Quantitative PCR detection of endoplasmic reticulum stress associated genes

从人外周血白细胞中扩增目的 基因片段,构建标准品质粒,应用SYBR GreenⅠ荧光染料进行实时定量PCR,检测内质网应激相关基因的拷贝数.所建立的实时定量PCR方法在起始模板量106～1013拷贝/μl范围内,荧光信号达到阈值的循环数Ct值与模板浓度线性关系良好(R2=0.991 9),是检测内质网应激相关基因有效的手段.     

一步法实时荧光定量PCR检测白血病WT1基因mRNA

目的 构建RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因mRNA表达的方法,准确定量检测白血病患者微小残留病,指导临床判断预后和早期预测复发.方法 从K562细胞提取的RNA用特异性引物扩增WT1基因,pMD18-T载体克隆法构建荧光定量PCR标准模板,建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测wTl基因方法,并对该方法的灵敏度、重复性和稳定性进行检测.结果 构建的RT-PCR一步法实时荧光定量PCR方法的灵敏度达10-4水平:以拷贝数为1.0x106～1.0×102 cps/ml的标准品,分别进行RT-PCR一步法实时荧光定量PCR扩增后,标准品的Ct值与该标准品模板起始浓度的对数存在线性关系,r值达0.998:管间和批间的变异系数均小于8%.结论 所建立RT-PCR一步法实时荧光定量PCR检测WT1基因方法的灵敏度、重复性和特异性好;RT和PCR反应过程一步完成,更简便快捷,减少加样和污染机会,更适合临床检测.     

人类mdr1基因新型Taq Man-MGB探针实时定量PCR检测方法的建立

目的建立一种比现有方法敏感、特异性高、重复性好的实时荧光定量PCR检测的新方法检测人类mdr1基因。方法以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1/A为阳性模板,用Primerexpress2.0引物设计软件设计引物和TaqMan-MGB探针,建立荧光定量PCR检测方法。结果当待扩增DNA浓度在3.601×103cps/ml～3.601×109cps/ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,相关系数r2大于0.98。结论应用TaqMan-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确度高等优点,可作为进一步研究人类mdr1基因的方法。     

实时荧光定量PCR在检测人ANP基因表达的应用

目的 建立心房钠尿肽(ANP)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法进行初步评价.方法 以基因表达产物为模板,建立实时荧光定量PCR检测方法,对样本中的心房钠尿肽含量进行相对定量,比较不同样本组的基因表达水平.结果 所建立的实时荧光定量PCR方法熔解曲线中熔解峰单一.肺癌患者胸腔样本的ANP含量为对照样本的4.68倍,血清样本为对照样本的16.03倍.结论 所建立的ANP实时荧光定量PCR检测方法具有较高的特异性.肺癌患者胸腔液和血清中ANP的含量明显增高.     

新型Taq Man-MGB探针实时荧光定量PCR检测人类mdr1基因

目的建立一种比现有方法敏感、准确性高、重复性好的人类mdr1基因的新型实时荧光定量PCR检测新方法。方法用Primer Express 2．0引物设计软件设计引物和MGB探针,以Taq Man-MGB探针技术为基础,运用Taq Man-MGB探针,以含有目的基因mdr1cDNA的质粒pHaMDR1／A为阳性模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果所建立方法的最低检测限度为15个基因拷贝／反应,在待扩增DNA浓度为3．061×103 cps／ml-3．061×109cps／ml范围时,模板浓度与循环阈值(Ct)之间的相关性良好,决定系数r2为0．988243。结论应用Taq Man-MGB探针的实时荧光定量PCR方法检测人类mdr1基因,具有灵敏度高、特异性高和精确性高等优点。     

实时荧光定量PCR检测沙眼衣原体的研究

目的 采用TaqMan探针建立检测沙眼衣原体的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法.方法 根据沙眼衣原体外膜蛋白A的基因(ompA)序列设计引物和探针,以克隆的ompA部分基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量检测方法.结果 建立的荧光定量PCR检测方法的最低检出限为5 copies/反应,检测线性范围100107线性关系良好(r2=0.997),比巢式PCR敏感100倍;且与鹦鹉热衣原体、淋球菌、解脲脲原体、大肠杆菌等病原菌DNA以及人基因组DNA均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性.以巢式PCR作参比,建立的荧光定量PCR法检测沙眼衣原体的阳性符合率为100.00％,阴性符合率为95.09％,总符合率为96.81％.结论 建立的检测沙眼衣原体实时荧光定量PCR具有特异性强和敏感性高的特点,可快速检测样本中微量沙眼衣原体DNA,适用于对沙眼衣原体进行大规模筛选.     

基因微阵列分型与实时荧光定量PCR检测人乳头瘤病毒

目的评价基因微阵列分型方法与实时荧光定量PCR技术检测人乳头瘤病毒及其对宫颈癌患者诊断的意义。方法基因微阵列检测人乳头瘤病毒21种亚型;实时荧光定量PCR技术定量检测人乳头瘤病毒6/11型和16/18型。结果基因微阵列检测人乳头瘤病毒较实时荧光定量PCR技术阳性检出率更高(P<0.05),而在特异性上无显著差异(P>0.05)。两种方法联合检测可以提高检测特异性和敏感度。结论基因微阵列分型方法可用于宫颈癌筛查,而实时荧光定量PCR技术对宫颈癌患者疗效判断和预后更有意义。     

分子信标实时PCR检测瘢痕相关p53基因SNP方法的建立

目的建立分子信标实时PCR检测病理性瘢痕相关p53基因第72密码子单核苷酸多态性的新方法。方法采集瘢痕疙瘩患者外周血28例,提取DNA并用分子信标PCR检测p53基因多态性。设计一对p53基因第72密码子单核苷酸多态性荧光分子信标探针,荧光定量PCR检测该位点单核苷酸(SNP),并与反向斑点杂交法,DNA直接测序等方法比较。结果定量荧光PCR荧光分子信标检测的结果与测序结果吻合率达到100%,高于反向斑点杂交法且简便快捷。结论分子信标实时PCR检测技术适合临床p53基因第72密码子单核苷酸多态性快速诊断。     

Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应标准品的制备及应用研究

目的:制备用于Satb2基因实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)的标准品。方法:提取胚胎上颌突组织总RNA,行逆转录反应获得第一链的cDNA,再通过PCR回收获得预期Satb2基因片段;通过T-A克隆将该片段插入pGMT质粒载体;大量提取质粒,定量后进行标准曲线的制作和实时荧光定量PCR。结果:重组质粒经PCR扩增及序列测定表明,pGMT/Satb2基因已成功克隆。结论:所构建的pGMT/Satb2基因实时荧光定量PCR检测标准品应用Taqman荧光探针技术建立的标准曲线线性关系好,灵敏度和特异性高,准确可靠,此法可作为实时荧光定量PCR检测Satb2基因的标准方法。     

实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞CD_(58)基因的表达

目的:应用实时荧光定量PCR检测乙型肝炎患者外周血单个核细胞(PBMC)CD58基因的表达。方法:提取PBMC总RNA并逆转录为cDNA,实时荧光定量PCR法分别检测43例HBV感染者及11例正常对照的PBMCCD58基因的表达水平,同时检测血清ALT、AST水平。结果:乙型肝炎各组患者PBMCCD58mRNA表达水平较正常对照组明显增高,差异均有显著性。乙型肝炎患者PBMCCD58mRNA水平与血清ALT、AST呈显著正相关。结论:实时荧光定量PCR可以准确定量检测基因的表达;乙型肝炎患者PBMCCD58基因表达水平与疾病严重程度及肝细胞损伤严重程度有关。     

滋补脾阴方药含药血清对内质网应激神经元损伤的保护作用及机制研究

目的:运用中药血清药理学方法研究滋补脾阴方药含药血清对内质网应激的保护作用并探讨其机制。方法:以N-糖链抑制剂衣霉素(tunicamycin,Tm)刺激小鼠神经瘤母细胞Neuro2a建立内质网应激模型,滋补脾阴方药含药血清为干预组,采用逆转录聚合酶链式反应方法观察葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)和凋亡促进因子CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/EBP homologousprotein,CHOP)的mRNA表达;乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放试验观察Tm、星形孢菌素(staurosporine,STS)刺激Neuro2a细胞后的LDH泄漏率。结果:各浓度滋补脾阴方药含药血清预处理组GRP78及CHOP mRNA表达与Tm(5μg/ml)组相比,表达水平明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),因此滋补脾阴方药含药血清可以抑制Tm诱导内质网应激时GRP78及CHOP mRNA的表达。各浓度滋补脾阴方药含药血清预处理组与Tm组相比,LDH泄漏率明显下降(P<0.05),因此滋补脾阴方药含药血清可以降低Tm和STS刺激后的LDH泄漏率。结论:滋补脾阴方药具有神经保护作用,其机制可能是通过抑制内质网应激及线粒体损伤。     

雌二醇通过ERβ调控ERK磷酸化影响细胞增殖和凋亡

目的 探究雌二醇（E2）结合其重组人雌激素受体β（ESR2）对C28I2细胞增殖和凋亡的效应。方法 PCR扩增ESR2序列并构建腺病毒重组质粒pAd-ESR2,在HEK293细胞中包装重组腺病毒Ad-ESR2。用Ad-ESR2和ESR2-siRNA处理人正常软骨细胞C28I2,分别设置对照组（C28I2+DMSO）、E2组（C28I2+E2）、Ad-ESR2组（C28I2+DMSO+ Ad-ESR2）、E2+Ad-GFP组（C28I2+ E2+Ad-GFP）、E2+Ad-ESR2组（C28I2+E2+Ad-ESR2）、E2+sicontrol组（C28I2转染sicontrol+E2）、E2+ESR2-si1组（C28I2转染ESR2-si1+E2）、E2+ESR2-si3组（C28I2转染ESR2-si3+E2）。免疫印迹测定ER Stress和细胞凋亡相关蛋白表达,qRT-PCR检测增殖相关标志基因的表达,借助EdU试剂盒和流式细胞术测定细胞增殖和凋亡情况。使用ERK通路抑制剂U0126分别设定E2 组、E2+U0126组（C28I2+E2+U0126）、E2+Ad-ESR2组、E2+Ad-ESR2+U0126组（C28I2+E2+Ad-ESR2+U0126）。通过免疫印迹实验探究C28I2细胞中E2通过ERβ调控ERK信号通路影响ER stress和凋亡。结果 成功构建过表达腺病毒Ad-ESR2和靶向ESR2的siRNA;过表达Ad-ESR2能够促进E2处理后IRE1α[1.20±0.06 vs 0.95±0.05,P<0.05]、PERK[1.29±0.04 vs 1.03±0.02,P< 0.05]和XBP1s[1.17±0.03 vs 0.82±0.02,P<0.05]的表达,促进凋亡Cleaved Caspase12（P<0.05）、抑制增殖相关标志基因PCNA（P<0.05）、CyclinB1（P<0.05）、CyclinD1（P<0.05）的表达,且ERK磷酸化激活降低（P<0.05）;转染ESR2-siRNA后,细胞的内质网应激相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的表达降低,与细胞增殖相关的基因被上调,且细胞内pERK/ERK比值相对增加。经特异性ERK通路抑制剂U0126处理后,雌二醇结合ERβ促进的内质网应激蛋白及细胞凋亡蛋白的表达被拮抗。结论 雌二醇靶向ERβ通过激活ERK通路磷酸化调控内质网应激及凋亡,进而抑制软骨细胞增殖。     

姜黄素对人乳腺癌细胞增殖的抑制效应及机制

目的 研究姜黄素对人乳腺癌细胞株增殖的抑制效应及其机制。方法 采用Northern印迹和Western印迹法观察人乳腺癌细胞mRNA及其蛋白表达;用CAT报告基因来研究人雌激素反应元件(ERE)的转录活性;用Matrigd侵袭池(Matrigel invasion chamber)研究细胞侵袭性。结果 姜黄素能够抑制雌激素受体(ER)阳性MCF—7及ER阴性MDA—MB—231两种人乳腺癌细胞的增殖。对MCF—7细胞,姜黄素调节ER下调基因pS2和TGF—α的表达及ERE的活性;对MDA—MB—231乳腺癌细胞,姜黄素通过下调MMP—2和上调TIMP—1的活性表现出很强的抗侵袭活性,其还能够抑制MDA—MB—231细胞两个主要的血管生成因子VEGF和b—FGF、在转录水平的表达。结论 姜黄素通过多种机制抑制乳腺癌细胞的生长,姜黄素的化学预防是多途径作用的结果。     

子宫内膜癌中PTEN蛋白和雌激素受体ER的检测及临床意义

目的探讨子宫内膜癌组织中抑癌基因PTEN和雌激素受体（ER）的异常表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学SP法检测子宫内膜单纯性增生20例、子宫内膜复杂性非典型增生20例、子宫内膜癌35例中PTEN及ER的表达,表达率的差异采用卡方检验。结果PTEN在子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性非典型增生、子宫内膜癌中的表达缺失率逐渐上升,表达缺失率与组织学分级有关,差异有统计学意义（P〈0.05）。ER在子宫内膜单纯性增生、子宫内膜复杂性非典型增生、子宫内膜癌中的阳性表达率逐渐下降,差异有统计学意义（P〈0.05）,但阳性率与组织学分级无关,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论PTEN、ER均与子宫内膜癌的发生、发展有关。     

雌激素受体在人类多激素型垂体腺瘤中的表达

目的 研究人类多激素型垂体腺瘤中雌激素受体(ER)在分泌不同类型激素的垂体腺瘤细胞中的表达,探讨多激素型垂体腺瘤中分泌特定类型激素的垂体腺瘤细胞与ER阳性细胞的关系。方法 采用免疫组织化学双标法检测33例多激素型垂体腺瘤标本中垂体激素合并ER表达的情况,即分别检测每1例标本中PRL ER、GH ER、ACTH ER、PSH ER、FSH ER和LH ER的表达情况。结果 33例多激素型垂体腺瘤标本中有22例(66．67％)表达ER,其中：PRL ER双标染色阳性标本10例、IH ER双标染色阳性标本9例、FSH ER双标染色阳性标本7例、GH ER双标染色阳性标本2例,33例标本的ACTH ER和TSH ER的双标染色均为阴性。结论 多激素型垂体腺瘤中,分泌：PRL、IH或FSH的垂体腺瘤细胞可表达ER;分泌ACTH或TSH的垂体腺瘤细胞不表达ER;分泌GH的垂体腺瘤细胞是否表达ER可能与该垂体腺瘤是否同时分泌PRL有关。ER很可能在多激素型垂体腺瘤PRL、IH及FSH腺瘤细胞的发生、发展过程中发挥作用。     

雌、孕激素受体在子宫内膜息肉中的表达

目的研究子宫内膜息肉患者的息肉组织中雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)的表达,进一步阐明子宫内膜息肉的发生机制。方法子宫内膜息肉组患者40例,设为内膜息肉组;同期选择24例输卵管因素不孕者作为对照组。两组患者取材前半年未曾口服任何激素类药物。用免疫组化方法检测两组患者子宫内膜组织中ER、PR的表达,同时在月经第3～5天进行血抑制素B(INH-B)、促卵泡素(FSH)、雌激素(E)和孕激素(P)的检测。结果ER、PR在内膜息肉组和对照组中均有表达。PR在内膜息肉组中腺上皮细胞(3.050±0.714)和间质细胞(2.850±0.700)的表达显著低于对照组中腺上皮细胞(3.542±0.588)和间质细胞(3.417±0.654)的表达(U腺上皮细胞=-2.695,P<0.05;U间质细胞=-3.082,P<0.05)。血FSH、E、P水平在子宫内膜息肉组分别为(7.84±2.64)nmol/L、(181.78±105.48)nmol/L、(4.09±3.65)pmol/L,对照组分别为(7.25±1.73)nmol/L、(183.13±78.27)nmol/L、(2.84±0.91)pmol/L,差异均无统...     

乳腺癌雌激素和黄体酮受体的检测

用链霉亲和素—生物素—辣根过氧化酶配体免疫组化法,在84例乳癌石蜡切片上进行雌激素受体(ER)和黄体酮受体(PR)检测,ER、PR阳性分别为46和54例,与文献报道一致,其中ER(+)/PR(+)40例、ER(+)/PR(-)6例、ER(-)/PR(+)14例、ER(-)/PR(-)23例;ER和PR的表达与乳癌组织学类型和分化程度密切相关,与患者的年龄、月经状态无明显相关。     

内质网应激相关因子PERK和ATF6在结肠癌中的表达及意义

目的 探讨内质网应激相关因子蛋白激酶R样内质网调节激酶(PERK)和活化转录因子6(ATF6)在结直肠癌组织中的表达情况,分析PERK和ATF6在结肠癌发生发展中的作用.方法 选择手术切除结肠癌组织及距离病变组织5 cm以上正常组织,采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测PERK和ATF6的mRNA表达情况,免疫组织化学法(IHC)、Western blot法检测PERK和ATF6蛋白的表达情况,并结合临床病理特征,分析其与结肠癌发生、发展之间的关系.结果 肿瘤组织ATF6和PERK mRNA表达均较正常组织下调(P＜0.05).IHC和Western blot结果显示PERK和ATF6在结肠癌中的表达均显著低于正常组织(P＜0.05).PERK和ATF6主要定位于上皮细胞中.结论 PERK和ATF6在结肠癌中的表达水平下降说明缺乏适当的内质网应激反应可能在肿瘤的发生机制中起作用.     

雌孕激素受体的表达对分娩发动的影响

目的:检测雌、孕激素受体在自然临产经阴道分娩以及选择性剖宫产产妇的胎盘组织中的表达,探讨雌、孕激素受体(ER,PR)的表达对分娩发动的影响及其机制。方法:运用免疫组化法检测22例自然临产经阴道分娩的产妇胎盘和胎膜中ER、PR的表达情况,以18例选择性剖宫产为对照,并结合临床资料对实验数据进行统计学分析。结果:①实验组和对照组PR阳性率分别为73.79±13.09%、74.02±14.40%,两组对照,无统计学差异(P>0.05)。②自然临产组和选择性剖宫产组胎盘组织中的ER阳性表达率分别为86.11±14.90%和82.65±14.30%,两组相比无显著性差异(P>0.05)。结论:人类妊娠末至分娩发动前,ER、PR在妊娠组织中的表达水平均无显著下降。功能性孕激素撤退可能就是分娩发动的启动因素。     

乳腺肿瘤细针穿刺细胞学雌,孕激素受体的检测

目的：探讨乳腺肿瘤细针穿刺细胞学涂片进行激素、孕激素检测，作为内分泌治疗和预后的评估指标。立法：用免疫组化方法在细针穿刺新鲜涂片检测乳腺良恶性肿瘤中ＥＲ、ＰＲ的表达。结果：２２６例乳腺肿块标记成功率为８８．０５％（１９９／２２６），ＥＲ／ＰＲ阳性率为４１．２１％（８２／１９９）。其中ＥＲ、ＰＲ的阳性表达为：乳腺小叶增生３７．６９％（４９／１３０），纤维腺瘤４８．６５％（１８．３７），乳腺癌４８．６