Construction and identified of N, P, L and M2-1 of human respiratory syncytial virus RNA polymerase complex

目的 构建可表达人呼吸道合胞病毒(RSV)转录延长/终止抑制因子M2-1(简称M2-1)、核蛋白(N)、磷蛋白(P)和大蛋白(L)的真核表达载体并鉴定蛋白表达情况.方法 采用合成T7启动子Oligo DNA及PCR方法获得含有T7启动子的表达盒,通过体外连接方法克隆入载体px8δT,制备表达载体px8δT-PT.设计3对PCR引物,PCR扩增出RSV的M2-1、N和P基因,并克隆至px8δT-PT,构建px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N和px8δT-PT-P.同时利用已有的质粒pcDNA3.1-L构建px8δT-PT-L.用重组质粒转染 BSR T7/5细胞,72 h后再用Western blot法鉴定蛋白的表达.结果 成功实现px8δT的改造,构建的4种重组质粒px8δT-PT-M2-1、px8δT-PT-N、px8δT-PT-P和px8δT-PT-L,经限制性内切酶分析与预期一致,经Western blot法分析证实M2-1、N及P蛋白被表达.结论 获得以T7为启动子的表达载体px8δT-P,成功构建了含有M2-1、N及P编码基因的表达载体,为利用反向遗传学技术进一步改造RSV奠定了基础.     

呼吸道合胞病毒重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法及免疫原性研究

目的 建立呼吸道合胞病毒(RSV)重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,并研究其免疫原性.方法 PCR扩增G1和F/M2基因片段,经酶切后插入原核表达载体pET-DsbA中,构建重组质粒pET-DsbA-G1F/M2,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达,采用Ni+螯合亲和色谱法纯化尿素变性的包涵体溶液,梯度透析复性,Western-blot鉴定重组蛋白的RSV特异性,免疫BALA/c小鼠,用ELISA测定抗体滴度,MTT法测定细胞毒性T细胞活性(CTL).结果 构建的重组质粒在E.coli中表达了RSV特异性的重组蛋白,经变性、纯化并复性后获得了高纯度的DsbA-G1F/M2(＞90%);该蛋白诱导了高滴度的RSV特异性抗体和CTL活性.结论 建立了重组蛋白DsbA-G1F/M2的制备方法,该蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研究开发RSV重组亚单位疫苗奠定了基础.     

呼吸道合胞病毒M2-1基因在人肺腺癌PAa细胞的转染及表达

目的 拟将呼吸道合胞病毒M2－1基因转染人肺腺癌PAa细胞并获得表达。方法 应用基因重组和基因转染技术，将在呼吸道合胞病毒转录及复制过程中起调控作用的M2－1基因cDNA片段插入质粒pXJ41，转染人肺腺癌PAa细胞，并通过RT－PCR和免疫荧光及Western blot等技术鉴定M2－1基因表达。结果 ①阳性重组子pXJ41/M2-1经双酶切，产生620bp大小片段；②RT－PCR扩增M2－1基因可见620bp清晰的条带；③免疫荧光染色见转染M2－1基因的PAa细胞胞浆内可见特异性绿色荧光；④Western blot检测转染M2－1基因的PAa细胞，于22000处可见特异性条带。结论 呼吸道合胞病毒M2－1基因在人肺腺癌PAa细胞的成功转染和表达为今后进一步研究奠定基础。     

靶向呼吸道合胞病毒M2基因pshRNA载体质粒的构建及意义

目的：构建针对呼吸道合胞病毒（RSV）M2基因mRNA的短发卡结构状RNA（shRNA）重组载体质粒，为利用RNA干扰技术抗RSV感染的深入研究奠定基础；方法：按shRNA设计原则，选择RSV—M2基因作为靶基因，设计19bp长的能产生短发卡结构的两段DNA反向重复序列，中间以9bp序列间隔，经退火形成互补双链，克隆至转录载体pgenesil-1上，重组质粒经酶切和测序鉴定，然后将构建成功的重组质粒转染HEP2细胞，荧光显微镜下观察绿色荧光细胞发生率以评估转染效率。结果：将设计合成的DNA片段成功克隆至载体上，经酶切及序列鉴定为目的序列，并且荧光显微镜下观察细胞有较多的绿色荧光蛋白表达。结论：成功构建了针对RSVM2基因mRNA的shRNA重组载体质粒，可利用重组质粒进一步研究其对RSV感染的抑制，从而为抑制RSV感染寻找新的基因治疗手段。     

重组人干扰素α-2b体外抗呼吸道合胞病毒作用的实验研究

目的观察重组人干扰素α-2b在体外的抗呼吸道合胞病毒作用。方法观察不同浓度重组人干扰素α-2b抑制呼吸道合胞病毒对Hela细胞产生细胞病变（CPE）的作用,并与利巴韦林比较。结果实验表明重组人干扰素α-2b抗呼吸道合胞病毒的最低有效浓度为25IU／ml。结论重组人干扰素α-2b具有明显的抗呼吸道合胞病毒作用。     

人呼吸道合胞病毒转录调节基因转染PAa和A549肺腺癌细胞系

目的探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)对肺癌细胞的影响。方法构建其转录调控因子M2-1基因真核表达质粒pXJ-41/M2-1,用DNA测序、酶切、PCR等方法鉴定基因重组情况。结果DNA测序表明该基因具有高度保守性;经脂质体转染、以-βactin为参照进行RT-PCR,筛选出了高效稳定表达M2-1基因的人肺腺癌PAa和A549细胞株,并经Westernblot验证有M2-1蛋白的表达。结论为进一步探讨M2-1基因在肺癌发生发展中的作用打下基础。     

A亚型人呼吸道合胞病毒G基因的克隆、真核表达

目的克隆A亚型人呼吸道合胞病毒（HRSV）G基因,构建G基因的真核表达载体,并进行表达和鉴定。方法自行设计引物,利用RT-PCR技术,从感染HRSV的HEp-2细胞中获得G基因片段,克隆到pGEM-Teasy载体,经核酸序列分析,进一步亚克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋）,酶切鉴定后,脂质体法转染COS-7细胞,RT-PCR和Western blotting鉴定基因转录和蛋白表达。结果真核表达载体pcDNA3．1（＋）G的限制性内切酶分析结果与预期一致,基因序列分析显示没有发生无义突变。转染COS-7细胞后,RT-PCR检测到G基因有转录,Western blotting分析观察到G蛋白特异性的表达条带。结论成功克隆A亚型HRSVG基因,并在真核细胞中获得表达。     

呼吸道合胞病毒M2-1基因表达对人肺腺癌PAa细胞生物学特性的影响

目的观察呼吸道合胞病毒(RSV)M2-1基因的表达对人肺腺癌PAa细胞生物学特性的影响。方法①采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞生长曲线和不同浓度丝裂霉素(MMC)作用下细胞的存活率;②采用流式细胞仪(FCM)、DNA凝胶电泳、透射电镜技术观察细胞凋亡。结果PAa/M2-1、PAa细胞的倍增时间分别为2.79和3.24d,PAa/M2-1细胞较PAa细胞生长速度快。不同浓度MMC作用下,转染后PAa/M2-1细胞的存活率均明显低于PAa细胞;PAa细胞和PAa/M2-1细胞的凋亡发生率分别为0.58%和5.6%;DNA凝胶电泳PAa/M2-1细胞可见清晰的DNA梯状条带;透射电镜观察到PAa/M2-1有凋亡细胞。结论M2-1基因的表达可促进PAa细胞生长,对不同浓度丝裂霉素表现为敏感性增加,并有自发性凋亡发生,以上结果为进一步研究RSV与肺癌的关系提供了有力证据。     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因转染对人肺腺癌细胞生长特性的影响

目的:探讨人呼吸道合胞病毒(hRSV)M2-1基因转染对人肺腺癌细胞体外生长特性的影响.方法:应用脂质体转染法,将携带M2-1基因的重组载体pXJ-41/M2-1转入人肺腺癌PAa和A549细胞,并获稳定表达;以不含M2-1基因的空白载体为对照,采用流式细胞术、MTT法、胰酶消化试验、软琼脂集落形成实验和Boyden小室等方法观察转染细胞的生长特性、贴壁能力及侵袭能力变化.结果:与转染前和转染空白质粒组比较,转染M2-1基因的PAa和A549细胞的G2/M期细胞比例均显著增加(P<0.05,P<0.01);细胞增殖明显加快(P<0.01),倍增时间缩短;集落形成率显著增加(P<0.01);PAa细胞胰酶消化离壁时间缩短(P<0.01),而A549细胞在3组间无统计学差异;Boyden小室实验中,A549细胞透膜数显著增加(P<0.01),而PAa细胞因透膜数很少,均无法计数.结论:M2-1基因转染能提高体外培养的PAa和A549细胞的增殖能力和侵袭能力,感染hRSV病毒的肺癌患者应引起重视.     

重组人干扰素α-2b治疗呼吸道合胞病毒支气管炎临床观察

呼吸道合胞病毒 (RSV)是世界范围内婴幼儿下呼吸道感染最重要的致病原[1] 。由其所致支气管炎在婴幼儿中常见 ,发病率呈上升趋势。我院 2 0 0 0年 1月— 2 0 0 2年 12月 ,应用干扰素治疗呼吸道合胞病毒支气管炎 5 0例 ,收效良好 ,现报告如下。1　资料与方法1.1.　一般资料　共 10 0例呼吸道合胞病毒支气管炎住院患儿 ,随机分为 2组 ,观察组 5 0例 ,男 36例 ,女 14例。对照组5 0例 ,男 2 9例 ,女 2 1例。全部病例年龄 2个月～ 3岁 ,其中 2～ (个月 ) 37例 ,6个月～ (岁 ) 35例 ,1～ 3(岁 ) 2 8例。病程 7～ 14d ,呼吸道合胞病毒支气管炎诊…     

人呼吸道合胞病毒M2-1基因原核表达质粒的构建与表达

目的 构建人呼吸道合胞病毒（hRSV）MS－1基因原核表达质粒载体,使其于原核细胞中表达。方法 利用Hep-2细胞培养hRSV,提取感染细胞总RNA,通过RT－PCR扩增M2－1基因片段。目的片段与质粒pGEX-2Tx EcoRI、XhoI双酶切后,连接、转化,筛选出阳性克隆。阳性克隆菌经诱导剂诱导后,表达M2－1融合蛋白。结果 成功地构建了M2－1基因原核表达质粒载体,实现了其于原核中的表达。结论 建立了hRSV基因M2－1原核表达载体,为进一步研究hRSV奠定基础。     

流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基片段的克隆及表达

目的 将流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基进行亚克隆、表达，获得重组的亚克隆多肽，为进一步研究PBl亚基功能奠定基础。方法 以FB1亚基cDNA为模板，用PCR方法扩增出PB1-1片段，应用定向克隆策略将扩增后片段与高效表达载体pQE30重组，阳性克隆重组质粒经酶切及测序鉴定，IPTG诱导各亚克隆系高效表达；优化表达条件。结果 PCR法扩增出487bp的片段，酶切及测序鉴定获得正确的重组质粒，在E．coli M15中表达得到相对分子量约为20KD的重组蛋白，获得蚕组多肽。结论 成功地亚克降及表达了流感病毒RNA聚合酶PB1-1亚基。     

呼吸道合胞病毒NS1基因原核表达及其免疫原性分析

目的:原核表达呼吸道合胞病毒(RSV)非结构NS1蛋白,并对其免疫特性进行研究.方法 采用PCR技术获得NS1基因,将其插入pET41a(+)载体上,导人大肠杆菌后诱导表达;利用GST亲和层析柱对诱导表达的NS1蛋白进行纯化,免疫动物制备抗体,Western blot法鉴定抗体的特异性.结果 重组质粒经酶切鉴定和DNA序列测序完全正确,经IPTG诱导后融合蛋白在大肠杆菌BL21-DE3中得到高效表达,表达产物经超声破碎和GST亲和层析纯化获得重组蛋白,分子量约42 000 Mr,以抗NS1蛋白的多克隆抗体为一抗进行Western blot检测,结果只有RSV感染细胞的样品在15 000 Mr处有特异性带显示,其他病毒感染的细胞和阴性对照没有相应条带.结论 NS1基因得到高效表达,免疫制备得到的抗体与RSV感染细胞有特异性反应,与其他常见呼吸道病毒感染细胞无交叉免疫反应.