人Mcl-1基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的:对人Mcl-1基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法:从Gene Bank数据库中获取人Mcl-1基因5'调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果:Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在1700、1147、368和32个可能的转录因子结合位点,包含Arid3a,Atoh1,ETV6,Gata1,GATA3,KLF5,LMX1A,LMX1B,MZF1,Prrx2,SPI1,TBX4,USF1,YY1,ZEB1等。结论:人Mcl-1基因5'调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与肿瘤发生,红细胞生成及神经发育等有关。     

人三叶因子3基因启动子区的生物信息学分析

目的人三叶因子3(human trefoil factor 3,hTFT3)是一种具有胃肠黏膜修复和保护作用的小分子多肽,文中利用生物信息学在线软件预测hTFF3基因启动子功能。方法获取hTFF3基因启动子全长序列,利用多种在线相关软件预测出CpG岛及转录因子结合部位。结果 hTFF3基因序列全长为2295 bp,核苷酸数据库(GenBank)登录号为AB038162.1。hTFF3启动子存在于非编码区上游1500bp内,启动子序列中未发现CpG岛,启动子区共发现204个转录因子。结论生物信息学在线软件能预测hTFF3基因启动子功能,提高了针对启动子的研究效率。     

人HO-1基因启动子区生物信息学分析

目的 分析人血红素加氧酶-1(hHO-1)基因启动子区序列特点,转录因子结合位点种类及CpG岛位置.方法 利用美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库获取hHO-1基因序列和启动子序列,SoftBer-ry分析hHO-1基因核心启动子位置,PROMO和Gene Regulation分析转录因子结合位点种类,MethP...     

p27Kip1基因启动子区的生物信息学分析

目的 生物信息学的发展为通过在线软件预测基因启动子的相关信息提供了众多有重要价值的参考信息.文中利用生物信息学在线软件预测p27Kip1基因启动子功能.方法 获取细胞周期调控因子人p27Kip1启动子全长序列,利用多种在线相关软件预测出甲基化部位和转录因子结合部位. 结果该基因启动子序列全长为3568bp,核苷酸数据库(GenBank)登录号为E26053.p27Kip1启动子序列中CpG岛存在于2544～2845bp、2876～3511bp处,CpG岛的存在会抑制p27Kip1启动子的转录.p27Kip1启动子共有16个转录因子. 结论基因启动子相关生物信息学的研究,提高了针对启动子的研究效率,并为预测基因启动子的功能研究提供了重要信息.     

人MtHfr基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的:对人N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法:从GeneBank数据库中获取人MTHFR基因5'调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果:Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在890、267、73和11个可能的转录因子结合位点,包含Prrx2、ARID3A、Pax2、AHR、ARID3A、MZF1、MafG、SP1和KLF5等。结论:人MTHFR基因5'调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与神经管畸形、肿瘤和心脑血管疾病等有关。     

人MTRR基因启动子区结合蛋白的生物信息学分析

目的对人甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)基因启动子区结合蛋白进行生物信息学分析。方法从Gene Bank数据库中获取人MTRR基因5’调控区,使用在线软件JASPAR对该序列可能存在的转录因子结合位点进行预测。结果 Relative profile score threshold在85%、90%、95%和100%时,该序列存在788、253、66和7个可能的转录因子结合位点,包含SPIB、MZF1、Nr2e3、Prrx2、ARID3A、Pdx1和Prrx2。结论人MTRR基因5’调控区存在多种转录因子的结合位点,这些转录因子大多与胰腺发育,胚胎发育和肿瘤的发生等有关。     

人二硫键氧化还原酶类似蛋白基因启动子克隆和上游抑制元件分析

目的 克隆DsbA-L基因启动子,并对其活性进行初步分析。方法 以人基因组DNA为模板,利用PCR技术扩增DsbA-L基因5’端2115bp片段（从翻译起始点ATG上游-2128~-14区域）。将PCR产物插入荧光素酶报告基因载体pGL3-basic。随后,构建5’端系列缺失的报告基因质粒。将构建的一系列质粒转染3T3-L1和HEK 293细胞,检测荧光素酶活性。利用在线软件MAPPER预测转录调控关键序列潜在的转录因子结合位点。通过Real-time PCR比较这些转录因子在肥胖和正常人脂肪组织中的表达。结果 成功构建人DsbA-L启动子报告基因质粒。系列缺失分析表明-2128~-1302区域是影响转录活性的关键序列。MAPPER软件预测此区域可能与一些转录因子结合。比较这些转录因子在肥胖患者和正常人脂肪组织中的表达情况,发现其中NF-κB和FOXO1在肥胖患者中表达显著增加,进一步推测NF-κB和FOXO1可能是人DsbA-L基因启动子上游的调控抑制因子。结论 成功构建人DsbA-L基因启动子系列缺失质粒,初步分析了其上游可能存在的关键调控元件,为进一步的转录调控研究奠定了基础。     

EOLA1基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

携Smac基因人尿路斑块蛋白Ib启动子调控的真核表达载体的构建

目的 构建携带Smac基因、人尿路斑块蛋白Ib（Uroplakin Ib，UpIb）启动子（promoter）调控的膀胱移行上皮特异性真核表达载体。方法 切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA3．1-Smac内部的人巨细胞病毒和T7启动子序列，替换为在膀胱移行上皮特异表达的UpIb的启动子。构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定。结果 成功构建携带Smac基因人UpUIb启动子凋控的膀胱移行上皮特异性真核表达载体pcDNA3-UpIb promoter-Smac质粒。结论 新构建的载体为膀胱癌的靶向基因治疗奠定了基础。     

EOLAl基因启动子序列的鉴定

目的 鉴定EOLA1基因启动子序列,为深入研究EOLAl的转录调控机制奠定基础.方法 通过PCR反应进一步缺火突变EOLAI基因5'侧翼区-1672～+51(1723 bp)序列,将产物插入到含荧光素酶报告基因的载体pGL3-Basic中,转染ECV304细胞,瞬时表达后测定荧光素酶活性.采用生物信息学分析该1 723 bp片段可能存在的转录因子结合位点.结果 缺失到785 bp片段仍具有肩动子活性,进一步缺欠到717 bp片段后活件消失,从而确定启动子位于-738～ -676 bp序列,其附近含Spl和Myf顺式作用元件.结论 确定了EOLAI启动子范围和转录因子结合位点.     

胃溃疡组织中Smac和XIAP表达的研究

目的 探讨促凋亡因子(Smac)和凋亡抑制蛋白(XIAP)在胃溃疡组织中的表达及意义.方法 分别采用原位末端标记(TUNEL)法和免疫组织化学二步法检测40例胃溃疡患者溃疡愈合前后胃黏膜组织中细胞凋亡指数及Smac和XIAP的表达.结果 胃溃疡愈合前组织中Smac阳性表达强度多为(++)～(+++),愈合后其阳性表达强度多为(+)～(++),溃疡愈合前Smac阳性表达明显强于愈合后(P＜0.01);溃疡愈合前后组织中XIAP阳性表达强度比较差异无统计学意义(P＞0.05).溃疡愈合后细胞凋亡指数明显低于溃疡愈合前(P＜0.01).结论 Smac过表达可能促进胃黏膜上皮细胞凋亡而导致胃溃疡,并影响其愈合; Smac和XIAP蛋白可能参与了Hp感染性胃溃疡发生凋亡和增殖的信号通路.     

携Smac基因人尿路斑块蛋白Ⅰb启动子调控的真核表达载体的构建

目的构建携带Smac基因、人尿路斑块蛋白Ⅰb(UroplakinⅠb,UpⅠb)启动子(promoter)调控的膀胱移行上皮特异性真核表达载体。方法切除含Smac基因的真核表达载体pcDNA3.1-Smac内部的人巨细胞病毒和T7启动子序列,替换为在膀胱移行上皮特异表达的UpⅠb的启动子。构建的质粒经双酶切凝胶电泳及测序鉴定。结果成功构建携带Smac基因人UpⅠb启动子调控的膀胱移行上皮特异性真核表达载体pcDNA3-UpⅠb promoter-Smac质粒。结论新构建的载体为膀胱癌的靶向基因治疗奠定了基础。     

小鼠miR-155基因启动子分析及转录活性鉴定

目的：鉴定小鼠miR-155基因启动子转录活性区域,预测转录因子结合位点,探讨miR-155在巨噬细胞极化中表达失调的转录调控机制。方法：分别构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。将miR-155表达载体与miR-155启动子荧光素酶报告载体瞬时共转染人胚肾上皮细胞293T,48 h后检测双荧光素酶活性。选取miR-155基因转录起始位点(TSS)上游2 000 nt作为启动子区,生物信息学预测该区域可能结合的转录因子,并在体外极化的M1型和M2型巨噬细胞中检测结合的相关转录因子的表达。结果：成功构建小鼠miR-155基因表达质粒和miR-155基因启动子连续截短片段的荧光素酶报告载体。双荧光素酶试验结果显示,小鼠miR-155基因TSS上游1～500 nt、1～1 000 nt及1～2 000 nt片段均存在转录激活作用,提示小鼠miR-155基因TSS上游1～2 000 nt均为miR-155基因的启动子区域,其中1～500 nt为启动子核心区域。转录因子的生物信息学预测结果显示,miR-155基因TSS上游1～2 000 nt...     

人SAMHD1基因核心启动子区域的初步鉴定和分析

目的 鉴定人不育-α-基序结构域和组氨酸/天冬氨酸残基双联体结构域包涵蛋白1 (SAMHD1)基因的核心启动子区域,研究SAMHD1的转录调控机制.方法 从HepG2细胞中提取基因组DNA,PCR扩增SAMHD1基因翻译起始位点上游937、667、553、399 bp片段.将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体,双酶切鉴定后将DNA条带切胶回收,再连入pGL3-Basic载体中,双酶切及DNA测序鉴定.将包含有4个片段的荧光素酶表达载体与pRL-TK共转染HepG2细胞,荧光素酶报告基因活性检测并分析4个片段的启动子活性.5'RACE鉴定SAMHD1在HepG2细胞中的转录起始位点.结果 电泳结果显示已经从HepG细胞中提取出基因组DNA.PCR扩增后电泳结果显示已经扩增出937、667、553、399 bp片段.双酶切后电泳结果显示成功将扩增出的4个片段连入pMD19-T载体.双酶切及DNA测序鉴定已成功构建荧光素酶表达载体pGL3-937、pGL3-667、pGL3-553和pGL3-399.荧光素酶报告基因活性检测显示SAMHD1核心启动子区域位于0～-399区域(ATG前一个碱基为-1).5'RACE结果显示SAMHD1在HepG2细胞中转录起始位点位于-101.结论 SAMHD1的核心启动子位于翻译起始位点上游-101～-399区域,为深入研究肝细胞中SAMHD1转录调控机制奠定了基础.     

人HAS3基因核心启动子区域的初步鉴定与分析

目的对人HAS3基因的核心启动子区域进行初步鉴定和分析,为深入研究HAS3基因的转录调控奠定基础。方法以前期构建的人HAS3基因启动子荧光素酶报告基因重组体P(-761/-305)为模板,采用PCR介导的基因定点突变技术构建4个不同的系列删除体,并对HAS3启动子区域中的Sp1结合位点和核心启动子元件进行定点突变,构建相应的定点突变重组体;采用荧光素酶双报告基因分析技术检测各重组体的启动子活性。结果构建了P(-761/-569)、P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)4个系列删除体和5个定点突变体;启动子活性分析结果表明,P(-761/-569)无启动子活性,P(-563/-305)、P(-490/-305)和P(-433/-305)均具有较强的启动子活性,Sp1结合位点和核心启动子元件的定点突变可导致HAS3启动子活性的降低。结论 HAS3基因的核心启动子区域主要位于其转录起始位点上游附近-433～-305 bp内,Sp1可能在HAS3的转录调控中起重要作用。     

小鼠STING基因启动子的克隆鉴定及功能初步分析

目的:克隆小鼠干扰素基因刺激因子(STING)基因启动子,并对其启动子活性和转录调控机制进行初步探讨?方法:利用PCR方法扩增小鼠STING基因5′上游1 005 bp(-927~+77)的片段,亚克隆至pGL3-basic质粒,然后通过步移缺失构建不同缺失片段的重组质粒?双荧光素酶报告活性分析检测重组质粒在NIH3T3中的活性,并利用生物信息学方法预测转录因子结合位点?结果:经酶切?测序鉴定,成功构建了小鼠STING启动子荧光素酶报告基因重组质粒?与pGL3-basic质粒相比,STING启动子重组质粒的相对荧光素酶活性增加(P < 0.05)?通过生物信息学软件预测小鼠STING启动子区域(-177~-48)可能含有GATA?IK2?MZF1?SP1/SP3?STAT等转录因子结合位点?结论:成功构建小鼠STING不同缺失片段的启动子荧光素酶报告基因重组质粒?通过活性比较,推测小鼠STING的核心启动子区位于-177~+77区域,其中可能含有多个潜在的转录因子结合序列?     

SP1调控PIWIL1基因启动子转录活性研究

目的 克隆转录因子SP1编码序列,构建真核表达质粒PCDNA3.1-SP1,并研究其对PIWIL1基因转录活性的影响。方法 RT-PCR法从正常人外周血总RNA中钓取SP1基因的编码序列,插入至真核表达载体PCNDA3.1（+）,酶切及测序鉴定重组质粒。Western blot法分别验证重组表达载体的在COS-7细胞中的表达效应。分别将活性最高的PIWIL1基因启动子报告基因截短体（即核心启动子区域）、活性最低的PIWIL1基因启动子报告基因截短体,与SP1重组质粒共转染COS-7细胞,利用Dual-Luciferase reporter assay system测定不同启动子活性区的PIWIL1基因转录活性的改变,同时应用光辉霉素A下调SP1的表达来进一步验证SP1对PIWIL1活性的影响。结果 酶切及测序鉴定结果显示SP1表达质粒构建成功,Western blot法结果表明重组SP1表达载体能有效表达于COS-7细胞,过表达SP1可明显提高PIWIL1不同活性区的启动子的活性（P<0.05）。结论 外源性SP1真核表达载体转染能有效表达于COS-7细胞,并对PIWIL1的转录活性起着上调的作用,提示SP1可能是PIWIL1转录活性的正调控元件之一。     

人结核杆菌热休克蛋白70和卡介苗α抗原基因启动子序列测定

用Ｔ７ＤＮＡ聚合酶测序系统测定了人结核杆菌热休克蛋白７０（ｈｓｐ７０）基因的启动子序列和卡介苗（ＢＣＧ）α基因的启动子和信号肽序列，并比较了它们与大肠杆菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）和其它分枝杆菌启动子之间的异同。结果所测的ｈｓｐ７０启动子序列为人结核杆菌ｈｓｐ７０编码基因起始密码（ＡＴＧ）上游１５０个脱氧核苷酸，其中在ＡＴＧ上游－１２￣－８核苷酸处有核糖体结合位点（ＳＤ序列）ＧＧＡＧＧ，在ＲＮＡ聚合酶的结合     

视蛋白基因启动子-绿色荧光蛋白融合基因转基因小鼠模型的建立

目的：从小鼠基因组中克隆小鼠视蛋白基因启动子（ROP）并建立ROP－绿色荧光蛋白（GFP）融合基因转基因小鼠模型。方法：用PCR法从基因组内扩增ROP，通过基因重组的方法构建pmROP-EGFP表达载体，并用限制性内切酶消化和DNA测序进行鉴定。纯化的pMOP-EGFP表达质粒经Not I酶切线性化后，用原核显微注射的方法将其注射入小鼠受精卵雄原核，制作转基因小鼠。新生鼠通过PCR检测在基因组水平筛选首建小鼠，基因组表达阳性的小鼠与正常小鼠交配传化后，取眼球进行冰冻切片，在荧光显微镜下观察视网膜下GFP的表达。结果：从基因组内扩增出了2.1kb的小鼠ROP，成功构建了小鼠ROP－GFP融合基因表达载体pmROP-EGFP。获得了3只转基因小鼠首建，分别命名为C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU21,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU26,C57-TgN(mROP-EGFP)SMMU27。结论：成功建立了视网膜表达GFP蛋白的C57－TgN(mROP-EGFP)SMMU转基因小鼠，它们可用于研究脑和视网膜发育以及视网膜病变机制，还可为进行视网膜移植实验提供哺乳类动物模型。