抗A型产气荚膜梭菌α毒素单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立与中和效应

用提取的Ａ型产气荚膜梭菌α毒素包涵体免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取小鼠脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞进行融合和克隆化，经ＥＬＩＳＡ筛选，共获得７株稳定分泌单克隆抗体（ＭｃＡｂ）的杂交瘤细胞株，分别命名为１Ａ８、１Ｃ３、１Ｄ５、１Ｄ８、１Ｆ１、１Ｈ１和２Ｅ３。经鉴定，７株ＭｃＡｂ的Ｉｇ亚类有ＩｇＧ１（１Ｄ８）、ＩｇＧ３（１Ａ８、１Ｃ３和２Ｅ３）和ＩｇＭ（１Ｄ５、１Ｆ１和１Ｈ１）。细胞培养上清和腹水抗体效价分别为：１∶５１２～１∶１０２４和１∶１０６～１∶１０８。尤为重要的是，２Ｅ３杂交瘤细胞株分泌的ＭｃＡｂ不仅能够中和α毒素的磷脂酶Ｃ活性和溶血活性，而且能够对致死性腹腔感染小鼠产生良好的被动保护作用     

产气荚膜梭菌毒素研究进展

产气荚膜梭菌通过产生大量的毒素导致人类和动物患气性坏疽、肠炎和肠毒素血症。目前,已知产气荚膜梭菌可产生20多种毒素和水解酶。不同的毒素类型与特定的疾病类型相关。毒素分型已由毒素基因的分子检测替代了传统的血清分型方法。因此本文围绕产气荚膜梭菌毒素种类、基本特征、致病机制以及与疾病的关系进行系统回顾总结和展望,为后续的毒素分型等快速检测技术的建立、免疫抗原筛选、抗体制备以及相关致病机制研究提供基础。     

产气荚膜梭菌α毒素基因片段克隆的测序与应用

目的为了获得A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段克隆质粒,作为实时定量PCR检测标本产气荚膜梭菌标准,以备临床应用。方法采用两轮高保真PCR扩增A型产气荚膜梭菌C57株α毒素基因片段(Cpa900),经EcoRⅠ酶切后插入质粒pUC19并连接,构建重组质粒pUC19-Cpa900,转化大肠埃希菌Top10感受态菌株并予以增菌后测序,并提取质粒进行实时定量PCR测试。结果 pUC19下游引物匹配Cpa900上、下游引物双PCR筛选电泳结果表明,116-2株中含单拷贝、反向插入pUC19的Cpa900,并为测序结果所证实;测序结果表明,克隆片段与美国典型菌种保藏中心标准株ATCC 13124的全基因序列CP000246.1中的磷脂酶C(PLC)基因(CPF_0042)相应序列相比,符合率高达99.8%;变异位点不在两实时定量PCR引物和探针区,经实时定量PCR实测对扩增效率无影响,完全可用作实时定量PCR检测标准。结论 A型产气荚膜梭菌α毒素克隆片段序列高度保守,作为模板具有高扩增效率,可作为标准品用于实时定量PCR检测A型产气荚膜梭菌,质粒引物匹配插入片段双引物双PCR筛选转化菌株,不但可鉴定阳性克隆,还能确定重组质粒中插入基因拷贝数量和插入方向、有效避免假阳性,不失为很好的筛选方法。     

产气荚膜梭菌β-毒素基因的克隆及CPB-ST融合基因的构建

用聚合酶链式反应（ＰＣＲ）技术，从Ｂ型产气荚膜梭菌染色体基因组中扩增了９３０ｂｐ的β－毒素基因。用限制性核酸内切酶ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ对ＰＣＲ产物进行双酶切处理，然后，通过Ｔ４ＤＮＡ连接酶将其定向连接于事先经同样的双酶切处理的载体质粒ｐＥＴ－２８Ｃ（＋）的多克隆位点，转化至受体菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中。经ＢａｍＨＩ和ＥｃｏＲＩ双酶切分析和ＰＣＲ扩增检测。证明重组质粒ｐＥＣＢ２中含有产气荚膜梭菌的β－毒素基因。经核苷酸序列分析，明确了克隆的β－毒素基因在重组质粒中的连接向位和阅读框架是正确的。利用已构建的另一重组质粒ｐＸＳＴ１（带有肠毒素性大肠杆菌的耐热性肠毒素ＳＴ基因），通过ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ双酶切处理，将切下的ＳＴ基因片段定向连接到ｐＥＣＢ２重组质粒中ＣＰＢ基因的下游。经特定酶切分析鉴定，得到了理想重组子质粒ｐＥＣＢＳＴ１，ＣＰＢ－ＳＴ融合基因在重组质粒ｐＥＣＴ－ＳＴ１中的连接向位是正确的     

食品中产气荚膜梭菌α毒素基因快速检测方法的研究

目的建立分子信标荧光PCR体系检测产气荚膜梭菌的快速检测方法,应用于食物中毒快速诊断和食品微生物检验。方法根据GenBank公布的保守序列,针对α毒素基因设计一对引物和分子信标探针,用FAM荧光剂标记探针的5’端,并进行特异性和灵敏度分析,同时以10种细菌作对照。结果分子信标荧光PCR反应体系检测10种细菌,只有产气荚膜梭菌出现特异荧光信号,其他均无荧光信号,而且与其他细菌无交叉反应。对40份食品样品进行检测,3份产气荚膜梭菌PCR阳性,其余样品为阴性,检测仅需2 h。3份阳性样本经传统方法培养,2份有检出产气荚膜梭菌。结论分子信标荧光PCR检测体系快速、灵敏度高,特异性强,可用于产气荚膜梭菌食物中毒的快速诊断和食品污染物及感染性腹泻等监测工作中,为食源性疾病的分子流行病学调查提供新的检测手段。     

应用多重PCR鉴定对人致病的产气荚膜梭菌毒素

目的研究用多重PCR的方法鉴定产气荚膜梭菌及分型毒素,为开展基因诊断做好准备。方法根据GenBank已经发表的产气荚膜梭菌毒素基因序列,设计出针对CPα、CPβ、CPE毒素基因的3对特异引物,运用多重PCR的方法鉴定出产气荚膜梭菌并对其毒素基因进行分型。结果经电泳鉴定,多重PCR成功的扩增出预先设计的3条特异的目的条带。结论所设计的多重PCR反应体系能够得到产气荚膜梭菌的特异序列,同时能够鉴定分型3种对人致病的毒素序列,为进一步开展基因诊断打下基础。     

一起产气荚膜梭菌引起的食物中毒报告

目的分析一起食物中毒暴发病因。方法样品参照GB/T4789-2008《食品卫生微生物学检验》等标准检验。结果鸡腿及患者粪便样品中检出产气荚膜梭菌,并从患者粪便样品中检出产气荚膜梭菌肠毒素。结论鸡腿被产气荚膜梭菌污染,患者食后造成食物中毒。     

产气荚膜梭菌：一种水污染的指示菌

检测水中病原微生物的途径有两种:一种是直接检测病原微生物,此法最为可靠,但费时、昂贵,且受检测方法的限制,敏感性低另一种也是最普遍的途径即检测一个指示微生物,其存在表示病原微生物也存在^〔1〕.     

运用压电石英晶体生物传感器检测产气荚膜梭菌α毒素的实验研究

目的研究运用压电石英晶体生物传感器对产气荚膜梭菌α毒素（CPα）进行检测的方法和反应条件。方法按照碱基配对的原则,设计特异的产气荚膜梭菌α毒素基因寡核苷酸探针并利用巯基自组装技术固定在石英晶体上,运用压电石英晶体生物传感器的“质量效应”对聚合酶链反应（PCR）扩增得到的产气荚膜梭菌α毒素靶基因进行杂交检测,并探讨不同pH值和不同离子强度的缓冲液对检测的影响。结果压电石英晶体生物传感器成功检测出产气荚膜梭菌α毒素;pH7.6的缓冲液和0.64mol/L的NaCl溶液最适合于检测。结论压电石英晶体生物传感器能够有效地检测产气荚膜梭菌α毒素,有望对临床上开展毒素诊断提供一种新的手段。     

型特异性多重PCR快速检测创伤组织中的产气荚膜梭菌

目的 为快速检测创伤组织中的产气英膜梭菌建立型特异性多重PCR方法.方法 建立菌落和含产气荚膜梭菌创伤标本中的染色体和质粒DNA简便、快速纯化[月桂基硫酸三乙胺醇(TLS)法]和型特异性多重PCR方法;对各型产气荚膜梭菌、部分近缘梭菌标准株和开放性创伤气性坏疽标本进行PCR检测,其结果与培养结果进行比较.结果 该方法可检测各型产气荚膜梭菌,并可排除近缘梭菌干扰;A型株检测灵敏度达到7.5×10~3/ml;可在5 h内获取结果;标本PCR检测与培养结果相符.结论 新建立的培养和创伤组织标本中产气荚膜梭菌染色体与质粒DNA纯化方法简便、快速;型特异性多重PCR具有良好的特异性、较高的灵敏度,短时间内获得结果,可用于临床实验室.     

产气荚膜梭菌选择性显色培养基的研制

目的通过筛选各种选择性成分添加至培养基中以快速筛选产气荚膜梭菌,研制产气荚膜梭菌选择性显色培养基。方法通过单因素试验评价促生长因子甘露醇、丙酮酸钠、硫酸镁对目标菌生长的促进作用,比较抗生素环丝氨酸、新霉素、多粘菌素和磺胺嘧啶对目标菌和非目标菌的抑制作用,比较显色剂5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸二钠盐(BCIP)、对硝基苯磷酸二钠(PNPP)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷(X-Gal)、4-甲基伞形酮酰-β-D-吡喃糖苷(Mu-Gal)、邻硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)对目标菌的显色效果,将酶促因子硫酸镁、硫酸钙、硫酸锰、硫酸锌与目标菌反应筛选最佳成分并确定其用量,制成产气荚膜梭菌选择性显色培养基。结果筛选出的培养基最佳成分促生长因子为丙酮酸钠,用量200mg,抗生素环丝氨酸0.5mg,显色剂为BCIP和Mu-Gal,用量均为6mg,酶促因子硫酸镁72mg,以上成分加入到100ml营养肉汤基础培养基中,制备的选择性培养基培养效果与TSC培养基、SPS培养基无差异。结论本实验所研制的选择性培养基可以用于产气荚膜梭菌的检测。     

真空包装即食鸡肉中检出1株产气荚膜梭菌的报告

产气荚膜梭菌又称魏氏梭菌，是一种专性厌氧菌，其A型能引起人的食物中毒。中毒多发生在夏、秋季节，中毒食品包括生畜肉、禽肉、鱼、牛奶及其他蛋白性食品。在食品行业中，熟食制品采用真空包装非常普遍，客观上为厌氧菌的生长提供了条件。2003年4月，我们从2份真空包装即食鸡肉中检出同1株产气荚膜梭菌。     

从鸭羽为原料的水洗羽毛制品中分离到产气荚膜梭菌

目的:对水洗羽毛制品进行微生物污染调查,提示在我国加入世贸组织后,应高度重视水洗羽毛羽绒制品的卫生状况。方法:按照GB/T10288-2003《羽毛羽绒检验方法》附录A中A.6.4亚硫酸还原梭状芽胞杆菌的计数进行操作。结果:从一件以鸭羽为原料的水洗羽毛样品中分离到产气荚膜梭菌。结论:中国是全球最大的羽毛羽绒及其制品生产国和出口国,随着我国加入世贸组织,加强羽毛羽绒及其制品的监测,有利于避免遭受贸易壁垒,更有利于保障人民健康。     

食品中产气荚膜梭菌检测新方法探索

产气荚膜梭菌是厌氧性G~+大杆菌,由它引起的食物中毒是人群食物传播性疾病中最常见的类型之一。通常所涉及的媒介物是含有大量活菌的熟肉或家禽制品。由于按国标法来测定食品中产气荚膜梭菌的检出率较低,本文改进了国标法中部分培养基的配方及使用,共做了70份样品(1991年8月～1992年7月)阳性率达31.4％,其中夏季(6月～9月)阳性率达53.6％,说明新方法检出率较高,可供广大检验工作者参考。     

二种产气荚膜梭菌培养基的计数效果的实验研究

本次试验研究了TSC培养基和m-CP培养基对四种方法处理的产气荚膜梭菌进行细菌计数，并以RCM培养基作为对照培养基。测出了两种选择性培养基对经四种不同处理后的产气荚膜梭菌的计数能力，从试验结果可知，TSC培养基在对采用四种方法处理后的产气荚膜梭菌计数总能力大于m-MP培养基14倍，因此，我们认为采用TSC培养基作为检测和计数环境中各种样品中产气荚膜梭菌的数量时，要优于使用m-CP培养基。     

产气荚膜梭菌检验培养基--改良SPS的研究

产气荚膜梭菌污染了富含蛋白质的食品后 ,能引起食物中毒。有关文献报道 ,它所引起的食物中毒是继沙门菌、金黄色葡萄球菌之后 ,排列为第三位[5] 。 80年代初 ,我国也有报导[2 ] 。我国的国家标准 (食品卫生微生物检验方法 )中已明确将该菌列入食品致病菌的检验范围 ,所规定使用的计数培养基为亚硫酸盐 -多粘菌素Ｂ -磺胺嘧啶琼脂 (以下简称ＳＰＳ)。我们在研制商品化的脱水培养基时发现 ,用国产培养基原料 ,按国际ＳＰＳ配方 ,所配制的培养基效果不理想 (经 2 4ｈ厌氧环境培养后细菌集落无黑色产生 )。按国标食品卫生检验方法规定 ,产气荚…     

产气荚膜梭菌对小鼠消化道组织和菌群的影响

梭状芽胞杆菌(Clostridium)是机体肠道正常菌群.产气荚膜梭菌(Cl.perfringen简写Cl.p)是其中少数致病菌之一,健康成人的分离率为52%,而老人则为92%.有关学者对它产生的腐败作用和在消化道肿瘤发生的相关性较为关注.本文报告昆明种小鼠长期饲Cl.p后,其胃肠粘膜组织病理变化、肝细胞增生和肠道菌群变化.     

产气荚膜梭菌实时荧光定量PCR方法的应用

目的利用荧光定量PCR技术,建立快速敏感特异的产气荚膜梭菌检测方法。方法以产气荚膜梭菌基因作为靶序列,设计一对引物和探针,以产气荚膜梭菌菌株提取核酸DNA作为模板,优化引物和探针的浓度比,同时验证方法的灵敏度、特异性、重复性。结果反应体系在上、下游引物浓度均为1μmol/L,探针浓度为0.1μmol/L时,具有良好的特异性和灵敏度,与创伤弧菌等24种相关细菌均无交叉反应,对纯菌检测的灵敏度为9×102CFU/ml,重复性试验证实该体系重复性好,稳定性高;3例临床样本检测结果与细菌培养结果相符。结论建立的实时荧光PCR方法特异、灵敏、快速,能对临床气性坏疽做出快速准确的报告,实现对气性坏疽战时高发性疾病安全、快速和定量检测。     

应用DNA探针技术快速检测食品中产气荚膜梭菌产肠毒素基因的研究

产气荚膜梭菌是引起食物中毒的病原菌,其为G-厌氧菌。有芽胞,常存在于自然界、健康人和动物肠道内。产气荚膜梭菌食物中毒的起因物质是该菌在形成芽胞时产生的A型肠毒素。因此,检测产气荚膜梭菌的产肠毒素株是非常必要的。本实验建立一种基因探针方法,能快速准确地检出产气荚膜梭菌的产毒株。我们于1999年5月～10月间,共检测样品180份,结果报告如下。     

产气荚膜梭菌和粪肠球菌致下肢伤口感染1例

1 病例 患者,女,4岁.主诉车板砸伤左下肢,疼痛、肿胀、活动受限1月余,于2003年3月4日入院.自诉1月前不慎被车箱板砸伤左下肢,急到当地诊所清创包扎,用夹板固定制动,经换药发现夹板处皮肤坏死,急诊来我院治疗.