限制性显示-聚合酶链反应扩增苏云金杆菌基因片段的克隆与分析

目的运用限制性显示-PCR技术(RD-PCR)扩增苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)基因片段,并进行克隆、测序分析。方法设计特异性引物扩增长片段Bt基因,对扩增产物进行RD-PCR扩增,扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。提取阳性克隆质粒进行测序分析。结果运用RD-PCR技术,将长片断的基因(2 000-3 000 bp)分为多个短的片段,片段长度较为均一(200~600 bp)。测序结果表明,所扩增的片段均属于特异扩增的Bt基因。结论运用RD-PCR技术可以将长片段基因进行片段化,使其适用于基因芯片的探针。     

HIV-1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的　克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（ＲＤ－ＰＣＲ）扩增的ＨＩＶ－１基因片段。方法　将所有ＨＩＶ－１基因片段 分成１０组并进行ＲＤ－ＰＣＲ扩增,纯化各组ＰＣＲ产物后将之克隆至Ｔ载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩 增靶片段并测序。结果　序列分析表明,所扩增的片段均属于ＨＩＶ基因。结论　改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并 用于限制性显示扩增片段的克隆。     

HIV—1基因限制性显示片段的克隆与序列分析

目的：克隆并分析经限制性显示－聚合酶链反应（RD－PCR）扩增的HIV－1基因片段。方法：将所有HIV－1基因片段分成10组并进行RD－RCR扩增,纯化各组PCR产物后将之克隆至T载体上并快速鉴定。从阳性克隆中提取质粒,扩增靶片段并测序。结果：序列分析表明,所扩增的片段均属于HIV基因。结论：改良了一种多片段的克隆及鉴定方法并用于限制性显示扩增片段的克隆。     

聚合酶链反应与限制性片段长度多态性分析检测沙门菌

沙门菌是常见的人畜共患致病菌 ,有 2 32 4个血清型。在我国发现 2 6个菌群 ,16 1个血清型 ,人群中最常见的是伤寒杆菌 (Ｓ ,ｔｙｐｈｉ) ,肠炎沙门菌(Ｓ ,ｅｎｔｅｒｉｔｄｉｓ)等 10余种 ,临床上常见的为肠炎型 ,口服此型细菌污染的食物引起中毒 ,潜伏期短 ,发病急。目前对沙门菌的检测仍沿用传统分离培养及血清学方法 ,不仅繁琐 ,需要 4～ 7天才能出报告 ,而且检出率低 ,已不适于临床的快速诊断。因此 ,建立快速而特异的检测方法具有重要的流行病学意义和临床应用价值。本文在传统聚合酶链基础上 ,引入限制性内切酶片段长度多态性分析法 …     

T—载体在聚合酶链反应扩增产物克隆中的应用

目的 探讨克隆聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增产物的简便方法。方法 用ＰＣＲ方法分别特异性扩增Ｗｉｌｍｓ瘤基因ｗｔ１和尿激酶受体（ＵＰＡＲ）基因,并利用Ｔａｐ聚合酶具有的延伸酶活性将扩增产物直接克隆入Ｔ－载体,ＥｃｏＲＩ酶切鉴定阳性重组子。结果设计的引物可分别扩增ｗｔ１基因锌指区（３４３ｂｐ）和ＵＰＡＲ基因编码区全长（１０８３ｂｐ）;未经修饰的常规ＰＣＲ和高保真ＰＣＲ扩增产物可被直接克隆入ｐＧＥＭ－Ｔ     

利用聚合酶链反应扩增红细胞生成素基因片段

利用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增红细胞生成素（ＥＰＯ）基因片段时，通过用３２Ｐ－ｄＣＴＰ取代反应体系中的ｄＣＴＰ，直接合成３２Ｐ标记的ＥＰＯ基因探针．以此为探针经斑点印迹杂交技术证实慢性肾功能衰竭贫血大鼠肾脏ＥＰＯ因表达活性增强。     

聚合酶链反应-限制性片段长度多态性检测载脂蛋白E基因多态性及初步应用

目的 :建立聚合酶链反应—限制性片段长度多态性 (PCR- RFL P)分析结合 DNA直接银染技术检测载脂蛋白 E基因多态性。方法 :选择江苏地区汉族健康人 16 8例及冠心病 6 3例 ,PCR扩增 Apo E基因第 4外显子包含编码第 112位和第 15 8位氨基酸残基的基因序列 ,cfo I限制性内切酶酶切后电泳 ,银染色后分析 Apo E基因型。结果 :汉族健康人群及冠心病人群 Apo E基因型频率分别为 :ε2 /2 0 .6 % ,0 ;ε2 /3 11.9% ,14.3% ;ε2 /4 1.2 % ,4.8% ;ε3/4 10 .7% ,17.5 % ;ε3/3 75 .0 % ,6 1.9% ;ε4/4 0 .6 % ,1.6 % ;Apo E等位基因频率分别为 :ε2 7.14% ,9.5 2 % ;ε386 .31% ,77.78% ;ε46 .5 5 % ,12 .70 %。结论 :PCR- RFL P方法快速、简便、准确性和可靠性高 ,适合普通实验室开展及大规模研究     

大肠杆菌poly(A)化mRNA基因片段的RD-PCR克隆

目的研究大肠杆菌(E.coli)中哪些基因mRNA3'端存在poly(A)化。方法利用E.colimRNA中可能存在的poly(A)尾,以oligo(dT)-cellulose进行mRNA的纯化,并以oligo(dT)18为引物逆转录合成cDNA,应用限制性显示-聚合酶链反应(RD-PCR)分离不同组别的基因片段并进行克隆。结果成功克隆100多个基因片段,并对其中30个进行了测序分析。结论细菌mRNA的poly(A)化可能不是偶然和个别的现象。     

利用RD技术对HCV-1b基因片段的克隆与分析

目的：利用限制性显示(RD)技术对丙型肝炎病毒1b亚型(HCV-1b)基因片段进行克隆与分析。方法：用限制性内切酶Sau3AⅠ消化HCV-1b cDNA，所得的限制性内切酶片段物进行RD-PCR扩增，扩增后的产物克隆至pMD18-T载体并进行快速鉴定。结果：得到20个大小均一(200—1000bp)的限制性片段，测序结果表明，属于HCV-1b基因。结论：RD技术能快速收集大量长度适宜、大小相对均一的病毒基因片段，能很好地用于建立cDNA文库及制备诊断芯片探针。     

应用限制性差异显示技术制备实验用DNA标记物

目的 建立实验室用DNA标记物。方法 依据PCR引物设计软件Oligo5设计通用引物，对质粒DNA进行PCR。结果 通过PCR反应，电泳后可见清晰的DNA条带，将已确定长度的DNA片段再进行PCR反应，与商用DNA标记物进行比较显示，用此法制备的DNA标记物可以作为实验室进行凝胶电泳的DNA标记物。结论 采用限制性差异显示技术制备DNA标记物，不仅操作简便、快捷、提高工作效率，且大大降低费用，更适合实验室实际需要。     

人源性蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因的克隆及序列分析

目的克隆蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,并应用生物信息学方法进行分析。方法根据蓝氏贾第鞭毛虫Elp3已知基因序列的特点设计引物,利用PCR技术扩增获得Elp3的核苷酸序列,连接到pET28a载体并测定序列。应用生物信息学方法分析Elp3基因的序列同源性与结构特征。结果扩增片段长度为1767bp,测序结果与蓝氏贾第鞭毛虫WB株(GL50830)同源性100%。可构建生物进化树,进行同源结构建模发现,71-362aa具有一个保守的S-腺甙基蛋氨酸区域,458-584aa具有组蛋白乙酰基转移酶区域。结论成功克隆了蓝氏贾第鞭毛虫Elp3基因,生物信息学分析发现,其在进化上与其它物种不属同一起源,具有SAM和HAT的结构和功能,这些发现为进一步研究其生物学功能提供了依据和线索。     

小鼠TLR4基因的克隆和序列分析

目的:克隆小鼠TLR4基因的全长编码区cDNA并进行序列分析. 方法:利用RT-PCR方法,从Balb/c小鼠脾组织细胞mRNA中扩增TLR4基因全长cDNA,并将其连接到pcDNA3.1( )载体上,进行测序和核酸分析.结果:扩增得到的小鼠TLR4基因cDNA全长2 508 bp,编码536个氨基酸, Blast结果分析表明,该cDNA与基因库中发表的序列(NM021297)具有100%的同源性.结论:获得小鼠TLR4基因的克隆,为进一步研究转基因免疫干预奠定了基础.     

西藏小型猪MSTN基因分子克隆及序列分析

目的扩增西藏小型猪的肌肉生长抑制素(MSTN)基因编码区全长序列,并对序列进行生物信息学分析。方法提取西藏小型猪肝脏组织的RNA,反转录成为c DNA,利用RT-PCR方法扩增MSTN基因编码区全长序列,将纯化的片段与pMD19-T载体连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆并测定其序列,利用生物信息学方法分析其序列特征,并与其他12种物种构建系统进化树。结果西藏小型猪MSTN基因编码区全长1128bp,编码375个氨基酸,氨基酸序列同源性分析表明,与版纳微型猪MSTN氨基酸序列相似性最高,为99%。结论 MSTN基因西藏小型猪除了与鸡和斑马鱼亲缘关系较远外,与人、犬、版纳微型猪、绵羊、山羊、牛、马、黑猩猩、大鼠、小鼠的关系都较为接近,其中与版纳微型猪的亲缘关系最为接近。     

一个新的基因转录本的克隆及序列分析

目的：筛选与精子发生和(或)睾丸发育相关的基因。方法：将不同发育阶段(胚胎和成人)的睾丸组织cDNA探针与人睾丸cDNA芯片进行杂交，通过杂交信号的比较，筛选出差异表达的基因。结果与结论：经测序发现该基因全长1316bp，包含1个1056bp的开放阅读框，编码351个氨基酸。生物信息学序列分析表明，它是p44S10基因家族的一条新的转录本基因，该基因的氨基酸序列编码一26S蛋白酶体调控亚基，在进化中高度保守，提示了该基因在生物体中的重要作用。     

茅苍术HMGR基因保守区片段的克隆与分析

目的对茅苍术3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMGR)进行基因克隆及序列分析。方法采用cDNA末端快速扩增技术,以茅苍术嫩叶总RNA的cDNA为模板扩增茅苍术HMGR基因的保守区片断。结果序列分析表明,所克隆的cDNA保守区序列长度为458bp,而且同时得到了两个核苷酸序列的同源性为84.28%的片段,相应的氨基酸序列的同源性为92.11%。分别命名为HMGRcr1,HMGR-cr2。推断这可能是该基因家族中的两个成员。而且同源序列比对发现,推断的HMGRcr1氨基酸序列和HMGRcr2氨基酸序列与其他植物都有较高的同源性。结论首次分离并报道了茅苍术HMGRcDNA克隆,为进一步研究萜类生物合成机制及其在提高植物药用价值方面提供理论依据。