcDNA_3－P30,经肌肉注射BALB／c小鼠,每隔3周接种1次,一共免疫3次。用MTT方法对脾脏的NK杀伤细胞率和淋巴细胞的转化率进行测定,采用免疫荧光法对CD4 、CD8 细胞进行测定。结果实验组NK细胞杀伤率为：70．0％±3．64,对照组及空白对照组分别为48．5％±6．06和470％±5．93,实验组NK细胞活性比对照组明显增高（P＜0．05）;ConA刺激小鼠淋巴细胞转化实验,实验组与对照组及空白对用级差异无显著性（P＞0．05）;对T淋巴细胞亚群CD4＋、CD8＋进行动态分析,可见随着感染时间的延长,CD8＋的数量逐渐上升,CD4＋／CD8＋的比率逐渐下降,实验组与对照组及空白对照有明显差异（P＜0．05）。结论重组质粒pcDNA3-p30免疫BALB／c小鼠可诱导一定的细胞免疫。     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫Ｐ３０蛋白,采用定向克隆的方法,自行设计引物通过ＰＣＲ扩增得到Ｐ３０基因片段,用ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切后,连接到同样酸切的原核表达载体（ｐＢＶ２２０和ｐＭＡＬＰ２）上,转化大肠杆菌ＤＨ５α,分别得到含重组闰ｐＢＶ２２０－Ｐ３０和ｐＭＡＬＰ２－Ｐ３０的工程菌,扩菌提取质粒经过酶切分析和ＰＣＲ扩增鉴定后,证实Ｐ３０基因的两个原核表达载体构建成功,为其在原核系统中的表达作     

弓形虫表面抗原P30DNA疫苗免疫小鼠诱导细胞免疫应答的研究

目的 观察弓形虫表面抗原P30DNA疫苗诱导小鼠产生的细胞免疫应答。方法 大量制备重组真核表达质粒pBK-P30,用生理盐水（NS）稀释至1μg/μl,1次肌注免疫BALB／c小鼠,分别在免疫后5和10周,通过ConA刺激,MTT法测定免疫鼠脾脏T淋巴细胞转化率;使用间接免疫荧光法,用流式细胞仪对CD4^ 、CD8^ T细胞亚群进行测定。结果 ConA刺激小鼠脾T淋巴细胞发生增殖反应,pBK-P30免疫组与对两对照组及对照组之间的差异均无显著性（P＞0．05）。T细胞亚群CD4^ 、CD8^ 动态分析,CD4^ T细胞在各组增殖均不明显（P＞0．05）,但免疫组CD8^ 细胞数量升高,CD4^ /CD8^ 比率下降,与空质粒pBK-CMV对照组和NS对照组之间差异均有显著性（P＜0．05,P＜0．01）,pBK-CMV对照组与NS对照组之间差异也有显著性（P＜0．01）。免疫后10周,与NS对照组相比较,免疫组和pBK-CMV对照组CD8^ 细胞仍升高（P＜0．01）,但它们之间的差异无显著性（P＞0．05）。结论 弓形虫表面抗原P30DNA疫苗能诱导BALB／c小鼠产生一定的细胞免疫应答。     

弓形虫表面抗原SAG3基因和IL-2基因佐剂混合诱导小鼠免疫应答研究

目的了解编码SAG3的重组质粒和IL-2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应,为进一步的核酸疫苗及免疫学研究创造条件。方法将编码SAG3的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100μg的剂量感染小鼠,3周中两次以相同的剂量加强免疫,分别以PBS和空质粒pcDNA3.1感染。采用ELISA法测定抗体水平、亚型、IFN-γI、L-4和IL-2的含量,RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录,所有鼠均由强毒力ZS2株弓形虫感染。结果SAG3表达质粒3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显上升,IL-2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次免疫15天后,目的基因在肌肉组织中仍有表达;混合质粒注射和小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论由SAG3 DNA诱导的免疫应答因IL-2表达质粒的共同注射而增强,DNA疫苗和适当细胞因子的共注射对抵抗弓形虫感染的效果值得进一步研究。     

弓形虫主要表面抗原P30的研究进展

弓形虫主要表面抗原Ｐ_（３０）的研究进展郝文波综述沈继龙余新炳审校弓形虫是一种世界性分布的寄生原虫，能引起弓形虫病，该病常致早产、流产、畸胎，在诸如艾滋病病人、恶性肿瘤患者、长期应用免疫抑制剂治疗的病人等免疫功能严重受损者，弓形虫是引发致死性病变的主?..     

旋毛虫DNA疫苗诱导小鼠免疫应答的研究

目的　观察旋毛虫DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答。方法　将旋毛虫肌幼虫编码 31kDa抗原结构基因真核表达质粒pcDNA3-TspE1分别用肌肉注射和基因枪免疫BALB/c小鼠 ,免疫血清用旋毛虫肌幼虫冰冻切片及石蜡切片抗原进行IFAT检测 ,并用旋毛虫肌幼虫可溶性抗原进行Westernblot分析。结果　IFAT表明 pcDNA3-TspE1接种BALB/c小鼠后产生的免疫血清与旋毛虫肌幼虫可产生阳性反应 ,在肌幼虫冰冻及石蜡切片上均显示黄绿色荧光。Westernblot检测结果显示 ,pcDNA3-TspE1接种小鼠后产生的免疫血清只能识别旋毛虫肌幼虫可溶性抗原中的 31kDa抗原组分 ,而 pcDNA3质粒接种小鼠后的血清不能与旋毛虫肌幼虫可溶性抗原发生免疫反应。结论　旋毛虫DNA疫苗 pcDNA3-TspE1能够诱导小鼠产生特异性体液免疫应答。     

弓形虫P30基因重组质粒的构建及其免疫效果

目的　通过构建含弓形虫P30不同表达形式 (膜型、分泌型及细胞内型 )的重组质粒 ,并将其用于免疫小鼠 ,测定抗体水平 ,以期初步筛选出一种对弓形虫感染具有良好保护作用的核酸疫苗。　方法　利用PCR技术和亚克隆技术分别构建弓形虫表膜型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,包括信号肽及疏水尾 )pcDNA3 P30Mb ,分泌型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,不包括疏水尾 )pcDNA3 P30Se以及细胞内型P30基因重组质粒 (含完整的P30编码序列 ,但不包括信号肽 )pcDNA3 P30In。将以上 3种重组质粒分别与脂质体混合后免疫小鼠 ,ELISA及免疫印迹测定小鼠血清中特异的IgG抗体。　结果　成功构建了弓形虫P30基因 3种表达形式的重组质粒 ,经双酶切鉴定及DNA序列测定 ,3种重组质粒中的插入片段确为P30的编码基因 ,且读码框架正确 ;抗体测定显示 :3个免疫组均能诱导小鼠产生特异的IgG抗体 ,但各组之间IgG出现的时间及强度有一定的差异。　结论　用编码弓形虫P30抗原的重组质粒进行核酸免疫 ,能诱导免疫小鼠产生特异性的IgG抗体 ;膜型及分泌型免疫小鼠的特异IgG抗体出现的时间早于细胞内型免疫鼠 ,但 4wk后 3组间差异无显著性。     

弓形虫ROP5基因与基因佐剂IL-12对小鼠免疫保护性

目的 观察弓形虫ROP5基因疫苗和基因免疫佐剂IL-12共免疫对昆明小鼠所诱导的免疫保护性。方法 大量制备重组质粒pcROP5和pcmIL-12,以100 μg的剂量同时免疫昆明小鼠,PBS组和pcDNA3.1空质粒组作为对照。用ELISA法测定免疫鼠血清中特异性抗体IgG、IgG亚型的表达水平及细胞因子IFN-γ、IL-4的含量,MTT法测定淋巴细胞转化率,观察小鼠受攻击感染弓形虫后的存活时间。结果 质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫小鼠3次后,与pcROP5质粒单独免疫组和对照组相比,IL-12基因佐剂的共免疫提高了免疫鼠血清中特异性抗体IgG及IgG亚型IgG2a的表达水平,提高了细胞因子IFN-γ的含量,增加了淋巴细胞的转化率,但IgG1和IL-4的表达水平变化不大;攻击感染后,质粒pcROP5和pcmIL-12共免疫组小鼠存活时间显著延长。结论 弓形虫ROP5基因与基因佐剂pcmIL-12共免疫能增强对小鼠的免疫保护性。     

恶性疟原虫Pf12基因重组质粒DNA接种诱导小鼠的免疫应答

目的　观察重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠所产生的免疫应答 ,分析Pf12基因的抗原性和作为疫苗抗原候选分子的可能性。方法　构建重组质粒VR10 12 -Pf12 ,直接免疫BALB/c小鼠 ,通过NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平、ELISA、体外抑虫试验测定 ,观察其诱导的细胞和体液应答以及体外抑虫效果。结果　重组质粒VR10 12 -Pf12免疫BALB/c小鼠 ,NK细胞杀伤活性、脾T淋巴细胞增殖水平明显高于对照组 (P <0 0 1) ,诱导小鼠产生的抗体水平明显增高 (P <0 0 1) ,免疫血清在体外能抑制恶性疟原虫的生长、发育。结论　重组质粒VR10 12 -Pf12DNA直接免疫接种诱导BALB/c小鼠产生一定水平的体液和细胞免疫应答 ,其免疫血清在体外对恶性疟原虫的生长、发育有明显的抑制作用。     

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究：I.pcDNA3 …

目的 构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒,为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法 用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段,重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应,亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体,再经含氨苄ＬＢ培养基筛选,酶切、ＰＣＲ鉴定。结果 从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出     

乙型肝炎病毒基因疫苗诱导小鼠产生免疫应答的效应

目的 :构建编码乙型肝炎病毒 (HBV)表面蛋白S的重组质粒pCR 3 .1 S,将之直接肌肉注射balb/c小鼠 ,观察小鼠HBV特异的免疫应答。方法 :以ELISA法检测小鼠血清 ,3H TdR掺入法测定淋巴细胞增殖 ,51 Cr 4h释放法检测淋巴细胞杀伤功能。结果 :与空载体对照组相比较 ,基因疫苗诱发小鼠产生良好的抗HBs反应及HBV特异的细胞免疫应答 (P <0 .0 5)。结论 :基因疫苗pCR 3 .1 S可诱导balb/c小鼠产生全面的免疫应答     

乙型肝炎病毒全S基因疫苗与HBSAg基因疫苗诱导小鼠的特异性免疫应答比较

乙型肝炎病毒 (ＨＢＶ)感染是我国常见病及多发病 ,ＨＢＶ难以清除的原因之一就是机体的免疫功能障碍。目前虽然基因重组ＨＢＶ表面抗原 (ＨＢｓＡｇ)疫苗预防ＨＢＶ感染取得了较好的效果 ,但基因重组ＨＢｓＡｇ疫苗主要诱导特异性体液免疫 ,不能刺激机体的细胞免疫应答。近年来发现基因疫苗可诱导机体产生细胞及体液免疫反应 ,特别是诱导细胞免疫反应的能力优于蛋白、多肽类疫苗 ,更适应于慢性病毒感染的预防与治疗[1,2 ] 。为了探讨应用ＨＢＶ基因疫苗预防ＨＢＶ感染的可能性 ,我们构建了ＨＢＶ全Ｓ基因和ＨＢｓＡｇ基因疫苗 ,观察和比较…     

恶性疟原虫CSP基因重组蛋白及DNA免疫诱导小鼠体液免疫应答比较

本文利用恶性疟原虫FCC1/HN株环子孢子蛋白 (PfCSP)基因DNA质粒通过不同途径、不同剂量免疫小鼠 ,观察其产生的体液免疫应答反应 ,并将其与相应的重组表达蛋白疫苗进行比较。结果显示 :DNA免疫刺激机体产生抗体反应强度的免疫途径依次为肌肉、静脉和皮下 ;宿主对DNA免疫存在一定的剂量依赖性 ;ELISA和Dot -ELISA检测免疫后 4周和 7周 ,DNA质粒组刺激机体产生抗体的滴度均显著低于相应的重组蛋白组。表明PfCSPDNA疫苗与重组表达蛋白疫苗均可刺激小鼠产生特异性体液免疫应答 ,但前者诱导高滴度的抗体反应需要更长的时间     

弓形虫P30基因原核表达载体的构建

为获取具有生物学活性的弓形虫 P30蛋白 ,采用定向克隆的方法 ,自行设计引物通过 PCR扩增得到 P30基因片段 ,用 Eco R 和 Sal 双酶切后 ,连接到同样双酶切的原核表达载体 (p BV2 2 0和 p MAL P2 )上 ,转化大肠杆菌 DH5 α,分别得到含重组质粒 p BV2 2 0 - P30和 p MAL P2 - P30的工程菌。扩菌提取质粒经过酶切分析和 PCR扩增鉴定后 ,证实 P30基因的两个原核表达载体构建成功 ,为其在原核系统中的表达作准备     

含弓形虫P30基因插入昆虫杆状病毒的研究

目的：将弓形虫ＺＳ１株主要表膜抗原（Ｐ３０）基因插入到昆虫杆状病毒基因组中，为在昆虫细胞或昆虫体内表达及生产Ｐ３０作准备。方法：先将Ｐ３０基因亚克隆到转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，然后用此重组载体质粒ＤＮＡ与亲本株病毒ＤＮＡ共转染培养的草地夜蛾细胞，经空斑纯化筛选出重组病毒株。结果：已得到含Ｐ３０基因的重组杆状病毒ＴｎＮＰＶ－Ｐ３０。结论：本文已将弓形虫ＺＳ１株Ｐ３０基因亚克隆到昆虫杆状病毒ＴｎＮＰＶ中。