DR4基因启动子甲基化对TRAIL诱导肺鳞癌细胞凋亡作用的影响

目的:探讨肺鳞癌中死亡受体4（DR4）不同甲基化状态是否会影响肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)对肺鳞癌细胞的诱导凋亡作用。方法:采用甲基化特异性PCR（MSP）、RT-PCR和Western blot法检测5-氮-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）处理肺鳞癌细胞株（H226、SK-MES-1、H520）前后DR4基因启动子甲基化状态和基因表达情况;MTT法检测细胞增殖抑制率,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:MSP、RT-PCR和Western blot结果表明H226、SK-MES-1细胞DR4基因呈甲基化状态,其mRNA及蛋白均低表达,H520细胞中DR4基因呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白高表达;5-Aza-CdR干预后H226、SK-MES-1细胞DR4基因呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白表达较前均显著上调,差异有统计学意义（P＜0.05）,H520仍呈非甲基化状态,其mRNA及蛋白表达量较前无明显差异。同时研究还证实TRAIL对H226、SK-MES-1细胞有不同程度的细胞增殖抑制率和凋亡率,但不敏感,5-Aza-CdR干预后,H226及SK-MES-1细胞对TRAIL的敏感性较前均显著增高（P＜0.05）。结论:5-Aza-CdR可以逆转肺鳞癌中DR4基因启动子甲基化状态,进而增加TRAIL诱导肺鳞癌细胞凋亡的作用。5-Aza-CdR联合TRAIL可能是治疗肺鳞癌的一种新策略。     

5-氮-2’-脱氧胞苷对肺癌A549细胞凋亡及14-3-3σ表达的影响

目的:探讨5-氮-2’脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人肺癌A549细胞凋亡及抑癌基因14-3-3σ表达的影响。方法:以浓度为0.5、5、50μmol/L的5-Aza-CdR处理人肺癌细胞株A549,常规培养采用四唑盐(MTT)比色法观察细胞的生长活性,甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)检测14-3-3σ基因甲基化状态;以FQ-PCR法检测14-3-3σmRNA的表达,并用流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:5-Aza-CdR能明显抑制肿瘤细胞的生长,随5-Aza-CdR浓度增加及培养时间的延长,细胞生长率下降;药物处理后14-3-3σmRNA表达明显升高,细胞凋亡率与5-Aza-CdR剂量呈正相关。结论:5-Aza-CdR能使14-3-3σ基因去甲基化、促进细胞凋亡、增强抑癌功能。     

卡铂联合TRAIL对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察卡铂联合TNF相关凋亡诱导配体(TRAIL)对人肺腺癌细胞A549增殖和凋亡的影响。方法:经20、40、80 μg/mL卡铂和100 ng/μL TRAIL单用或联用处理后,用MTS法检测A549细胞的增殖能力,在光镜下观察细胞形态学变化;并采用流式细胞术检测细胞凋亡情况;RT-PCR和Western blot法检测死亡受体4(DR4)、死亡受体5(DR5)、Survivin和X连锁凋亡抑制蛋白基因(XIAP)mRNA与蛋白表达的变化。结果:卡铂和TRAIL单用或联用均可浓度依赖性抑制A549细胞的增殖,诱导其凋亡,两药联用比单用卡铂时抑制率和凋亡率更高(P<0.05)。单用卡铂或TRAIL可使A549细胞数减少,漂浮细胞增多,出现明显的凋亡形态变化,且明显降低Survivin和XIAP的mRNA和蛋白表达水平(P均<0.05);但对A549细胞DR4和DR5 mRNA表达均无明显影响,而单用卡铂或TRAIL却能升高A549细胞DR5蛋白的表达(P<0.05)。与单用组相比,TRAIL与卡铂联用A549细胞凋亡形态变化更明显,可明显降低A549细胞Survivin和XIAP mRNA和蛋白的表达水平及升高DR5蛋白表达水平(P<0.05)。结论:卡铂与TRAIL联用可协同抑制肺癌细胞A549细胞增殖,促进其凋亡,且与卡铂能够增加A549细胞DR5蛋白的表达和降低Survivin及XIAP的表达相关。     

hMLH1基因启动子甲基化与非小细胞肺癌细胞顺铂耐药方面的研究

背景与目的：hMLH1启动子甲基化是肺癌发生、发展的因素之一,但与肺癌细胞耐药方面的研究尚未见报道,本研究旨在探讨是否能通过去甲基化作用恢复hMLH1基因表达从而逆转A549/DDP细胞对顺铂的耐药。方法：RT-PCR检测A549及A549/DDP细胞的hMLH1表达情况,及5-氮杂-2＇-脱氧胞苷（5-Aza-2＇-eoxycytidine,5-Aza-CdR）干预A549/DDP细胞后hMLH1表达情况;MSP检测A549、A549/DDP细胞及5-Aza-CdR干预A549/DDP细胞后hMLH1甲基化状态。MTT试验、Hoechst33258染色、流式细胞仪（FCM）分别观察5-Aza-CdR干预前后顺铂对A549/DDP细胞抑制率、凋亡的形态学变化和凋亡指数。结果：hMLH1mRNA在A549中的表达高于A549/DDP细胞;A549细胞hMLH1为非甲基化状态,A549/DDP细胞为部分甲基化状态,经5-Aza-CdR去甲基作用后hMLH1呈非甲基化状态;A549组、A549/DDP组、经10μmol/L5-Aza-CdR干预后的A549/DDP组经顺铂作用后的IC50值分别为（4.7&#177;0.7）、（30.1&#177;1.8）和（6.9&#177;0.6）μmol/L;5-Aza-CdR干预后的A549/DDP细胞经顺铂作用后,比单用顺铂抑制A549/DDP细胞的凋亡形态学改变明显,凋亡小体以及核固缩现象增多。结论：hMLH1甲基化可能参与了A549/DDP细胞的顺铂耐药过程;5-Aza-CdR能抑制hMLH1甲基化,恢复hMLH1表达,并能增强顺铂对A549/DDP细胞增殖抑制和凋亡。     

miR-194-5p调控LMNB1抑制肺腺癌细胞的生长转移

目的:探究miR-194-5p调控LMNB1对肺腺癌细胞生长转移的作用。方法:实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验检测肺腺癌组织和癌旁组织中miR-194-5p、LMNB1表达水平。体外培养肺腺癌细胞A549,分为对照组、miR-194-5p mimics阴性对照组、miR-194-5p mimics组。转染处理后,CCK-8实验检测各组A549细胞增殖情况,比较各组细胞活力;流式细胞实验检测各组A549细胞凋亡率;细胞划痕及Transwell小室侵袭实验分别检测各组A549细胞迁移、侵袭力,比较各组细胞迁移、侵袭数;免疫印迹实验检测各组A549细胞凋亡蛋白caspase-3、Bax和上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin、Vimentin表达;qRT-PCR实验及免疫印迹实验分别检测各组A549细胞miR-194-5p、LMNB1 mRNA表达及LMNB1蛋白表达。结果:相比癌旁组织,肺腺癌组织中miR-194-5p表达水平明显降低（P＜0.05）,LMNB1表达水平明显升高（P＜0.05）。相比对照组,miR-194-5p mimics组A549细胞活力、细胞迁移数、细胞侵袭数、LMNB1 mRNA表达水平、Vimentin和LMNB1蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）,细胞凋亡率、miR-194-5p表达、caspase-3、Bax和E-cadherin蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。miR-194-5p mimics阴性对照组A549细胞上述各指标与对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。结论:miR-194-5p可下调LMNB1表达,抑制肺腺癌细胞增殖,促进其凋亡,并降低其迁移及侵袭能力。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对肝癌细胞HepG2凋亡及其PEG10基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对人肝癌细胞系HepG2凋亡及其PEG10基因表达调控的影响,进一步探讨肝癌的发病机制及5-Aza-CdR治疗肝癌的可行性。方法用浓度为50 μmol/L的5-Aza-CdR分别处理HepG2细胞24、48、72 h,hoechst 33342/PI 双染荧光显微镜检测HepG2细胞凋亡情况。RT-PCR、Western blot法分别检测PEG10 mRNA和蛋白表达水平的变化。结果与对照组相比,5-Aza-CdR作用24、48、72 h后,HepG2细胞的凋亡率明显升高,PEG10 mRNA 和蛋白表达水平显著下降,并呈现时间依赖性（P＜0.05）。结论5-Aza-CdR 可促进HepG2细胞凋亡并抑制PEG10基因的表达。     

大黄素对人肺腺癌A549细胞体外增殖凋亡及VEGF和TNF-α分泌的影响

目的为大黄素抗肺腺癌的临床应用提供理论依据。方法MTT实验检测大黄素不同浓度梯度（5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L,80μmol/L）和时间梯度（12,24,48和72 h）处理后A549细胞的增殖活力;Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术和Hoechst 33258染色法检测大黄素作用A549细胞后引起的细胞凋亡程度;应用酶联免疫吸附分析（ELISA）实验检测大黄素各处理组培养上清液中所含的VEGF、TNF-α的浓度。结果大黄素体外可浓度和时间依赖性地抑制人肺腺癌A549细胞的增殖活力及促进细胞凋亡,抑制A549细胞VEGF的表达和分泌,促进TNF-α的表达和分泌。结论大黄素具有抗增殖、促凋亡、抗血管生成等多种潜能,具有良好的抗人非小细胞肺癌特别是肺腺癌的临床应用前景。     

5-氮杂-2′-脱氧胞苷对非小细胞肺癌体外生长及侵袭能力和TFPI-2基因mRNA表达的影响

目的 探讨5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine,5-Aza-CdR)干预对非小细胞肺癌(nonsmallcell non cancer, NSCLC)细胞株A549生长增殖及其组织因子途径抑制物2(tissue factor pathwayinhibitor-2,TFPI-2)基因表达的影响,同时探讨5-Aza-CdR能否通过恢复TFPI-2基因表达抑制非小细胞肺癌A549细胞侵袭能力。方法 用不同浓度的5-Aza-CdR处理A549细胞株,MTT法检测药物处理24、48、72 h后的细胞增殖活性,流式细胞仪(fl ow cytometry, FCM)法检测药物处理72 h后细胞周期分布,Real-time PCR技术检测药物处理72h后A549细胞TFPI-2基因mRNA的表达,Transwell小室法测定药物处理24h后A549细胞体外侵袭能力的变化。 结果 MTT检测显示不同浓度5-Aza-CdR处理A549细胞24、48、72h后,细胞的生长受到抑制,且抑制作用呈明显的剂量和时间依赖性。FCM检测分析显示0、1、5、10 μM 5-Aza-CdR处理A549细胞72 h 后,细胞增殖指数逐渐降低,分别为（30.43±0.99)%、（23.89±0.83)%、（16.19±0.34)%、（6.49±0.55%（P＜0.05）。Real-timePCR检测显示0、1、5、10 μM的5-Aza-CdR处理A549细胞72 h后,相对mRNA表达水平分别为（1±0)、（1.49±0.14)、（1.86±0.09)、（5.80±0.15)（P<0.05）,TFPI-2 基因mRNA表达呈明显的上升趋势,且随着药物浓度增加而增加。Transwell小室法检测显示每一高倍镜下平均穿膜细胞数分别为（316.15±18.7)、（84.15±12.14)、（28.85±7.13)、（14.35±3.33),均明显低于对照细胞（P<0.05）。结论 5-Aza-CdR能通过降低TFPI-2基因的甲基化而恢复其在非小细胞肺癌细胞株A549细胞中的表达,并抑制A549细胞的增殖和侵袭。     

肺癌细胞DAPK基因启动子甲基化与吉非替尼敏感性的相关性研究

目的 探讨死亡相关蛋白激酶（DAPK）基因启动子区域甲基化对非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株中表皮生长因子酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）敏感性的影响。方法 采用不同浓度吉非替尼作用2株EGFR外显子19缺失突变型（H1650、PC9）和2株EGFR野生型（A549、H520）NSCLC细胞。5-氮杂-2′-脱氧胞苷（5-aza-CdR）去甲基化处理,用CCK-8法检测细胞增殖率,流式细胞技术检测细胞凋亡率,荧光定量PCR法检测DAPK mRNA表达情况,甲基化特异性PCR（MSP）法检测DAPK启动子区甲基化状态。结果 吉非替尼对4种细胞株均存在不同程度的增殖抑制作用,呈浓度依赖性。5-aza-CdR去甲基化后,H1650细胞及H520细胞对吉非替尼的敏感性较前增强（P＜0.05）;流式细胞仪检测显示,H1650、H520细胞凋亡率上升较明显（P＜0.05）。未经5-aza-CdR处理的细胞株中,吉非替尼敏感型的PC9、A549细胞株存在DAPK mRNA高表达,其基因启动子处于非甲基化状态;吉非替尼耐药型的H1650、H520细胞株DAPK mRNA表达水平较低,DAPK启动子处于高甲基化状态。5-aza-CdR去除H1650及H520细胞的DAPK基因启动子区甲基化后,DAPK基因表达及对吉非替尼的敏感性较前显著升高（P＜0.05）;而吉非替尼敏感的PC9及A549细胞株经5-aza-CdR处理后未见明显改变（P＞0.05）。结论 抑癌基因DAPK启动子区域的高甲基化能够下调DAPK基因的表达,从而降低NSCLC对吉非替尼的敏感性。对DAPK基因进行甲基化状态检测,可能为临床上预测吉非替尼疗效提供新的手段。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷联合低浓度顺铂对肺癌细胞增殖影响的实验研究

目的 探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）与低浓度顺铂（DDP）联合用药对非小细胞肺癌（NSCLC）A549细胞增殖的影响。方法 选择1μmol／L DDP、10μmol／L 5-Aza-CdR及两者联合分别处理体外培养的A549细胞,MTT法检测处理前后的细胞增殖活性,流式细胞仪、Hoechst 33258染色分别观察处理前后的细胞周期、凋亡率及凋亡形态学变化。结果 MTT法显示,与单独1μmol／L DDP组比较,联合组能够明显抑制A549细胞的增殖,A549细胞的凋亡率亦明显增加;流式细胞仪显示,联合组作用于细胞G0／G1期,使A549细胞生长阻滞在此期,细胞的增殖指数降低;与单独1μmol／L DDP组比较,联合组A549细胞的凋亡形态学改变更明显。结论5-Aza-CdR联合低浓度DDP能够明显抑制NSCLC A549细胞的增殖和诱导A549细胞的凋亡。     

耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的研究

目的检测耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株(A549/Taxol)中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态,探讨A549/Taxol细胞对紫杉醇的耐药机制。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)技术,检测耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株BRCA1基因启动子CpG岛甲基化状态。结果 A549/Taxol细胞存在BRCA1基因异常甲基化,呈部分甲基化。结论 A549/Taxol细胞存在BRCA1基因异常甲基化,可能是A549/Taxol细胞对紫杉醇耐药的机制之一。     

Effect of 5-aza-2’-deoxycytidine on Cell Proliferation of Nonsmall Cell Lung Cancer Cell Line A549 Cells and Expression of the TFPI-2 Gene

Objective: The present study employed 5-aza-2’-deoxycytidine (5-Aza-CdR) to treat non-small cell lung cancer(NSCLC) cell line A549 to investigate the effects on proliferation and expression of the TFPI-2 gene. Methods:Proliferation was assessed by MTT assay after A549 cells were treated with 0, 1, 5, 10 μmol/L 5-Aza-CdR, a specificdemethylating agent, for 24 ,48 and 72h. At the last time point cells were also analyzed by flow cytometry (FCM)to identify any change in their cell cycle profiles. Methylation-specific polymerase chain reaction (MSPCR), realtime polymerase chain reaction(real-time PCR) and western blotting were carried out to determine TFPI-2 genemethylation status, mRNA expression and protein expression. Results: MTT assay showed that the growth ofA549 cells which were treated with 5-Aza-CdR was significantly suppressed as compared with the control group(0 μmol/L 5-Aza-CdR). After treatment with 0, 1, 5, 10 μmol/L 5-Aza-CdR for 72h, FCM showed their proportionin G0/G1 was 69.7±0.99%, 76.1±0.83%, 83.8±0.35%, 95.5±0.55% respectively (P<0.05), and the proportion in Swas 29.8±0.43%, 23.7±0.96%, 15.7±0.75%, 1.73±0.45%, respectively (P<0.05), suggesting 5-Aza-CdR treatmentinduced G0/G1 phase arrest. MSPCR showed that hypermethylation in the promoter region of TFPI-2 genewas detected in control group (0 μmol/L 5-Aza-CdR), and demethylation appeared after treatment with 1, 5,10 μmol/L 5-Aza-CdR for 72h. Real-time PCR showed that the expression levels of TFPI-2 gene mRNA were1±0, 1.49±0.14, 1.86±0.09 and 5.80±0.15 (P<0.05) respectively. Western blotting analysis showed the relativeexpression levels of TFPI-2 protein were 0.12±0.01, 0.23±0.02, 0.31±0.02, 0.62±0.03 (P<0.05). TFPI-2 proteinexpression in A549 cells was gradually increased significantly with increase in the 5-Aza-CdR concentration.Conclusions: TFPI-2 gene promoter methylation results in the loss of TFPI-2 mRNA and protein expressionin the non-small cell lung cancer cell line A549, and 5-Aza-CdR treatment could induce the demethylation ofTFPI-2 gene promoter and restore TFPI-2 gene expression. These findings provide theoretic evidence for clinicaltreatment of advanced non-small cell lung cancer with the demethylation agent 5-Aza-CdR. TFPI-2 may be onemolecular marker for effective treatment of advanced non-small cell lung cancer with 5-Aza-CdR.     

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对肺癌细胞H460生物学行为及抑癌基因RASSF1A表达的影响

 目的　观察5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-Aza-CdR）对肺癌细胞H460的生物学行为及RASSF1A mRNA表达的影响。方法　5-Aza-CdR处理H460细胞,通过MTT方法、平板克隆试验观察细胞生长活性的变化,PCR检测RASSF1A甲基化状态,Western blotting法检测RASSF1A的蛋白表达,流式细胞术进行细胞周期分析。结果　H460细胞经5-Aza-CdR处理后,与未处理组相比,生长速度出现不同程度减慢,克隆形成率明显降低,RASSF1A甲基化程度降低,延缓H460细胞周期G1／S进程,使细胞阻滞于G1期。结论　在肺癌细胞系中,RASSF1A基因甲基化可能导致其表达缺失,而5-Aza-CdR能够恢复RASSF1A基因的表达,为肺癌的去甲基化治疗提供理论依据。     

5氮杂脱氧胞苷对鼻咽癌细胞RASSF1A基因甲基化和mRNA表达的影响

目的:研究5氮杂脱氧胞苷对鼻咽癌CNE2细胞中RASSF1A基因甲基化和mRNA表达的影响。方法:用不同浓度(0、5、10、20μmol/L)5氮杂脱氧胞苷处理CNE2细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)法对处理后细胞中RASSF1A基因甲基化状态进行检测;并用SYBR Green qReal Time-PCR法检测RASSF1A mRNA的表达。结果:阴性对照组CNE2细胞中,RASSF1A基因呈完全甲基化状态,当用5μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,CNE2细胞出现非甲基化产物,20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,CNE2细胞甲基化状态完全被逆转,均为非甲基化产物。阴性对照组CNE2细胞RASSF1A基因呈低表达,经5～20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,RASSF1A mRNA的相对表达量逐渐增加,10和20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理组,RASSF1A mRNA表达水平均明显高于阴性对照组(P0.01);且20μmol/L处理组明显高于5μmol/L处理组(P0.01)。结论:CNE2细胞RASSF1A基因甲基化可以被5氮杂脱氧胞苷逆转,且5氮杂脱氧胞苷可促进RASSF1A mRNA的表达。     

人非小细胞肺癌细胞EGFR基因启动子甲基化与吉非替尼敏感性之间的相关性研究

目的 探讨EGFR基因启动子甲基化水平与人非小细胞肺癌（NSCLC）细胞株对吉非替尼敏感性之间的相关性。方法 用不同浓度吉非替尼分别作用于NSCLC细胞株HCC827、H1650、H1975、H358、H1299、A549后,CCK-8法检测细胞增殖抑制率,DNA直接测序法、实时荧光定量PCR法、免疫印迹法和甲基化特异性PCR法分别检测上述NSCLC细胞株EGFR基因突变、EGFR mRNA、EGFR蛋白表达和启动子区甲基化状态。结果 CCK-8法检测结果显示,19外显子缺失突变的HCC827细胞对吉非替尼最敏感,而同为19外显子缺失突变的H1650细胞对吉非替尼不敏感;野生型的H358细胞对吉非替尼中度敏感,其敏感性甚至超过19外显子突变的H1650细胞,而同为EGFR野生型的H1299、A549细胞对吉非替尼敏感性较差。吉非替尼处理72h后,HCC827细胞与H358细胞相比、HCC827细胞和H358细胞与其他4株细胞相比,IC50值均有显著性差异（P＜0.05）。HCC827细胞EGFR启动子为未甲基化状态,其EGFR蛋白和mRNA表达最高;H358细胞为部分甲基化,其EGFR蛋白和mRNA为中等表达;其他4个细胞株均为高甲基化状态,EGFR蛋白和mRNA呈低表达;HCC827细胞的EGFR表达水平较H358细胞高,HCC827和H358细胞的EGFR表达较其他4个细胞株高,差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 EGFR基因启动子区高甲基化可能下调EGFR基因的表达水平,从而降低NSCLC对吉非替尼的敏感性;对该基因的甲基化检测可能对预测吉非替尼治疗NSCLC疗效有一定的临床指导意义。     

5-氮杂-2’-脱氧胞苷逆转CNE-2Z细胞RASSF1A基因甲基化的研究

目的观察去甲基化剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)对人低分化鼻咽癌细胞系CNE-2Z RASSF1A基因的去甲基化作用。方法用5-Aza-CdR处理CNE-2Z细胞后,应用甲基化特异性PCR(MSP)检测RASSF1A基因的甲基化情况,免疫细胞化学检测RASSF1A基因表达改变,细胞生长曲线和平板克隆形成试验分别检测细胞生长能力和克隆形成能力。结果 CNE-2Z细胞RASSF1A基因呈高甲基化和阴性表达。经5-Aza-CdR处理,第1～2天RASSF1A基因高甲基化状态不改变,第3天部分去甲基化,第4天后全去甲基化,5-Aza-CdR处理停止2天后仍保持全去甲基化。随着RASSF1A基因去甲基化,RASSF1A呈明显阳性表达、细胞生长和平板克隆形成能力明显下降。结论 RASSF1A基因在CNE-2Z细胞中因高甲基化而失表达。5-Aza-CdR可诱导CNE-2Z细胞RASSF1A基因完全去甲基化而增强其表达,明显抑制CNET-2Z细胞生长和克隆形成能力。