BrdU体外示踪大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化

背景：目前还未找到一个理想的标记性分子用来鉴定骨髓间充质干细胞,因此也就不能保证骨髓间充质干细胞的同质性。 目的：以BrdU体外示踪标记验证大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导后的分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-01/10在山西医科大学完成。 材料：4周龄Wistar大鼠由山西医科大学实验动物中心提供。 方法：密度梯度离心+贴壁培养法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,达80%融合时胰蛋白酶消化传代扩增。取5×1010 L-1个骨髓间充质干细胞接种于25 mm培养皿,加入含地塞米松、β-磷酸甘油、维生素C和体积分数为10%胎牛血清的L-DMDM培养基进行成骨诱导。取第3代骨髓间充质干细胞,加入终浓度为10 μmol/L BrdU进行体外示踪,200倍荧光显微镜下随机选取10个视野,通过计数阳性细胞与非阳性细胞数得到BrdU标记率。 主要观察指标：倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测细胞表面抗原,观察诱导后成骨分化潜能,体外BrdU标记率。 结果：分离纯化的骨髓间充质干细胞呈均一的成纤维细胞样,贴壁生长,以长梭形为主,传至第3代呈明显的同向性改变,漩涡状盘旋排列,细胞存活率均大于95%,至第7代仍未见细胞生长减缓现象;CD44,CD71,CD105均呈阳性表达,CD45呈阴性表达;成骨诱导后Von kossa染色可见骨髓间充质干细胞中有黑色颗粒沉积;BrdU标记率>90%。 结论：密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,可在体外长期培养,并具有成骨分化潜能;BrdU可成功标记骨髓间充质干细胞,是安全、有效、便捷的体外示踪方法。     

绿色荧光蛋白标记成人骨髓间充质干细胞的超微结构特征

背景：研究表明,绿色荧光蛋白标记的骨髓间充质干细胞免疫学表型、细胞周期、分化潜能等均未发生明显改变。 目的：进一步观察绿色荧光蛋白标记对骨髓间充质干细胞超微结构的影响。 方法：分离培养成人骨髓间充质干细胞,抗CD34、抗CD105免疫细胞化学染色鉴定,选第3代细胞进行绿色荧光蛋白标记,超薄切片后用透射电镜观察细胞超微结构,以未经绿色荧光蛋白标记骨髓间充质干细胞为对照。 结果与结论：骨髓间充质干细胞表达CD105,不表达CD34。绿色荧光蛋白标记后,骨髓间充质干细胞细胞质发出绿色荧光,绿色荧光主要集中于细胞核周围的胞浆内,远离细胞核的胞浆内荧光强度逐渐减弱。相对于未标记的骨髓间充质细胞,经绿色荧光蛋白标记后细胞粗面内质网、高尔基体等细胞器较多,而线粒体相对较少;另外,脂滴和“空泡”样结构也多一些。结果证实绿色荧光蛋白对骨髓间充质干细胞性状的影响较为局限,是一种较为理想的细胞标记示踪剂。     

全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其诱导分化

背景：骨髓中的间充质干细胞含量极少,每1×104~1×105个单核细胞中约有1个骨髓间充质干细胞,需要在体外分离、纯化、扩增后才能满足体内移植要求。 目的：观察体外分离培养的骨髓间充质干细胞生物学特性及多向分化潜能。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2007-10/2008-12在福建医科大学附属协和医院泌尿外科研究室完成。 材料：清洁级雄性近交系SD大鼠30只,由上海斯莱克实验动物有限公司提供。 方法：通过全骨髓贴壁法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,待细胞融合至80%~90%胰蛋白酶消化传代。取传至第3代细胞,分别向成骨、成脂方向诱导分化。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察细胞形态,流式细胞仪检测其表面标记,茜素红染色检测其成骨能力,油红O染色检测其成脂能力。 结果：原代及传代的骨髓间充质干细胞均呈长梭形成纤维细胞样,连续传代10代以上,细胞始终保持旺盛的生长及扩增能力。第3代骨髓间充质干细胞CD90,CD44,CD106均呈阳性表达,而CD34,CD45,CD11b呈阴性。成骨诱导21 d后,可见大量橘红色矿化结节形成。成脂诱导2周后,可见细胞的胞浆内出现大量红染脂滴。 结论：全骨髓贴壁培养法可大量分离纯化、扩增骨髓间充质干细胞,所获细胞具有间充质干细胞的一般生物学特性,经诱导培养后具有多向分化潜能。     

脐血间充质干细胞生物学特性及其成骨成脂分化潜能

背景：对于脐血来源间充质干细胞的研究是干细胞研究领域的重点和热点,但目前国内外研究对其报道尚较少,许多方面存在争议。 目的：观察人脐血间充质干细胞的生物学特性,并探讨其向成骨、成脂肪细胞诱导分化的能力。 方法：从不同胎龄脐血中分离培养间充质干细胞;通过倒置相差显微镜及透射电镜观察细胞的形态、生长增殖情况及其超微结构;并描绘细胞生长曲线;用流式细胞仪对细胞表面标志物进行检测。分别用成骨及成脂诱导液对脐血间充质干细胞进行诱导,通过茜素红染色检测脐血间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的能力;通过油红O染色检测其向脂肪细胞诱导分化的能力。 结果与结论：倒置相差显微镜下观察脐血间充质干细胞贴壁生长,呈成纤维细胞样外观,细胞呈螺旋状排列;透射电镜观察脐血间充质干细胞细胞核大,胞核比例大,细胞器少,为低分化细胞;原代及传代培养的脐血间充质干细胞生长曲线均呈S型,第3,5代细胞增殖能力最强。流式细胞仪检测结果显示,脐血间充质干细胞均稳定表达与间充质干细胞相关的表面抗原标志物CD29,CD44和CD90等,不表达造血标志CD34和CD45。脐血间充质干细胞成骨诱导后3周时茜素红染色可检测到大量钙化基质的形成;成脂诱导3周时油红O染色可检测到胞质中脂滴的形成。提示脐血间充质干细胞的形态特征、生长增殖特点及细胞表面标志物等生物学特性与骨髓间充质干细胞相似,具有强大的生长增殖与自我更新能力。脐血间充质干细胞在体外诱导条件下可以向成骨细胞及脂肪细胞等间质组织细胞定向分化。     

人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒体外诱导成骨的比较

背景：由于骨形成蛋白的释放速度与新骨生长速度不匹配，单纯应用骨形成蛋白的效果尚不理想，因此，应有合适的载体来调节骨形成蛋白的释放速度。 目的：观察重组人骨形成蛋白4基因腺相关病毒及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒诱导兔骨髓间充质干细胞向成骨方向分化的作用。 方法：全骨髓法培养兔骨髓间充质干细胞，分别应用人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒载体及绿色荧光蛋白基因腺相关病毒转染兔骨髓间充质干细胞，设定感染复数值为5×104，观察两组细胞形态改变，分别行碱性磷酸酶染色、Von Kossa染色、茜素红染色及碱性磷酸酶含量测定，比较两组成骨活性差异。 结果与结论：人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组转染骨髓间充质干细胞后，细胞形态呈现典型的成骨改变，碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色、茜素红染色均出现成骨的特征性改变。绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组未观察到上述改变。人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒组碱性磷酸酶含量高于绿色荧光蛋白基因腺相关病毒组(P < 0.01)。提示人骨形态形成蛋白4基因腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞后，骨髓间充质干细胞表现出更加明显的成骨活性改变。     

不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨分化

背景：目前成人骨髓间充质干细胞体外培养成骨定向分化的研究较多,甚少见有不同年龄儿童骨髓间充质干细胞自体血清体外培养及成骨定向分化生物学特性差异的报道。 目的：研究不同年龄儿童骨髓间充质干细胞的自体血清体外培养条件与方法,并探讨其成骨诱导分化后的基本生物学特性。 方法：无菌条件下收集3个不同年龄组儿童骨髓悬液,分离人骨髓间充质干细胞,采用含自体血清的培养基培养;测定细胞生长曲线,采用流式细胞仪检测细胞表面抗原;取传代培养细胞,经β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松进行成骨诱导分化后,采用免疫组织化学法检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原以及钙结节形成,以评价其分化效率;倒置相差显微镜逐日观察原代、传代及诱导分化细胞的生长情况及形态学改变。 结果与结论：3组儿童培养的人骨髓间充质干细胞,经刺激培养后细胞表面抗原CD29、CD44为阳性,CD34、CD45、CD105、CD106及HLA-DR均为阴性,各组表达强度差异无显著性意义。不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长速度以及分化效率随年龄增大而减小。结果提示通过对不同年龄组儿童人骨髓间充质干细胞生长特性、表面抗原表达以及分化潜能等方面的对比研究,自体血清可作为安全有效的培养方法,且年龄越小,分化效率相对越高。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养向成骨和成脂方向的诱导分化*☆

目的：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓组织中多种干细胞的混和体，因其具有取材方便、扩增迅速、可自体移植并且具有多分化潜能等特点，是近年研究的热点。实验建立了体外分离、培养及鉴定兔骨髓间充质干细胞的方法，并通过此进一步验证其诱导成骨及成脂多向分化的潜能。 方法: 实验于2006-08/2007-06在吉林大学药学院生物工程实验室完成, 实验室属吉林大学重点实验室。①实验材料：四五月龄新西兰大白兔2只, 由吉林大学基础医学院动物培养中心提供, 体质量1.0~1.5 kg, 雌雄不限, 实验动物级别为二级, 实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：实验应用了密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法从兔股骨、胫骨中分离、纯化骨髓间充质干细胞并在体外进行培养，以形态学及细胞表面标志的方法鉴定间充质干细胞，在倒置显微镜下观察细胞的形态特征，并利用成骨诱导剂包括0.1 μmol/L的地塞米松、50 mg/L的维生素C、10 mmol/Lβ-磷酸甘油钠和成脂诱导剂含10%FBS的L-DMEM、0.25 μmol/L地塞米松、50 μmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L牛胰岛素诱导其向软骨细胞及脂肪细胞分化。 结果:①经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞呈梭形，类似于成纤维细胞，骨髓间充质干细胞均一地表达CD29、CD44,而CD34、CD45均阴性表达。②成骨诱导14 d后细胞不明显，未形成钙结节，21 d后碱性磷酸酶钙钴法染色后大多数细胞的胞质呈棕黑色。③成脂诱导48 h后，细胞内有小脂滴出现，2周后脂滴数量增加并相互融合，细胞（有）由长梭形变为圆形或多边形，油红O染色显示有大量脂质沉积。 结论:密度梯度离心法与贴壁培养法相结合的方法是比较理想的骨髓间充质干细胞培养法，骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能。     

兔骨髓间充质干细胞体外培养定向诱导分化为软骨细胞

背景：骨髓间充质干细胞具有分化为骨、软骨、肌腱、脂肪等组织的多分化潜能。 目的：体外培养兔骨髓间充质干细胞并定向诱导分化为软骨细胞,探讨体外诱导分化为软骨的方法和条件。 方法：取兔股骨骨髓,全骨髓贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子体外培养后,取第3代细胞在培养基中添加不同质量浓度转化生长因子β1的软骨分化诱导剂,2周后倒置显微镜观察细胞形态,甲苯胺蓝染色,RT-PCR技术检测Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达。 结果与结论：可以从兔骨髓中培养出骨髓间充质干细胞,碱性成纤维生长因子能明显的促进骨髓间充质干细胞增殖。经软骨诱导分化后骨髓间充质干细胞呈软骨细胞形态,甲苯胺蓝染色阳性,Ⅱ型胶原和聚集蛋白聚糖的表达阳性。10 μg/L的转化生长因子β1诱导成软骨分化能力最强。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景：目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果。 目的：观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成。 材料：健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供。重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品。 方法：用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴壁法纯化扩增。取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化。 结果：原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达。转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光。转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均> 0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化。 结论：重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性。     

瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

背景：瘦素及其受体在中枢和外周多个部位均有表达,具有多种生物学功能,对于骨代谢有着重要的影响作用,但目前瘦素影响骨重建的机制尚未完全明了。 目的：探讨瘦素对人骨髓间充质干细胞成骨分化能力的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察,于2008-03/2008-09在山西医科大学生化与分子生物学实验室完成。 材料：健康志愿者髂骨骨髓由山西医科大学第二医院提供。瘦素为Sigma公司产品。 方法：采用全骨髓法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代以1×108 L-1密度接种至预置盖玻片的6孔培养板中,设立3组：成骨诱导组添加原代培养液后,再加入含10-8 mol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油、50 mg/L维生素C的成骨诱导培养基;成骨+瘦素诱导组添加成骨诱导培养基后,再加入50 nmol/L瘦素;空白对照组仅加入含体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM培养液。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞表面标志表达、钙化结节染色结果、碱性磷酸酶活性、Ⅰ型胶原及骨钙素含量、骨保护素和RANKL蛋白的表达。 结果：第3代骨髓间充质干细胞CD44和CD71阳性率分别为95.21%,72.31%,CD34阳性率仅为0.39%。成骨诱导21 d后von Kossa染色可见呈棕黑色的细胞外基质钙盐沉积。诱导14 d与空白对照组比较,成骨诱导组、成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞内碱性磷酸酶活性及Ⅰ型胶原、骨钙素含量均明显升高(P < 0.05);且成骨+瘦素诱导组各指标升高幅度明显高于成骨诱导组(P < 0.05)。与成骨诱导组比较,成骨+瘦素诱导组骨髓间充质干细胞骨保护素蛋白的表达明显上调(P < 0.05),RANKL蛋白的表达明显下调(P < 0.05)。 结论：瘦素作用于人骨髓间充质干细胞后可促使其向成骨细胞分化,可能通过骨保护素/RANKL途径发挥对骨代谢的调节作用。     

脉冲电磁场对小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化的影响★

背景：间充质干细胞的增殖分化缺乏可调控性，结合适当载体后不能高效增殖分化是阻碍其进入临床的瓶颈。脉冲电磁场若能有效调控干细胞向骨源细胞分化将具有重要的临床价值。 目的：观察脉冲电磁场刺激后，小鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化情况。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察，于2004-05/2007-10在华中科技大学同济医学院附属普爱医院骨科实验室完成。 材料：BALB/C小鼠20只，由同济医学院实验动物中心提供。脉冲电磁场发生器由海军工程大学电机系设计与制造。 方法：无菌分离小鼠双侧股骨，Percoll密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞，再用贴壁筛选法纯化扩增。取生长良好的第3代细胞，调整细胞密度为2×107 L-1接种于6孔板，分成4组：空白对照组加入完全培养基组；脉冲电磁场组给予50 Hz、正弦波形、强度1 mT的脉冲电磁场辐射，2次/d，30 min/次，间隔12 h，共10 d；成骨诱导组加入含地塞米松、甘油磷酸钠、VitC的完全诱导培养基；脉冲电磁场+成骨诱导组给予相同的脉冲电磁场辐射后加入完全诱导培养基。 主要观察指标：骨髓间充质干细胞的分化情况。 结果：碱性磷酸酶染色结果显示，干预10 d后，空白对照组为阴性；脉冲电磁场组呈弱阳性；成骨诱导组呈阳性；脉冲电磁场+成骨诱导组呈强阳性。与空白对照组比较，成骨诱导组、脉冲电磁场+成骨诱导组Ⅰ型胶原免疫组化染色吸光度值均明显升高(P < 0.05，P < 0.01)。 结论：50 Hz、正弦波形、强度1 mT脉冲电磁场干预一定时间后，能够增强小鼠骨髓间充质干细胞碱性磷酸酶及Ⅰ型胶原的表达，促进其分化成骨。     

重组腺病毒Ad-LMP-1感染大鼠骨髓间充质干细胞

背景：LIM矿化蛋白1 (LIM Mineralization protein, LMP-1)是一种细胞内非分泌蛋白，可以通过招募众多的成骨因子共同参与成骨细胞的分化。LMP-1在成骨上游水平发挥的强大作用提示了其在骨骼重建方面具有巨大的应用潜力。 目的：观察重组腺病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞的效果，及对其分化的影响。 方法：大鼠骨髓间充质干细胞分离培养，传代后，检测特异性标记物CD44的表达情况，矿化液诱导细胞成骨分化后用茜素红染色鉴定。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后通过观察绿色荧光蛋白表达情况计算转染效率，RT-PCR及Western blot验证感染效果，观察感染Ad-LMP-1 2，7，14 d后骨髓间充质干细胞的形态变化和对细胞增殖活力的影响。 结果与结论：传代细胞形态一致，排列紧密。矿化液诱导后，细胞形态明显改变。茜素红染色结果表明，诱导后出现钙化结节。观察绿色荧光蛋白信号表明重组病毒Ad-LMP-1感染骨髓间充质干细胞效率在85%左右。感染重组腺病毒Ad-LMP-1后第7天出现了细胞形态改变，14 d出现类钙化结节，但不伴有细胞增殖活力改变。结果提示重组腺病毒Ad-LMP-1可以有效地感染原代培养的骨髓间充质干细胞，并诱导其向成骨细胞分化。     

人脐带间充质干细胞向成骨细胞及脂肪细胞分化过程中nm23-H1基因的表达****

背景：nm23-h1基因已被证实与多种细胞的增殖、分化、转移密切相关。 目的：观察人脐带间充质干细胞在体外向成脂及成骨方向诱导分化的过程中nm23-H1基因的表达变化。 方法：采用组织块贴壁法从脐带中分离培养人间充质干细胞,流式细胞术鉴定其表型,之后分别加入成脂肪诱导剂和成骨诱导剂进行体外诱导分化。对照组采用不含诱导因子的培养液进行培养。 结果与结论：在成脂诱导过程的第4天,nm23-H1 mRNA的表达上调,至第7天达到最高(P < 0.01),其后开始逐渐恢复,直至第14天与对照组相比无显著差异(P > 0.05)。而在成骨诱导过程中,nm23-H1 mRNA则一直为低表达状态(P < 0.01),直至第28天恢复为对照组水平(P > 0.05)。结果显示nm23-H1基因表达在成脂分化前期发生上调,而在成骨分化过程中一直下调。     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

大鼠骨髓间充质干细胞体外增殖与多向分化的能力

背景：生理条件下机体内多数骨髓间充质干细胞增殖并不明显,然而在一定刺激下可表现出旺盛的有丝分裂活动,具有很强的增殖倍增能力,且体外实验表明其具有多向分化潜能。 目的：进一步验证体外分离培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖与多向分化潜能。 方法：全骨髓法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,贴壁筛选法进行纯化,倒置相差显微镜下观察细胞形态及生长特征,MTT法绘制细胞生长曲线,免疫组化法对细胞表面干细胞标志CD44进行鉴定。取传至第4代细胞,分别用成骨、成软骨、成脂肪和成神经诱导剂予以培养,通过碱性磷酸酶染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色、油红O染色、NeuN抗体免疫组化染色进行分化能力鉴定。 结果与结论：分离培养的细胞呈长梭形或多边形,细胞生长曲线呈S形,群体倍增时间约为31 h,免疫细胞化学染色后CD44呈阳性表达,CD34呈阴性。第4代骨髓间充质干细胞成骨诱导2周后出现钙盐沉积,成软骨诱导培养2周后Ⅱ型胶原检测呈阳性,成脂肪诱导培养2周后在细胞的胞浆内充满大量红色脂肪滴,成神经诱导6 h后细胞出现突起,类似神经元的轴突和树突纤维,NeuN免疫组化染色呈阳性。表明体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖能力旺盛,可向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、神经元样细胞方向分化。     

三维共培养兔髓核细胞诱导骨髓间充质干细胞分化*☆

背景：在椎间盘组织工程研究领域,种子细胞主要有髓核细胞与骨髓间充质干细胞。髓核细胞来源有限,取材不便,增殖能力差,体外培养困难。 目的：利用海藻酸盐微球模拟的三维环境下,将兔髓核细胞与骨髓间充质干细胞共培养,观察骨髓间充质干细胞的分化情况。 设计、时间及地点：细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行。 材料：4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心。 方法：应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,应用Ⅱ型胶原酶消化法及贴壁法分离培养兔椎间盘髓核细胞。取传至第3代骨髓间充质干细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选后,分为2组：单独培养组将转染后的骨髓间充质干细胞单独培养,共培养组将其与髓核细胞按1∶1比例于海藻酸盐凝胶微球中进行共培养。共培养14 d后,溶解海藻酸盐凝胶珠,通过流式分选收集骨髓间充质干细胞。 主要观察指标：利用RT-PCR法和Western blot技术检测骨髓间充质干细胞中Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖的表达。 结果：共培养14 d后,共培养组有Ⅱ型胶原、聚集蛋白聚糖mRNA及蛋白的表达,而单独培养组均呈阴性表达。 结论：通过三维共培养,兔椎间盘髓核细胞能够在体外诱导骨髓间充质干细胞向髓核样细胞方向分化。     

携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞的有效性**☆

背景：细胞移植前,将目的基因转染干细胞可增强细胞治疗效果。但要实现目的基因的高效转移并适度表达,载体系统的选择是关键。 目的：将携带绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞,检测病毒感染效率及感染后的细胞活力。 方法：利用脂质体转染法获取慢病毒原液。设定不同感染复数(1,5,10,15,20),将带有增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体感染人脂肪源性干细胞。荧光显微镜下观察病毒转染后人脂肪源性干细胞内增强绿色荧光蛋白的表达,流式细胞仪测定病毒感染效率。茜素红染色及油红O染色鉴定病毒转染后人脂肪源性干细胞的多向分化潜能。MTT法检测转染后人脂肪源性干细胞的增殖情况。 结果与结论：随病毒感染时间及感染复数值的增加,人脂肪源性干细胞内绿色荧光表达明显增强,感染后第3天,感染复数为20时人脂肪源性干细胞内可见明显绿色荧光表达,病毒感染效率为60%;第5~7天,病毒感染效率可达90%~95%。转染后人脂肪源性干细胞经成骨及成脂诱导液培养后,茜素红染色及油红O染色阳性,表明病毒感染未影响人脂肪源性干细胞的多向分化能力。病毒感染后,人脂肪源性干细胞的增殖能力未受明显影响。说明携带增强绿色荧光蛋白的慢病毒载体可以有效感染人脂肪源性干细胞。     

电针诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

背景：目前经报道的成骨诱导方法很多,为骨髓间充质干细胞的成骨诱导提出很多新的思路及方法。但是电针是否能诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化尚不清楚。 目的：尝试应用电针治疗仪诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,评价其作为骨组织工程种子细胞的可行性。 方法：从患者髂后上棘抽取骨髓,分离培养鉴定为骨髓间充质干细胞后,取第3代细胞进行培养。当细胞铺满培养瓶底90%以上时进行胰酶消化,分别以3.0×103/cm2的浓度接种于6孔培养板中。实验随机分为3组：空白对照组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液;化学诱导组：每孔内加2 mL含10%胎牛血清的L-DMEM培养液,当细胞贴壁生长达到60%~70%汇合时,加入骨诱导剂;电针刺激组：加入2 mL体积分数为10%胎牛血清的L-DMEM/F12培养液,电针刺激,采取连续波输出,基波脉冲频率为50 Hz,基波脉冲宽度0.5 ms,持续作用30 min,共电针刺激28 d。相差倒置显微镜观察细胞形态变化;茜素红染色结果;细胞诱导14,28 d后碱性磷酸酶活性;RT-PCR测定细胞中骨钙素mRNA的表达;Western Blot测定细胞中骨钙素蛋白表达。 结果与结论：①在28 d的诱导过程中,化学诱导组5~7 d细胞汇合成单层,细胞突起互相连接,并可重叠生长而不发生细胞间的接触抑制现象;电针刺激组9 d或10 d发现细胞体积大,呈三角形、多角形或鳞形;空白对照组细胞形态仍然是纺锤状。②化学诱导组和电针刺激组28 d在倒置相差显微镜下均观察到有矿化结节出现,进行茜素红均呈阳性反应,而空白对照组呈阴性反应。③骨髓间充质干细胞在体外进行诱导时化学诱导组和电针刺激组碱性磷酸酶水平在14,28 d高于空白对照组(P < 0.05);且化学诱导组碱性磷酸酶14 d时高于电针刺激组(P < 0.05),但28 d时差异无显著性意义(P > 0.05)。④空白对照组骨钙素mRNA及蛋白含量均低于化学诱导组和电针刺激组(P < 0.05)。提示电针可定向诱导人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。     

建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定

背景：骨髓间充质干细胞作为种子细胞在组织工程等领域应用广泛,建立稳定的分离培养体系和统一鉴定标准尤为重要。 目的：以不同方法体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞形态学观察、表面标志物鉴定及多向分化能力检测。 设计、时间及地点：细胞学体外对比观察,于2005-08/12在暨南大学完成。 材料：SPF级3月龄SD雌性大鼠5只,由中山大学实验动物中心提供。 方法：无菌条件下分离大鼠双下肢,低糖DMEM培养液冲出骨髓,分别运用全骨髓贴壁法和密度梯度离心法体外分离骨髓间充质干细胞,利用差速贴壁原理对细胞进行纯化扩增。取生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞,分别加入成骨、成脂、成软骨诱导培养基,培养14 d。 主要观察指标：倒置相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞的生长状态,流式细胞仪检测细胞表面标志物的表达,采用碱性磷酸酶染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力,以甲苯胺蓝染色鉴定成软骨能力。 结果：与密度梯度离心法相比,全骨髓贴壁法分离获得的骨髓间充质干细胞贴壁时间短,增殖快,经传代后能够纯化。第3代骨髓间充质干细胞形态单一均匀,呈典型的极性漩涡状生长,不表达造血前体细胞标志抗原CD34和白细胞标志抗原CD45,表达整合素家族成员CD29和黏附分子CD44,经诱导后碱性磷酸酶染色、油红O染色和甲苯胺蓝染色均呈阳性。 结论：采用全骨髓贴壁法可稳定获得均质性良好的大鼠骨髓间充质干细胞,效果优于密度梯度离心法。经全骨髓贴壁法体外分离培养的细胞在形态学、细胞表面标志物表达和多向分化能力方面具有干细胞生物学特性,经鉴定为大鼠骨髓间充质干细胞。