Role of NOX family in PC-3cell damage induced by X-ray irradiation

目的:研究NOX家族在X射线诱导人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞损伤中的作用,寻找放疗增敏的潜在靶点.方法:采用噻唑蓝(MTT)比色法检测0、1、2、4和12GyX射线照射后24、48和96 h PC-3细胞存活率;采用DCFH-DA法检测0、1和4GyX射线照射后15、30、60和120 min时PC-3细胞中ROS的生成量;采用Westem blot方法检测0、1和4GyX射线照射后PC-3细胞中NOX1～NOX5 5个亚型蛋白的表达情况.结果:1、2、4和12 GyX射线照射PC-3细胞后96 h,与未照射组比较,PC-3细胞的存活率明显下降(P＜0.05).1和4GyX射线照射PC-3细胞60 min后,细胞内ROS水平最高,NOX抑制剂DPI及抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理可以减少ROS的生成.1和4GyX射线照射后PC-3细胞中NOX1、NOX2和NOX5蛋白表达显著增加.结论:X射线诱导NOX1、NOX2和NOX5蛋白过表达,细胞内产生过量的ROS是X射线诱导PC-3细胞损伤的机制之一.     

Apogossypolone诱导前列腺癌PC-3细胞在体外的自噬

目的研究ApoG2对前列腺癌PC-3细胞在体外的作用,了解其杀伤肿瘤细胞的机制。方法采用MTT法、吖啶橙染色、透射电镜、流式细胞技术、Western blot、免疫组织化学等方法观察了ApoG2对PC-3细胞的自噬与凋亡的诱导作用。结果ApoG2可明显抑制PC-3细胞增殖;ApoG2作用于PC-3细胞72小时可诱导细胞自噬;加入自噬抑制剂3-MA可增强ApoG2诱导凋亡作用;ApoG2可以增强细胞内LC-3Ⅱ及Beclin-Ⅰ的表达,降低Bcl-2的表达水平。结论ApoG2主要以诱导PC-3细胞发生自噬为主,抑制自噬可以促进凋亡的发生。     

新生霉素诱导前列腺癌PC-3细胞自噬的研究

目的:通过体外细胞实验,观察新生霉素是否抑制了前列腺癌PC-3细胞的增殖,并在分子水平和形态学上证实新生霉素通过细胞自噬抑制了前列腺癌PC-3细胞的增殖.为新生霉素应用于去势抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer,CRPC)的临床治疗提供理论和实验依据.方法:设置对照组和不同浓度的新生霉素实验组,作用前列腺癌PC-3细胞24小时后,利用MTT法测定对照组和不同浓度实验组的增殖率,并计算出新生霉素的半抑制率.透射电镜观察对照组及实验组细胞内的自噬体.利用免疫荧光技术,在荧光显微镜下观察对照组和不同浓度实验组发生细胞自噬时的自噬标志性蛋白LC-3Ⅱ和自噬底物蛋白p62的不同.利用RT-PCR在mRNA水平上检测对照组和不同浓度实验组的自噬相关基因LC-3Ⅱ、Beclin-1的表达.结果:MTT结果示新生霉素能使PC-3细胞的增殖明显受到抑制(F=569.26,P=0.000),其抑制率随着药物浓度的增加而增加,根据公式计算出其IC50=1.52mmol/L.透射电镜观察可见实验组PC-3细胞质内自噬体和自噬溶酶体数量较对照组多,且随着浓度的增加自噬体数量增加.自噬体在细胞中的分布通过绿色荧光FITC标记的自噬特异性蛋白LC-3Ⅱ在荧光显微镜下清晰显示,在细胞膜附近有绿色荧光呈散点状分布,随着实验组新生霉素浓度的增加荧光强度增加.而绿色荧光FITC标记的自噬底物蛋白p62在荧光显微镜下的强度随着药物浓度的增加而降低.RT-PCR在mRNA水平上检测到随着药物浓度的增加自噬相关基因LC-3Ⅱ、Beclin-1的表达量升高.结论:在体外细胞实验中,新生霉素能够在一定浓度范围内呈浓度依赖性的抑制PC-3细胞增殖.新生霉素能在mRNA水平上增强Beclin-1、LC-3Ⅱ的表达.新生霉素可能是通过诱导细胞自噬性死亡来抑制前列癌PC-3细胞的增殖.     

TRAIL抑制人前列腺癌细胞PC-3M体外生长的实验研究

 目的　观察TRAIL对前列腺癌细胞PC 3M的生长抑制作用。方法　采用MTT法检测不同浓度TRAIL对人非激素依赖性前列腺癌细胞株PC 3M的生长抑制率 ,原位末端酶标记技术检测细胞凋亡。免疫组化法观察bcl 2的表达。结果　TRAIL可有效地抑制PC 3M细胞生长 ,具有时间、浓度依赖性特点。经药物作用后 ,前列腺癌细胞凋亡明显增多 ,凋亡率随作用时间的延长而增高 ,PC 3M细胞中的bcl 2基因表达无显著变化。结论　TRAIL蛋白可显著抑制前列腺癌细胞PC 3M生长 ,其诱导细胞凋亡不依赖bcl 2基因表达     

快中子及X射线诱导人直肠癌细胞凋亡及相关基因表达的研究

目的:研究及探讨快中子及X射线诱导人直肠癌细胞凋亡及其相关基因表达。方法：不同剂量X射线（0、2、4、6、8、10Gy）及具有同等放射生物学效应的相当于射线1／3剂量的不同剂量快中子（０、０.67、1.34、2.01、2.68、３.34Gy)照射细胞,于３７℃孵育６小时,２４小时,４８小时,７２小时后,进行Ｈoechest33342荧光染色,观察细胞凋亡形态并凋亡指数ＡＩ（凋亡细胞的百分数）;用电子显微镜观察凋亡细胞特有的形态学特征;此外,我们分别对不同剂量（0、2、4、6、8、10Gy)X射线及快中子（0、0.67、1.34、2.01、2.68、3.34Gy)照射后24小时的细胞用免疫组化方法进行基因表达p53及bcl-2)的检测。结果：不同剂量X射线和快中子照射的细胞凋亡指数,随着照射剂量和受照时间的延长而逐渐增加,在同一时间点,快中子诱导的细胞凋亡水平明显高于X射线;不同剂量快中子照射后的细胞,较阳性对照组,p53基因表达下调明显,bcl－2基因表达下调不明显;不同剂量快中子照射后的细胞,p53及bcl-2基因表达下调均不明显。结论：高能X射线和快中子诱导人直肠癌细胞的凋亡具有明确的时间－剂量相关性,随着受照后时间的延长和剂量的逐渐增大,凋亡指数渐趋升高,无明显变缓之势;快中子照射人直肠癌细胞,与X射线相比较,可引起较大的凋亡反应;此外,照射后p53及bcl-2基因表达下调,说明此两类基因都参与了细胞凋亡的基因调控。     

X射线对血管平滑肌细胞作用机制的实验研究

目的：研究X射线外照射对体外原代培养的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）生长、增殖的影响及作用机制。方法：体外培养VSMC,给予单次8MVX射线照射,源皮距为100cm,剂量率400cGy/min。按照射剂量分为2、5、10、20Gy组,以0Gy为对照组,分别采用细胞计数法,克隆形成实验、四唑盐（MIT）比色实验、伊红排斥实验,流式细胞术及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）技术,动态观察对VSMC生长、增殖、死亡率、凋亡的影响。结果：①照射后24hVSM数降低,72h后明显恢复（P＜0．05）。②照射后48h内VSMC吸光度（A570）值降低,72h2、5Gy组A570值升高,而10、15、20Gy组各高不明显（P＜0．05）。③72h内10、15、20Gy组VSMC死亡率较高,6d后,各剂量组死亡率下降至较低水平（P＜0．05）。④克隆形成实验提示X坶照射可直接导致NA链断裂,引起细胞死亡。⑤碘化丙啶（PI）染色流式细胞仪直方图上可见亚二倍体峰,TUNEL法阳性细胞核呈棕黄色,荧光镜下可见凋亡小体。结论：X射线外照射可抑制VSMC的生长和增殖,可能通过两种不同的机制即致死性和（或）亚致死性损伤及诱导凋亡导致SMC死亡。为应用放射治疗防治血管成形术后再狭窄提供了理论依据。     

X射线诱导人星形细胞瘤细胞系的凋亡

目的：为了观察辐射诱导胶质瘤细胞凋亡的特征，进一步探讨辐射诱导肿瘤细胞凋亡与辐射剂量、剂量率和照射方式之间的关系。方法：将ＳＷＯ细胞分为对照组、不同剂量组、不同剂量率组、单次照射组和分次照射组，以医用直线加速器Ｘ射线照射。采用光镜、电镜及ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳法观察Ｘ射线诱导星形细胞瘤细胞系凋亡的特征。结果：（１）低剂量、低剂理率和分次照射组（１０Ｇｙ）诱导出典型细胞凋亡的特殊（如凋亡小体，ＤＮＡ梯     

双氢青蒿素诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡

目的研究双氢青蒿素（DHA）诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡作用,并观察其形态学变化。方法采用人前列腺癌PC-3细胞建立裸鼠种植瘤模型,20只模型鼠随机分为对照组、溶剂组、DHA大剂量组及小剂量组,经13天干预后,计算抑瘤率;HE染色观察肿瘤组织形态学表现;TUNEL法及Hoechst 33258荧光染色检测凋亡。结果DHA大小剂量组抑瘤率分别为69.221%和63.186%;肿瘤组织内凋亡细胞明显增多;肿瘤细胞凋亡率及凋亡细胞数密度均明显升高（P＜0.05）。结论DHA具有较强的抗肿瘤作用,其作用机制可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。     

新型棉酚衍生物ApoG2对人前列腺癌PC-3移植瘤生长的抑制

目的:探讨棉酚衍生物ApoG2对前列腺癌的抑制作用,并了解其作用机理.方法:建立人前列腺癌细胞的裸鼠皮下移植瘤模型,在ApoG2作用下观察其对皮下移植瘤生长的抑制作用,通过免疫组化方法检测肿瘤组织中bcl-2、PCNA及caspase-3、-8的表达.结果: ApoG2可明显抑制前列腺癌皮下移植瘤生长速度,肿瘤体积明显减小,ApoG2能增加肿瘤组织中caspase-3、8的表达,减少PCNA表达.结论: ApoG2对人前列腺癌有显著的生长抑制作用.     

APP在TGFβ诱导的前列腺癌PC-3细胞转移过程中的作用机制

目的 探究APP(淀粉样前体蛋白)的表达在TGFβ诱导的前列腺癌PC-3细胞的迁移和侵袭中的作用.方法 常规培养前列腺癌PC-3细胞后,使用浓度为20 ng/ml的TGFβ处理细胞48 h.通过Transwell迁移小室观察TGFβ对前列腺癌PC-3细胞迁移和侵袭能力的影响.通过蛋白印迹和qPCR方法检测TGFβ处理后...     

浅蓝菌素对前列腺癌细胞株PC-3生长抑制的研究

目的：探讨脂肪酸合成酶（FAS）的抑制剂浅蓝菌素对前列腺癌细胞株PC-3的生长抑制作用。方法：采用人前列腺癌细胞株PC-3在体外实验中用MTT法观察浅蓝菌素对细胞株的生长抑制作用;流式细胞术（FCM）对细胞株的凋亡及细胞周期的变化进行检测;蛋白免疫印迹（W estern b lotting）法检测浅蓝菌素对PC-3细胞中FAS蛋白水平表达的影响。结果：PC-3细胞在浅蓝菌素的作用下,细胞增殖被明显阻遏,并呈现剂量效应关系,在浓度为2.5mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L的浅蓝菌素作用下,PC-3细胞24h的抑制率分别为（34.78±2.47）%、（46.76±3.18）%、（58.13±3.55）%、（65.31±2.81）%,与对照组比较有统计学意义（P〈0.05）。流式细胞仪显示,细胞经浅蓝菌素作用后,细胞凋亡增多,PC-3细胞在浅蓝菌素浓度5.0mg/L三个时间组（24h,48h,72h）的细胞凋亡率分别为（28.29±1.88）%、（44.73±2.69）%、（61.25±1.43）%;且G0/G1期细胞比例增加,S期和G2/M期细胞比例减少。蛋白免疫印迹实验中,随着浅蓝菌素作用时间的延长,PC-3细胞中的FAS蛋白水平表达量明显减少,药物作用时间与细胞中蛋白水平表达量呈负相关。结论：浅蓝菌素能抑制PC-3细胞生长,且其呈现时间和浓度依赖性。     

青蒿琥酯诱导人前列腺癌细胞凋亡的实验研究

目的:探讨青蒿琥酯(artesunate,Art)对人前列腺癌PC-3细胞株抑制作用及机制。方法:进行前列腺癌PC-3细胞培养,不同浓度Art干预,采用MTT法检测用药后细胞增殖率的改变,流式细胞术(FCM)检测细胞周期的改变和凋亡比。结果:与对照组比较,Art可显著抑制PC-3细胞增殖(P<0.01);PC-3细胞主要被阻滞在G0/G1期,FCM检测PC-3细胞凋亡比,各实验组均明显高于对照组(P<0.01),且呈时间、剂量依赖性。结论:Art可抑制PC-3细胞增殖,其作用机制可能与调控细胞周期、诱导细胞凋亡有关。     

左旋棉酚对裸鼠人前列腺癌PC-3细胞皮下移植瘤的生长抑制作用

目的:探讨左旋棉酚对裸鼠人前列腺癌PC-3细胞皮下移植瘤的生长抑制作用及其机制.方法:建立裸鼠人前列腺癌PC-3细胞皮下移植瘤模型,将移植瘤裸鼠80只随机分成4组,每组20只,分别为10.0mg/kg、5.0mg/kg、2.5ng/kg左旋棉酚治疗组和对照组,进行疗效分析与组织病理形态学观察,同时检测肿瘤组织内PCNA、bcl-2、caspase-3和caspase-8的表达.结果:左旋棉酚可使人前列腺癌PC-3细胞荷瘤裸鼠存活率提高,肿瘤体积缩小,肿瘤组织坏死明显,PCNA与bcl-2表达减少,caspase-3和caspase-8表达增加,但高剂量左旋棉酚对PC-3荷瘤裸鼠肝脏和肠道有一定毒性.结论:当治疗剂量大于5.0mg/kg时,左旋棉酚可通过增殖抑制和诱导凋亡,明显抑制裸鼠人前列腺癌PC-3细胞皮下移植瘤的生长.     

Inhibition of human tumour prostate PC-3 cell growth by cannabinoids R(+)-Methanandamide and JWH-015: Involvement of CB2

Background:

We have previously shown that cannabinoids induce growth inhibition and apoptosis in prostate cancer PC-3 cells, which express high levels of cannabinoid receptor types 1 and 2 (CB₁ and CB₂). In this study, we investigated the role of CB₂ receptor in the anti-proliferative action of cannabinoids and the signal transduction triggered by receptor ligation.

Methods:

The human prostate cancer cell lines, namely PC-3, DU-145 and LNCaP, were used for this study. Cell proliferation was measured using MTT proliferation assay, [³H]-thymidine incorporation assay and cell-cycle study by flow cytometry. Ceramide quantification was performed using the DAG kinase method. The CB₂ receptor was silenced with specific small interfering RNA, and was blocked pharmacologically with SR 144528. In vivo studies were conducted by the induction of prostate xenograft tumours in nude mice.

Results:

We found that the anandamide analogue, R(+)-Methanandamide (MET), as well as JWH-015, a synthetic CB₂ agonist, exerted anti-proliferative effects in PC-3 cells. R(+)-Methanandamide- and JWH-015-induced cell death was rescued by treatment with the CB₂ receptor antagonist, SR 144528. Downregulation of CB₂ expression reversed the effects of JWH-015, confirming the involvement of CB₂ in the pro-apoptotic effect of cannabinoids. Further analysing the mechanism of JWH-015-induced cell growth inhibition, we found that JWH-015 triggered a de novo synthesis of ceramide, which was involved in cannabinoid-induced cell death, insofar as blocking ceramide synthesis with Fumonisin B1 reduced cell death. Signalling pathways activated by JWH-015 included JNK (c-Jun N-terminal kinase) activation and Akt inhibition. In vivo treatment with JWH-015 caused a significant reduction in tumour growth in mice.

Conclusions:

This study defines the involvement of CB₂-mediated signalling in the in vivo and in vitro growth inhibition of prostate cancer cells and suggests that CB₂ agonists have potential therapeutic interest and deserve to be explored in the management of prostate cancer.     

PSCA表达及其单抗对PC-3M细胞生长与凋亡影响的观察

目的：观察前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen,PscA）在人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞的表达状况以及PSCA特异性单克隆抗体（PSCA—mAb）对PC-3M细胞生长和凋亡的影响。方法：采用细胞免疫化学方法检测PSCA在PC-3M的表达;以O～1．0／tg／mL浓度的PSCA—mAb作用PC-3M细胞0～96h,采用细胞生长曲线、四甲基噻唑氮蓝（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）法、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞术（flow cytometry,FCM）分析P＆3M细胞生长及凋亡的变化。结果：PSCA在PC-3M细胞膜和细胞质呈阳性表达;0．1／μg／mLPSCA—mAb作用时的细胞生长抑制率为（11．3±2．2）％,0．2／μg／mL为（27．5±3．4）％,0．4／μg／mL为（39．4±5．8）％,0．6μg／mL为（47．7±7．4）％,0．8μg／mL为（69．3±8．2）％,l.0〉g／mL为（70．8±9．3）％,细胞凋亡率为0．1／μg／mL为（8．7±1．4）％,0．2μg／mL为（12．3±2．8）％,0．4μg／mL为（21．6±3．2）％,0．6〉g／mL为（33．6±4．9）％,0．8g／mL为（41．4土5．8）％,1．0μg／mL为（42．3土6．1）％,均显著高于相应对照组细胞生长抑制率和凋亡率,P均〈0．01;PSCA-mAb作用PC-3M细胞24h的生长抑制率为（47．8士6．4）％,48h为（59．4±7．3）％,72h为（70．3±7．9）％,96h为（71．1±9．0）％,细胞凋亡率24h为（33．6±4．3）％,48h为（36．3±5．1）％,72h为（42．7±5．7）％,96h为（43．4±6．3）％,均高于相应的对照组细胞生长抑制率和凋亡率,P均〈O．01。MTT及FCM分析结果表明,PSCA-mAb在0．6μg／mL作用72h时,细胞生长抑审l率为（71．5±6．2）％,凋亡率为（44．4±5．5）％,均达到最大。结论：PSCA在人雄激素非依赖性前列腺癌PC-3M细胞呈阳性表达;PSCA-mAb能够时间一剂量依赖性地抑制PC一3M生长和诱导其凋亡。     

Incadronate inhibits aminopeptidase N expression in prostatic PC-3 cells

Bone metastasis is an important cause of morbidity in advanced prostate cancer. Bisphosphonates are widely used for the treatment and prevention of osteoporosis, but recently have been observed to be effective in controlling prostate cancer metastasis. Since aminopeptidase N (AP-N) is known to be involved in the metastasis of prostate cancer, we investigated the effect of bisphosphonate on AP-N expression. Incadronate induced inhibition of AP-N mRNA and protein expression in PC-3 cells. The inhibitory effect of AP-N mRNA expression was also observed in the cells treated with pravastatin and other nitrogen-containing bisphosphonates, which inhibit the key enzyme in the isoprenoid biosynthesis pathway. The decrease of AP-N mRNA expression induced by incadronate was inhibited by co-incubation with geranylgeranyl diphosphate (GGPP). Moreover, GGTI-286 treatment also resulted in reduced AP-N mRNA expression. The translocation of small G protein Rap1 from the cytosol to the membrane was inhibited by incadronate and pravastatin, respectively. These above results indicate that the decrease in AP-N expression elicited by bisphosphonate is related to the inhibition of the mevalonate pathway.     

NADPH oxidase 5 (NOX5)—induced reactive oxygen signaling modulates normoxic HIF‐1α and p27Kip1 expression in malignant melanoma and other human tumors

NADPH oxidase 5 (NOX5) generated reactive oxygen species (ROS) have been implicated in signaling cascades that regulate cancer cell proliferation. To evaluate and validate NOX5 expression in human tumors, we screened a broad range of tissue microarrays (TMAs), and report substantial overexpression of NOX5 in malignant melanoma and cancers of the prostate, breast, and ovary. In human UACC‐257 melanoma cells that possesses high levels of functional endogenous NOX5, overexpression of NOX5 resulted in enhanced cell growth, increased numbers of BrdU positive cells, and increased γ‐H2AX levels. Additionally, NOX5‐overexpressing (stable and inducible) UACC‐257 cells demonstrated increased normoxic HIF‐1α expression and decreased p27^Kip1 expression. Similarly, increased normoxic HIF‐1α expression and decreased p27^Kip1 expression were observed in stable NOX5‐overexpressing clones of KARPAS 299 human lymphoma cells and in the human prostate cancer cell line, PC‐3. Conversely, knockdown of endogenous NOX5 in UACC‐257 cells resulted in decreased cell growth, decreased HIF‐1α expression, and increased p27^Kip1 expression. Likewise, in an additional human melanoma cell line, WM852, and in PC‐3 cells, transient knockdown of endogenous NOX5 resulted in increased p27^Kip1 and decreased HIF‐1α expression. Knockdown of endogenous NOX5 in UACC‐257 cells resulted in decreased Akt and GSK3β phosphorylation, signaling pathways known to modulate p27^Kip1 levels. In summary, our findings suggest that NOX5 expression in human UACC‐257 melanoma cells could contribute to cell proliferation due, in part, to the generation of high local concentrations of extracellular ROS that modulate multiple pathways that regulate HIF‐1α and networks that signal through Akt/GSK3β/p27^Kip1.