重组梅毒螺旋体抗原的研究进展

在梅毒螺旋体人工培养尚未获得成功的情况下,基因克隆技术的出现为该病原体的研究开辟了一条新的途径。应用基因工程技术目前已制备出多种重组梅毒螺旋体抗原,这些抗原的制备对梅毒发病机理的探讨,疫苗的研制,以及血清学诊断试验的建立与应用具有重要意义,为梅毒的预防和控制提供了更加有效的手段。     

重组梅毒螺旋体抗原的研究进展

在梅毒螺旋体人工培养尚未获得成功的情况下,基因克隆(即DNA重组)技术的出现为该病原体的研究开辟了一条新的途径。应用基因工程技术目前已制备出多种重组梅毒螺旋体抗原,这些抗原的制备对梅毒发病机理的探讨、疫苗的研制、以及血清学诊断试验的建立与应用具有重要意义,为梅毒的预防和控制提供了更加有效的手段。     

4种以重组梅毒螺旋体抗原为基础的梅毒快速诊断试验的临床评价

目的：评估4种以重组梅毒螺旋体抗原为基础的梅毒快速诊断试剂盒的敏感性和特异性,及其在临床应用中的可操作性。方法：选择860例性传播疾病（STD）门诊患者,签署知情同意书并采集其静脉血。分别取全血和血清进行梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）及4种试剂盒的检测。检测方法分别按照说明书进行。结果：以TPHA为标准,结果分别为：①Abbott Determine Syphilis TP test：血清敏感性为100％,特异性为98、9％;全血敏感性为81．9％,特异性为99．4％。②SDBIOLINE Syphilis 3．0 test：血清敏感性为95．5％,特异性为97．9％;全血敏感性为87．6％,特异性为99．4％。③VISITECT-SYPHILIS test：血清敏感性为94．0％,特异性为98．1％;全血敏感性为73．5％,特异性为99．7％。④Syphicheck-WB test：血清敏感性为67．4％,特异性为98．8％：全血敏感性为64．0％,特异性为99．7％。结论：4种试剂盒均具有优良的临床操作性能,适用于STD门诊的梅毒快速检测。而且这4种快速诊断试剂盒在血清中的检测比全血具有更高的敏感性。     

用蛋白印迹技术初步评价重组梅毒螺旋体抗原的反应性

目的：初步分析重组梅毒螺旋体抗原对梅毒螺旋体抗体的反应性。方法：用蛋白印迹技术检测与麦芽糖结合蛋白（MBP）融合的2种重组梅毒螺旋体蛋白（rTP47和rTP17)与二期梅毒患者血清的反应性。结果：30份二期梅毒患者血清均与MBP－rTP47和MBP－rTP17反应,反应强度与RPR试验测定的血清滴度无绝对一致性,但MBP－rTP17与二期梅毒患者血清的反应强于MBP－rTP47,30份正常人血清均不与MBP－rTP47和MBP－rTP17反应。结论：MBP－rTP47和MBP－rTP17对二期梅毒患者血清的反应性较强。     

胶体金法检测梅毒螺旋体特异性抗体的初步观察

检测梅毒螺旋体抗体有两种,一种是检测非特异性抗体,另一种是检测其特异性抗体。目前胶体金标记金黄色葡萄球菌Ａ蛋白(ＳＰＡ)法检测梅毒螺旋体非特异性抗体已见报道[1]。我们采用基因重组梅毒螺旋体抗原点样于醋酸纤维薄膜上、胶体金标记ＳＰＡ快速检测血清中梅毒螺旋体特异性抗体,现将结果报道如下。一、材料和方法1.梅毒螺旋体特异性抗原的制备:选用公认的42000膜蛋白(ＴｍｐＡ)作为梅毒螺旋体特异性抗原[2,3],聚合酶链反应(ＰＣＲ)人工合成或者将其基因片段植入大肠埃希菌内大量合成其ＴｍｐＡ蛋白,本抗原及醋酸纤维薄膜由Ｔｒｉｃｏｎ…     

基因工程技术制备梅毒螺旋体重组抗原的研究

目的 用基因工程技术制备梅毒螺旋体特异蛋白抗原,以梅毒螺旋体不能体外培养而难以获得足量的纯梅毒螺旋体特蛋白抗原的难题。方法 以PCR技术克隆出目的基因,重组后通过DNA序列测定验证重组质粒中连结有目的基因片段;以pMAL^TM-e2为质粒载体,TB1大肠杆菌为宿主菌进行目的基因的转化、诱导和表达,并对表达产物进行蛋白印迹试验检测其血清学活性。结果 PCR克隆出梅毒螺旋体15000、17000以及47000蛋白的基因克隆,其中梅毒螺旋体17000以及47000在TB1大肠杆菌中得到稳定的表达,且表达产物显示与梅毒患者血清有非常特异的血清学反应。结论 梅毒螺旋体之目的基因在大肠杆菌中得到了成功表达,并具特异的血清学活性,从而为建立为国产化梅毒血清学诊断的新方法奠定了基础。     

胶体金法检测梅毒特异性抗体

目的：探讨梅毒螺旋体特异性抗体胶体金法（TPAb)对梅毒诊断的实用性和优越性。方法：用TPAb法对梅毒患者，非梅毒患者血清进行检测，同时与快速血浆反应素试验（RPR）和梅毒螺旋体血凝试验（TPHA）相比较。结果：TPAb法检测一期梅毒21例敏感性为71.43%，高于RPR法（57.14%)及TPHA法（66.67%)；二期梅毒64例，TPAb法及TPHA法检测敏感性均为100%，高于RPR法（92.19%)，同时对125例非梅毒患者血清进行了检测，结果全部阴性，特异性为100%。结论：TPAb法具有较高敏感性和特异性而且简单、方便、快速，适用于各期梅毒的诊断。     

梅毒螺旋体Gpd重组蛋白的表达

随着基因工程技术的迅速发展和梅毒螺旋体(Tp)全基因序列的解析^[1],通过重组技术已制备多种重组Tp抗原,并被广泛应用于梅毒血清学检测的研究和试剂盒的开发^[2-5],但对于哪一种Tp蛋白抗原在临床各期梅毒的血清学诊断中具有更高的特异性和敏感性尚无一致观点。我们应用软件筛选分析,选取抗原性较强的Tp外膜蛋白GPd进行克隆表达,并以重组蛋白为包被抗原,建立间接ELISA法,评价其在梅毒血清学诊断中的应用价值。     

梅毒螺旋体重复基因K与梅毒持续感染

近年来,全球梅毒发病率呈现上升趋势。梅毒螺旋体（ Tp）作为梅毒的致病病原体,可引起宿主慢性持续感染。 Tp是如何出现抗原变异从而逃避宿主免疫识别,最终导致持续感染正成为近年研究热点。 Tp重复基因K（ tprK）作为Tp重复基因（ tpr）家族成员之一,由于其基因序列具有高度可变性,在Tp逃避宿主免疫监视、造成慢性感染中发挥重要作用。本文从tprK来源、基因结构特点、抗原变异和免疫逃逸机制及研究应用等方面对其进行综述。     

梅毒免疫和梅毒螺旋体的研究进展

梅毒螺旋体有着独特的基因和蛋白结构,对其基因分型有利于梅毒分子流行病学的研究.梅毒螺旋体缺乏脂多糖与外膜蛋白,但可表达多种脂蛋白,这些脂蛋白同梅毒螺旋体的组织黏附及播散有关,同时可诱导机体发生免疫应答.机体对于梅毒螺旋体的免疫应答过程十分复杂,固有免疫、体液免疫及细胞免疫均在梅毒螺旋体的感染过程中参与了应答过程.Th1型细胞免疫在梅毒的发生发展过程中起重要作用,梅毒患者在局部及系统免疫方面都存在细胞免疫的异常.     

应用胶体金免疫层析技术快速检测杜克雷嗜血杆菌方法的建立

目的建立快速检测杜克雷嗜血杆菌的胶体金免疫层析试验(GICA)系统。方法采用胶体金颗粒标记抗rHgbA-IgG抗体,制备出免疫胶体金;采用双抗体夹心模式建立适用于杜克雷嗜血杆菌检测的胶体金免疫层析技术;以ELISA试验作为平行对照,对其检测的灵敏度及特异性进行评价。结果以该方法检测杜克雷嗜血杆菌、流感嗜血杆菌以及其他7种生殖器溃疡相关细菌,杜克雷嗜血杆菌显示强阳性,其余8种均为阴性,无交叉反应发生,GICA与ELISA实验结果相符合;GICA和ELISA检测灵敏度分别为:纯化抗原实验GICA为6.25ng/mL,ELISA为1.56ng/mL;细菌学实验GICA为2×106cfu/mL,ELISA为2×105cfu/mL;模拟样本检测实验GICA为1×107cfu/mL,ELISA为1×106cfu/mL。GICA能在15min内完成检测,稳定性良好。结论建立的检测杜克雷嗜血杆菌的GICA系统能够特异、快速检测杜克雷嗜血杆菌。该检测系统的灵敏度还不能满足所有临床标本的需要,有待于进一步研究。     

梅毒螺旋体优势表位抗原嵌合表达构建双抗原夹心法的研究

目的用基因工程方法表达嵌合的梅毒螺旋体优势表位抗原,建立检测血清梅毒抗体的双抗原夹心酶联免疫方法。方法通过计算机软件分析选择梅毒螺旋体优势抗原表位,用聚合酶链反应(PCR)扩增优势表位基因,构建了梅毒螺旋体多优势表位嵌合抗原(rTpN15-TpN17-TpN47)表达载体,转化宿主菌BL21(DE3)进行表达,亲和层析柱法纯化获得高纯度融合抗原,并用其建立检测梅毒抗体的DAS-EIA。结果表达的优势表位嵌合抗原具有很好的抗原性。用其建立的嵌合抗原DAS-EIA检测确诊的50份阳性和30份阴性血清,阳性检出率和阴性检出率都是100%。结论嵌合抗原DAS-EIA法具有比间接EIA和重组单抗原DAS-EIA更高的灵敏度和检出正确率,其检测水平已经达到国外TPHA的水平,该方法的建立为临床检测梅毒开辟了新的领域。     

Wondfo沙眼衣原体免疫层析法试剂盒临床应用评价

目的:评价wondfo沙眼衣原体免疫层析法试剂盒灵敏度、特异性和用于泌尿生殖道沙眼衣原体检测的意义.方法:采用与已上市同类产品ClearView试剂盒同步盲法检测泌尿生殖道沙眼衣原体抗原,两法结果不一致时采用直接免疫荧光法DFA确证.以两种试剂盒均阳性或经DFA确证阳性的结果作为真阳性,计算wondfo试剂盒的灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值.结果:共检测1026例样本(630份女性宫颈拭子和396份男性尿道拭子),真阳性92例,真阴性934例.wondfo和ClearView检测结果均阳性83例,均为阴性930例,13例结果不符的样本经DFA复检9例为阳性,其中3例ClearView结果阳性wondfo结果阴性的样本DFA复检为阳性;10例ClearView结果为阴性wondfo结果为阳性的样本DFA复检6例为阳性.两试剂盒检测结果符合率为98.64%.Wondfo试剂盒灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为96.74%,99.6%,95.7%, 99.68%.对3株标准株及2株临床株倍比稀释检测,wondfo试剂盒的最低检出量约为25～50 IFU/μL.结论:wondfo沙眼衣原体层析法检测试剂盒检测CT有较高的敏感性和特异性,可为临床治疗和性病监测工作提供可靠依据.     

酶联免疫吸附法和免疫印迹技术检测天疱疮抗体的比较

目的比较酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫印迹技术(IBT)检测天疱疮抗体的临床应用价值。方法对23例天疱疮患者(PV13例,PF10例)及10例正常对照者行ELISA检测血清中抗桥粒芯糖蛋白(Dsg)1和Dsg3抗体滴度;并用正常包皮分离表皮后提取的蛋白为底物行IBT检测,并与ELISA方法进行比较。结果两种方法阳性率均为91.30%,两种方法对PV和PF抗体的检测差异无统计学意义(P=0.400和1.000)。结论 ELISA和IBT在天疱疮的实验室诊断中均有重要价值,ELISA方法更简便、迅速。     

基于TP0136蛋白异质性建立一种新的苍白密螺旋体分子分型方法

【摘要】 目的 基于苍白密螺旋体属（TP）TP0136蛋白的异质性,建立一种新的TP分子分型方法。方法 从GenBank中查询9株梅毒苍白密螺旋体（TPA）、3株雅司苍白密螺旋体（TPE）、1株未分类的类人猿密螺旋体（FB）和1株地方密螺旋体（TEN）的TP0136开放阅读框（ORF）氨基酸序列并进行多重序列比对,得出TP0136蛋白分子分型结果。利用建立的TP0136蛋白分子分型方法,对2015年 1月至2018年12月南方医科大学皮肤病医院收集的23株TPA临床分离株进行分类,并将分型结果与传统的Arp/ Tpr/ TP0548三基因分型方法进行比较。结果 TP0136蛋白在不同种TP株中具有高度异质性,根据TP0136氨基酸序列,TPE、FB和TEN分为Ⅰ~ Ⅳ 4个亚型,TPA分为Ⅴ~ Ⅹ 6个亚型,TPA临床株分为Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ 4个亚型。通过TPA传统的三基因分型方法可将23株TPA临床株分为13D/d、14D/f、14D/g、15D/f、16A/e 5型。将TP0136分型法与传统分型法相结合,可将上述临床株进一步细分为10型,其中14D/f型应用TP0136分型法可进一步分为3个亚型。结论 TP0136分子分型方法可用于TP种的区分,有助于传统TPA分子分型的进一步完善。     

聚合酶链反应和直接免疫荧光法检测沙眼衣原体感染的方法比较

沙眼衣原体所致泌尿生殖道感染是最常见的性传播疾病之一。对１１０例患者进行聚合酶链反应（ＰＣＲ）与直接免疫荧光法（ＤＦＡ）检测，比较二者在临床检测中的优缺点。ＰＣＲ引物为主要外膜蛋白基因片段，阳性６５例（５９１％），阴性４５例（４０９％）。ＤＦＡ阳性４３例（３９１％），阴性６７例（６０９％），ＰＣＲ和ＤＦＡ阳性率有显著性差异（Ｐ＜００１），病程长短对ＰＣＲ阳性率无明显影响（Ｐ＞００５），病程长短对ＤＦＡ阳性率有显著影响（Ｐ＜００１），病程长者ＤＦＡ阳性率低。ＰＣＲ特别适用于临床中病程长且ＤＦＡ阴性患者。     

19S-IgM-TPPA试验诊断先天梅毒评价

目的:评价血清19S-IgM-梅毒螺旋体明胶颗粒凝集试验(19S-IgM-TPPA)诊断早期先天梅毒的应用价值,以指导临床实践。方法:以2003年3月-2006年2月期间符合纳入标准的156例婴儿为研究对象,对他们进行血清19S-IgM-TPPA试验,并随访至明确诊断。以回顾诊断为标准。结果:156例婴儿中,141例婴儿完成随访,其中123例排除先天梅毒,18例婴儿被确诊为早期先天梅毒(有症状14例,无症状4例)。19S-IgM-TPPA试验阳性结果16例,假阳性2例,假阴性4例,敏感性77.78%(有症状78.57%,无症状75%),特异性98.37%,诊断指数176.15%;阳性预测值87.5%,阴性预测值96.8%,调整预测值无改变;阳性似然比47.83,阴性似然比0.226。结论:19S-IgM-TP-PA诊断先天梅毒敏感性较好,特异性很高,对有症状早期先天梅毒,在常规标准血清试验确定前即可证实感染的存在,用于先天梅毒的诊断是良好的预测工具,在已经有TPPA的实验室中,19S-IgM-TP-PA不失为一种诊断先天梅毒的可供选择的方法。     

梅毒螺旋体黏附素蛋白TP0136不同亚型重组蛋白在神经梅毒患者血清诊断中的应用

 目的 探讨不同亚型梅毒螺旋体（Tp）黏附素蛋白TP0136在神经梅毒（NS）患者血液中的诊断价值。方法比较60例NS患者与120例非神经梅毒的梅毒患者（NNS）一般情况。通过分子克隆技术构建表达和纯化Nichols Seattle TP0136（NST）和Nichols Houston TP0136（NHT）重组蛋白,采用ELISA方法检查NS和NNS患者血清中NST和NHT抗体水平。结果NS和NNS患者两组之间年龄、性别、来源地、职业无统计学差异（均P>0.05）,而婚姻状况、神经系统症状、血清或血浆TRUST和TPPA 滴度、血清或血浆TP-IgM阳性率、脑脊液TRUST和TPPA 滴度均有统计学差异（均P<0.05）。NST在NS组和NNS组血清或血浆中抗体水平无差异（t=0.15,P=0.920）;NHT在NNS组血清或血浆中抗体水平高于NS患者,差异有统计学意义（t=3.68,P=0.021）。结论Tp黏附素蛋白TP0136重组蛋白NHT或可作为NS诊断的潜在血液学标志物。     

Usefulness of Enzyme-linked Immunosorbent Assay Using Recombinant BP180 and BP230 for Serodiagnosis and Monitoring Disease Activity of Bullous Pemphigoid

Background

Bullous pemphigoid (BP) is an autoimmune subepidermal bullous disease associated with autoantibodies against BP180 and BP230. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is a sensitive tool for the detection of immunoglobulin G (IgG) anti-BP180 and anti-BP230 autoantibodies.

Objective

The aim of this study was to evaluate the usefulness of ELISA for diagnosing and monitoring the disease activity of BP.

Methods

We evaluated serum IgG levels of anti-BP180 and anti-BP230 autoantibodies in 47 BP patients, 16 epidermolysis bullosa aquisita patients, and 15 healthy volunteers using ELISA. Through retrospective review of the medical records, the clinical characteristics of BP including disease activity, duration, pruritus severity and peripheral blood eosinophil counts were assessed.

Results

The sensitivity of BP180 ELISA was 97.9%, BP230 ELISA 72.3%, and a combination of the two was 100%. The specificity of BP180 ELISA was 90.3%, BP230 ELISA 100%, and a combination of the two was 90.3%. BP180 ELISA scores showed strong associations with disease activity, pruritus severity, peripheral blood eosinophil counts, and disease duration, whereas BP230 ELISA scores did not.

Conclusion

BP180 and BP230 ELISAs are highly sensitive methods for the diagnosis of BP, and BP180 ELISA, in particular, is a sensitive tool for monitoring the disease activity of BP.     

广东地区梅毒螺旋体临床株的分离传代培养及非同义单核苷酸多态性检测

目的 分离培养广东地区梅毒螺旋体（Tp）临床株（GD1）并探讨其与Nichols标准株非同义单核苷酸多态性（nsSNPs）的差异。方法 从广东地区1例硬下疳患者皮损中分离出GD1,在兔睾丸中连续传代培养。暗视野显微镜、TP0548基因PCR、测序和基因分型多重验证传代情况。泛影葡胺梯度离心法分离兔组织并浓缩GD1。测序验证TP0443和TP0584基因nsSNPs位点。结果 本研究分离培养出的GD1株为TP0548 f亚型。与美国Nichols株比较,GD1株存在nsSNPs突变,位于TP0443的突变导致编码的第120位氨基酸由苏氨酸变为丙氨酸,TP0584的突变导致编码的第314位氨基酸由丙氨酸变为苏氨酸。结论 首次成功地从广东地区梅毒患者皮损中分离培养出GD1株Tp,并从病原学水平证实GD1存在nsSNPs突变。