人β-防御素2在大肠杆菌中的高效表达和纯化

目的：研究具有生物学活性的人防御素2（HBD2）多肽在大肠杆菌中的原核高效表达的可行性及融合表达蛋白的分离纯化技术。方法：PCR扩增不合前导序列的HBD2成熟肽的编码框全长的cDNA片段（smHBD2-cDNA），利用BglⅡ和BamHⅠ同尾酶构建多拷贝串联的nsmHBD2-cDNA的克隆载体，利用NcolⅠ和HindⅢ限制性内切酶构建融合表达载体pET32-nsmHBD2-cDNA，在大肠杆菌中BL21（DE3）中诱导表达含HBD2的融合蛋白，SDS-PAGE分析产量。可溶蛋白经亲和层析、肠激酶酶切、离子交换层析等方法分离、纯化HBD2多肽。采用液体培养法，测定重组人β防御素2对大肠杆菌的抑菌活性。结果：构建了n为1、2、4或8倍的多拷贝串联nsmHBD2-cDNA表达载体，1、2和4倍smHBD2-cDNA的可溶蛋白比例分别为52％、48％和31％；而8倍HBD2-cDNA几乎不合可溶蛋白，目标蛋白以包含体形式表达，集中在不可溶部分。重组HBD2对E．coli K12 D31有较强的抑制作用，在终浓度约为0．4至0．5μg／ml时，90％细胞的生长被抑制。结论：采用融合表达、多拷贝串联表达方式，可增加产物长度以弱化蛋白酶的降解作用，也减弱了目标蛋白产物对宿主的毒性；适当的多拷贝串联基因可以提高HBD2的产量，但拷贝数过高会影响重组蛋白表达产量，且易形成不溶蛋白；在大肠杆菌中可达到具有生物学活性的HBD2多肽的原核高效表达。     

肿瘤血管导向肽与人突变IL-2融合蛋白的克隆、表达及生物学活性分析

目的获得具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽（NGR）融合表达的突变人IL-2蛋白.方法将突变人IL-2与NGR的融合基因重组到表达载体pET-22b（＋）并转化E.coli BL21（DE3）,测序正确后,IPTG诱导表达,并对产物进行纯化、复性和鉴定.结果目的蛋白以包涵体形式存在,占菌体总蛋白的40%以上,Western blot分析显示纯化后的目的蛋白具有免疫结合活性,CTLL-2细胞增殖实验证明具有生物学活性.结论具有生物学活性的与肿瘤血管导向肽融合表达的重组人IL-2蛋白可成功地克隆并表达,为进一步的肿瘤导向治疗打下基础.     

人神经生长因子的A-T克隆及在Pichia Pastoris酵母中的表达

目的对人含前导肽的β-NGF基因序列进行体外扩增、克隆及分析鉴定,并将其插入Pichiapastoris酵母分泌型表达载体pPIC9K中进行表达及鉴定.方法采用PCR技术,从人胎盘DNA基因组中扩增出含前导及信号肰的β-NGF基因序列;用A-r克隆法,与pGEM-T载体连接,经筛选得到重组质粒pGEM-Tβ-NGF,用酶切、PCR法及序列分析进行鉴定;将β-NGF插入酵母表达载体pPIC9K,用脂质体法导入CS115中,甲醇诱导分泌蛋白.结果亚克隆中,1.2%的琼脂糖凝胶电泳显示在748bp位置出现阳性条带;发酵液中蛋白SIS-PAGE电泳在14.OKD附近有特异表达带;蛋白表达量占菌体蛋白的30%;Westernblotting检测表明此带有特异活性.结论重组质粒pGEM-Tβ-NGF蛋白产量高,具有免疫活性.     

具有抗氧化活性的含硒短肽的研制

【立论依据】 硒蛋白是微量元素硒发挥生物学功能的主要形式。人体中硒蛋白在抗氧化、抗肿瘤和调节免疫等方面都具有显著的作用,其中抗氧化活性是多种硒蛋白最核心的生物学功能。研制一种具有潜在应用价值的、类似于硒蛋白的抗氧化活性的含硒短肽具有重要意义。 【设计思路】 选取抗氧化活性最强的硒蛋白如硒蛋白P、谷胱甘肽过氧化物酶等,设计出3~5种含硒代半胱氨酸活性中心的硒蛋白截短型的短肽,根据硒蛋白基因表达的特殊性构建其表达载体及其哺乳动物细胞表达体系,实现此类含硒短肽的准确、高效的翻译,再通过抗氧化检测筛选出具有应用开发价值的短肽。 【实验内容】 (1)用于硒蛋白基因工程表达的哺乳动物细胞株的建立:选择在人类硒蛋白翻译过程中将编码硒代半胱氨酸密码子TGA正确解码时起着重要作用的3个反式作用因子,即SECIS 结合蛋白2(SBP2)、Sec特异延伸因子(EFSec)和核糖体蛋白L30(RPL30),将它们的编码基因分别克隆并构建为1个三基因表达载体pcDNA3.1-SBP2/Efsec/RPL30,稳定转染HepG2细胞系获得目的基因高表达的单克隆细胞株;(2)利用生物信息学的方法,筛选和设计硒蛋白截短型的短肽,并将其编码基因插入真核表达载体pcDNA4HisMaxB获得相应的重组载体;(3)利用各重组载体分别对已建立的转基因细胞株进行稳定转染,使目的基因表达并纯化获得含硒短肽;(4)利用常规的抗氧化检测方法,考察各种含硒短肽体外抗氧化活性,并筛选出最佳者用于后续研究。 【材料】 人肝癌细胞系HepG2;质粒pcDNA3.1、pcDNA4HisMaxB;各种基因工程工具酶及常规试剂;细胞培养及转染试剂;抗氧化检测试剂盒等。 【可行性】 硒蛋白复杂的翻译机制已经逐渐阐明,在原核生物细胞中利用反式作用因子提高硒蛋白表达已取得成功,为真核表达提供重要的启示,我们的设计在理论上是可行的;实验室相关技术方法及条件成熟,完全可满足本研究的要求。 【创新性】 具有抗氧化活性的硒蛋白分子量大限制了其药用价值,我们研究中将获得截短型的含硒短肽从而使其具有应用开发价值。此外,应用3个反式作用因子构建硒蛋白基因工程表达体系也是本研究的一个创新。     

诱生型一氧化氮合酶特异性抑制肽的制备

目的：通过噬菌体展示技术筛选iNOS特异性抑制肽。方法：将iNOSFAD结合区及其附近序列的基因片段装入pET-28A( )，在大肠杆菌BL21中表达，His.bind^TM亲和层析柱纯化目的蛋白，使用纯化蛋白筛选Ph.D.-12^TM噬菌体库，筛选iNOS活性抑制作用较高的噬菌体克隆，测序并合成其中具有一致序列的短肽。结果：得到具有较高表达量的目的蛋白，经His.Bind^TM柱亲和层析纯化后纯度大于95％，以纯化蛋白筛选Ph.D.-12^TM噬菌体库，经4轮筛选获得10株iNOS活性抑制作用较高的噬菌体克隆，测序发现其中5株序列完全相同，合成该12肽，初步研究表明其对iNOS表现为高浓度抑制，低浓度兴奋的作用，而对nNOS及eNOS则没有影响。结论：以iNOSFAD片段蛋白为靶蛋白筛选得到的克隆对iNOS活性具有特异性影响，可根据这些特征设计合成小分子前导药物，创造新的活性药物。     

抗癌生物活性肽对实验性裸鼠肿瘤组织中p53和Bcl-2表达的影响

目的探讨抗癌生物活性肽(ACBP)作用于荷胃癌裸鼠后对肿瘤中p53和Bcl-2蛋白表达的影响,探讨ACBP可能的作用机制。方法成功建立荷胃癌裸鼠模型后将鼠随机分为2组,各组10只。对照组给予生理盐水;实验组腹腔注射活性肽0.4 mL(50 mg/L)。连续处理35 d,停药4 d后处死裸鼠,取肿瘤,应用免疫组化链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法检测突变型p53蛋白及Bcl-2蛋白的表达情况。结果 p53和Bcl-2蛋白在对照组肿瘤中阳性表达较强,在活性肽组中的表达均比对照组的表达弱,两组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论 ACBP对荷瘤裸鼠肿瘤生长有明显的抑制作用,可能是通过影响p53和Bcl-2的表达实现的。     

介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP功能肽段在E．coli中的可溶性表达及功能

目的：将介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP的重要功能肽段与GST蛋白在大肠杆菌中融合表达．方法：利用合成的特异性引物钓取金黄色葡萄球菌基因组中的目的片段,将其克隆人pGEX—KG载体,在大肠杆菌中与GST蛋白进行融合表达．结果：成功地表达了目的肽,可溶性的表达产物占细菌可溶性蛋白的20％左右,且目的肽与配基纤连蛋白Fn具有结合的能力．结论：成功地表达了介导金黄色葡萄球菌侵袭细胞的关键蛋白FnBP中的重要功能肽段,为研究金葡菌侵袭细胞的机制奠定了基础．     

赖型钩端螺旋体Loa22重组质粒的蛋白表达和对巨噬细胞的毒性作用

目的对赖型钩端螺旋体Loa22基因进行表达和功能研究。方法构建赖型钩端螺旋体Loa22成熟肽重组质粒,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)对重组质粒进行蛋白诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目标蛋白表达情况。经亲和层析获得目标蛋白并作用于小鼠巨噬细胞ANA-1,检测细胞上清液中乳酸脱氢酶(LDH)活力、四氮唑复合物(XTT)吸光度值和细胞凋亡率以评价其细胞毒性。结果成功构建Loa22成熟肽原核表达质粒,通过鉴定并纯化得到Loa22成熟肽,该蛋白使培养ANA-1细胞上清液中LDH活力升高,XTT吸光度值下降,细胞凋亡率增加。结论Loa22对ANA-1具有明显的毒性效性,该基因可能是致病钩体的一个重要毒力相关基因。     

抗炎、抗凝双效融合蛋白TAP-SSL5表达载体的构建及其功能研究

目的构建一种具有抗炎和抗凝双效功能的融合蛋白,并对其功能进行初步鉴定。方法将重组金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(staphylococcal superantigen-like protein-5,SSL5)与蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)融合,从金黄色葡萄球NCTC8325菌株中克隆SSL5基因;经DNA重组技术,将编码pelB前导序列、SSL5和TAP的基因重组并克隆于原核表达载体pHOG21中,再转染于大肠杆菌BL21中扩增表达,制备融合蛋白SSL5-TAP或TAP-SSL5,采用流式细胞仪检测融合蛋白是否和SSL5一样,具有与粒细胞表面P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)结合的特性;采用反应底物法在体外检测融合蛋白对活化的凝血因子X(factor Xa,FXa)活性的抑制作用。结果TAP-SSL5保留了SSL5与PSGL-1结合的特性,并且融合蛋白TAP-SSL5可显著抑制FXa的活性(P<0.01),抑制率达39.5%。结论融合蛋白TAP-SSL5是一种以PSGL-1为靶向的新型抗炎、抗...     

利用定向进化技术提高米黑霉脂肪酶活性及基因突变位点分析

目的:获得催化油脂活性明显提高的米黑霉脂肪酶(Rhizomucor miehei Lipase,RML)突变体。方法:选取大肠杆菌表达体系,利用定向进化技术,进行四轮易错PCR。结果:得到5个活性明显提高的酶突变体,其中突变体M5催化油脂活性可达(3 241±100)U/mg,而野生型脂肪酶活性为(253±30)U/mg,活性提高12倍。结论:结合RML成熟蛋白结构,对M5基因成熟区的5个突变位点Ser168、Ser173、phe240、Thr311、Asp313进行分析,发现Ser168、Ser173位于蛋白结构中覆盖活性中心的"盖子"结构附近,而phe240、Thr311、Asp313则分布在目标蛋白活性中心上下游的位置。据此,研究为RML基因的进一步改造提供重要的突变位点。     

电离辐射对小鼠胸腺细胞蛋白质表达的影响

目的 :观察低剂量 X射线全身照射诱导小鼠胸腺细胞蛋白质表达变化及对细胞内外蛋白质交换的影响。方法 :采用双向电泳方法。结果 :75m Gy X射线全身照射小鼠后 4h,细胞浆出现 5个新蛋白点、4个增强蛋白点及 3个减弱蛋白点。正常细胞浆中的 5个蛋白点在照射后消失。照射后细胞外液出现 1个新蛋白点、1个增强蛋白点及 1个减弱蛋白点。正常细胞外液中的 3个蛋白点在照射后消失。正常细胞浆中的 2个蛋白点在照射后分别减弱和消失 ,而在细胞外液中出现和增强。正常细胞外液中的 2个蛋白点在照射后消失 ,而出现在细胞浆中。结论 :低剂量辐射诱导小鼠胸腺细胞蛋白质表达变化 ,并促进细胞内外大分子物质的交换     

中药益气解毒颗粒对鼻咽癌裸鼠移植瘤蛋白质表达的影响

目的：探讨中药复方益气解毒颗粒抑制鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤生长的分子机制。方法：将鼻咽癌细胞系HNE1接种至BABL/c裸小鼠,20只,每只0.5×107个,待移植瘤生长至一定大小（约1 cm×1 cm×1 cm）,随机分为两组。中药组灌喂益气解毒颗粒药液,对照组灌喂生理盐水,30 d后处死裸鼠,解剖获取肿瘤组织,测量瘤体体积大小,称量瘤体重量。取100 mg瘤体组织,常规提取总蛋白质,用固相pH梯度双向凝胶电泳分离移植瘤组织的总蛋白质,银染显色,ImageMaster 2D Elite 4.01软件分析差异蛋白质点。随机选取表达差异点共19个,4个点为只在中药组表达,4个点仅在对照中表达,余下11个为表达相差5倍以上的点,进行质谱鉴定和生物信息学分析。结果：益气解毒颗粒药液能明显抑制鼻咽癌细胞裸鼠移植瘤的生长,灌喂中药组瘤体积和重量分别为（0.207±0.023）cm3和（0.132±0.021）g,对照组为（1.342±0.298）cm3和（1.017±0.015）g（P<0.05）;制率为84.58%。双向电泳图像分析蛋白质表达,益气解毒颗粒药物处理组平均蛋白质数为567±49,未处理组的平均蛋白质数为679±59;差异蛋白质有243个,其中有112个表达增强,有131蛋白质表达下降;差异蛋白质的质谱鉴定和生物信息分析,发现在中药组HKR2 protein,Phosphoribosyl pyrophosphate synthetase TNFR superfamily member和Apoptosis regulator BAX组特异表达,另外Mucin 5B precursor GTP--RNA guanylyltransferase等6个蛋白质高表达;而 Fibulin-3,Zinc finger protein 266 Carboxy terminus of HSP70-interacting protein等9个蛋白质不表达或表达下调。结论：益气解毒颗粒抑制鼻咽癌细胞裸鼠移植的生长与这些差异表达蛋白质有关,为中药作用的分子机制究提供了新的思路。     

新型肠道病毒89型结构蛋白VP1的构建表达及序列分析

目的研究克隆表达新型肠道病毒89型VP1结构蛋白．并进行活性鉴定和序列分析。方法分离肠道病毒89型VP1结构蛋白全基因,克隆入原核表达载体PET-28构建重组质粒pH—VP1,在大肠埃希菌BL21中进行表达,检测表达产物的特异性及活性。将EV89VP1核酸序列与Genbank数据库中的序列进行比对并建立系统进化树。结果重组质粒在1mmol／L的IPTG37℃诱导7h后可诱导表达得到约33kD的蛋白。经WesternBlot实验检测证明表达的融合蛋白具有EV89抗原的活性。分离的EV89病毒其VP1区核酸序列与Genbank数据库中仅有的3株EV89序列同源性分别为86．4％、85．9％、85．6％。结论成功构建EV89重组蛋白．其表达产物具有良好的特异性及活性,可进-步用于VP1检测方法的研制。进化分析表明,分离的EV89VP1区与Genbank数据库中其他分离株亲源性较远。     

贲门癌中p16和Rb基因表达的研究

目的探讨与细胞周期调节相关的基因p06和Rb基因在贲门癌中的表达及其意义。方法用SP免疫级化法对58例贲门癌进行p16和Rb基因蛋白的检测。结果随着贲门癌恶性程度的加重和浸润的加深，p16基因蛋白的阳性表达率逐渐降低，而Rb基因蛋白的阳性表达率逐渐升高（P＜0．05）。p16和Rb基因蛋白的表达呈显著负相关（P＜0．05）。结论p16和Rb基因蛋白的表达异常在贲门癌的发生发展中起重要作用。p16基因蛋白对Rb基因蛋白的表达具有负性调节作用。     

ATP结合盒蛋白E1在真核生物中的作用

ATP结合盒(ATP-binding cassette,ABC)蛋白超家族是真核生物进化过程中最为保守的一类蛋白。ABCE1是ABC超家族中E亚家族的唯一成员,除可抑制哺乳动物核糖核酸酶L外,还参与真核生物蛋白合成的翻译起始、终止及核糖体循环,并有可能成为新的抗肿瘤靶点。本文对ABCE1的基本生物学特性及其生物学作用作一介绍。     

抑癌蛋白p21和p53表达与胃癌细胞增殖的关系

为探讨抑癌蛋白ｐ２１和ｐ５３的表达与胃癌恶性生长的关系，选择８８例手术切除的胃癌和胃溃疡蜡块标本，用免疫组织化学方法检测上述标本中ｐ２１，ｐ５３和ＰＣＮＡ的表达。结果表明：胃癌组织中ｐ５３的突变蛋白表达率约为４０％，ｐ２１蛋白在胃粘液腺癌和低分化及未分化型腺癌表达明显低下，ＰＣＮＡ在胃腺癌中的表达水平高。提示胃癌细胞ｐ２１蛋白水平（低）和ｐ５３的突变与胃癌的发病有一定的关系，而与胃癌细胞恶性增长的关系不明显     

结核分枝杆菌CFP-10蛋白的克隆及表达

目的通过构建结核分枝杆菌CFP-10蛋白表达载体,在大肠杆菌表达,为探索重组多肽在结核病血清学诊断的应用奠定前期实验基础。方法用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出CFP-10基因片段,连接到表达载体PET30a上,在大肠杆菌中表达;组氨酸标签（His-Tag）镍柱层析纯化重组蛋白。结果构建了含CFP-10重组质粒的大肠杆菌工程菌,发现目的蛋白主要以可溶性蛋白形式存在。结论 CFP-10蛋白基因克隆入宿主菌中并表达成功。     

Tat-GFP融合蛋白的表达纯化及其穿膜活性

目的：获得具备穿膜活性与绿色荧光蛋白（GFP）标记的Tat-GFP融合蛋白,探讨Tat-GFP在MCF-7细胞中的跨膜转运特性。方法：应用pET-24a-Tat-GFP质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞,检测不同异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）浓度（0.5和1.0 mmol•L^-1）和不同温度（22℃和37℃）诱导融合蛋白的表达情况;利用Ni-IDA树脂亲和纯化Tat-GFP蛋白,利用GFP特异性抗体采用Western blotting法分析洗脱液中的蛋白;激光共聚焦荧光显微镜下检测Tat-GFP融合蛋白的跨膜转运活性。 结果：0.5和1.0 mmol•L^-1 IPTG诱导出的细菌总蛋白中所含的Tat-GFP蛋白量无明显差异;低温（22℃）诱导生产的Tat-GFP蛋白量较37℃更高;Western blotting分析,GFP抗体能够特异性识别PVDF膜上的蛋白,条带灰度与Tat-GFP蛋白上样量有关联;细胞穿膜实验,绿色荧光分布于MCF-7细胞的细胞质和细胞核中。 结论：低温诱导时大肠杆菌BL21菌体上清液中Tat-GFP融合蛋白量更高,所生产的Tat-GFP融合蛋白既具备穿膜活性又具有易于检测的绿色荧光。     

GST-hCAP融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的:构建GST标签的人c-Cbl相关蛋白(GST-hCAP)融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导其表达.方法:从COS-1细胞中提取mRNA,反转录为cDNA.用PCR方法扩增出hCAP基因全长,通过EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点将其定向插入pGEX-5X-1载体中,构建原核表达质粒pGEX-5X-1-hCAP,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定.结果:酶切电泳及测序结果证明,原核表达质粒GST-hCAP构建成功,用Western blot方法也证实了GST-hCAP融合蛋白的表达.结论:成功地构建了GST-hCAP原核表达载体,证实了其在原核细胞大肠埃希菌中的表达,为进一步纯化CAP及研究其结构与功能提供了前提基础.     

LRP16编码蛋白的信息学分析及亚细胞定位研究

目的：探讨LRP16基因编码蛋白的基本生物学特征及其在真核细胞中的分布。方法：以Internet为操作平台、以国际公共生物数据库为实验材料、应用生物学软件为研究工具为LRP16编码蛋白进行了全方位的生物信息学分析。在此基础上，将该基因的编码序列重组到pEGFP-N1真核表达中，融合在绿色荧光蛋白（GFP）的N端转染HeLa细胞，激光共聚焦显微镜观察荧光分布。结果：LRP16产物主要与一些RNA病毒产生的与核酸结合的非结构蛋白有较高相似性，含有与功能未知的Motif:Hismacro、DUF27、A1pp相似的结构域。激光共聚焦显微镜扫描发现GFP分布于细胞核内。结论：LRP16基因编码一种起源古老、进化缓慢的核蛋白因子，在细胞多种生命活动过程中应有重要作用。