Experimental study of the effects of rAd-p53 on theradiosensitivity of human hepatocellular carcionoma

目的 探讨重组p53腺病毒(rAd-p53)对不同p53基因型的肝癌细胞放射敏感性的影响及差异.方法 用rAd-p53、Ad-EGFP(构建方式及载体的结构与rAd-p53完全相同,仅目的 基因不同的腺病毒),分别感染人肝癌细胞HepG2(p53野生型)和人肝癌细胞PLC/PRF/5(p53突变型),MTT法检测细胞存活率;不同剂量X射线照射克隆形成率检测细胞放射敏感性,流式细胞仪检测细胞凋亡.结果 15MOI rAd-p53感染48 h后,2种细胞生长抑制率分别为(7.30±1.78)%、(11.51±1.53)%,并且随着病毒滴度或感染时间的增加,生长抑制效应亦逐渐增强(P<0.01); HepG2和PLC/PRF/5细胞放射增敏比(SER值)分别为1.24和1.52;细胞凋亡率分别为(22.19±1.04)%、(30.36±2.74)%;均明显高于空白组和Ad-EGFP组(P<0.01).结论 rAd-p53能显著抑制人肝癌细胞生长、诱导细胞凋亡和提高细胞放射敏感性,并且对PLC/PRF/5细胞(p53突变型)作用强于HepG2(p53野生型).     

人重组p53腺病毒感染p53突变mBGC-823细胞对顺铂敏感性的影响

目的:观察人重组p53腺病毒(rAd-p53)感染含突变型p53基因胃癌BGC-823细胞(mBGC-823)对顺铂(CDDP)敏感性的影响.方法:采用免疫细胞化学和Western Blot法检测rAd-p53(5×1010vp/L)感染mBGC-823细胞48 h后P53蛋白的表达;MTT法测定rAd-p53单药组(5×109、5×1010、5×1011vp/L)、CDDP单药组(3.125、6.25、12.50 mg/L)及联合用药组(5×109/3.125、5×1010/6.25、5×1011/12.5vp,mg/L)作用后mBGC-823细胞的生长抑制率;流式细胞仪检测其细胞周期与凋亡率.结果:rAd-p53感染mBGC-823细胞48 h,P53蛋白的阳性表达率为(63.74±4.21)%,显著高于对照组的(30.80±5.32)%(t=-13.039,P＜0.001);rAd-p53、CDDP单药及联合用药均可抑制细胞生长,其作用呈剂量依赖性(P均＜0.001).rAd-p53单药产生以G2/M期为主的阻滞,凋亡率为(11.76±2.33)%;CDDP单药产生以G1期为主的阻滞,凋亡率为(24.70±2.42)%;联合用药组产生G2/M期为主阻滞,凋亡率为(51.88±2.03)%;各组凋亡率比较差异有统计学意义(F=1 620.595,P均＜0.001).结论:腺病毒介导p53基因感染mBGC-823细胞改变了细胞内在突变的p53状态,诱导凋亡并增加对CDDP的敏感性.     

重组腺病毒介导的野生型p53基因对HepG2细胞抑制作用的研究

目的:研究重组腺病毒介导的野生型p53基因对人肝癌细胞系HepG2的抑制作用。方法:用MTT比色法检测重组人p53腺病毒(Ad-p53)在不同感染滴度、不同感染时间对人肝癌细胞HepG2生长的抑制作用,用流式细胞仪检测Ad-p53作用后HepG2细胞的凋亡率;采用瘤内注射的方法观察Ad-p53对裸鼠移植瘤的抑制作用。结果:Ad-p53对HepG2细胞有明显的抑制效应,效靶比(MOI)越高、作用时间越长,抑制作用越强;当rAd-p53在125MOI效靶比时,细胞生长基本达到完全抑制;p53转导显著增加了HepG2细胞的凋亡率;瘤内注射Ad-p53后,荷瘤裸鼠的肿瘤生长受到明显抑制。结论:Ad-p53对人肝癌HepG2细胞有明显的抑制效应,其抑制效应具有时间、剂量依赖关系,Ad-p53转导野生型p53基因可能是一种有效的肝癌基因治疗途径。     

重组人p53腺病毒增强肝癌放疗敏感性的实验研究

目的 观察重组人p53腺病毒(recombinant human adenovinm p53,rAd-p53)联合放疗对肝癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用.方法 人肝癌细胞SMMC-7721荷瘤裸鼠18只,应用随机数字表法选取2只,1只瘤内注射rAd-p53,另1只注射PBS,注射后48 h处死动物取瘤,Western blot方法检测肿瘤P53蛋白表达;其余16只分为4组:对照组、单独放疗(IR)组、重组人pS3腺病毒(rAd-p53)治疗组和重组人p53腺病毒+放疗(rAd-p53+IR)联合治疗组.实验治疗第16天处死动物,绘制肿瘤生长曲线;光镜下观察肿瘤治疗后组织形态学变化;免疫组化S-P法检测Ki-67,TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡.结果 rAd-p53成功感染了肝癌裸鼠移植瘤细胞,并增强肝癌细胞P53蛋白的表达;rAd-p53+IR联合治疗组、IR组和rAd-p53治疗组的肿瘤生长抑制率分别为81.49%、30.74%和33.67%,其中rAd-p53+IR联合治疗组的肿瘤抑制最强(P<0.01).光镜下观察各治疗组的肿瘤组织均出现坏死,其中rAd-p53+IR联合治疗组肿瘤坏死较多;rAd-p53+IR联合治疗组肿瘤细胞表达Ki-67明显低于对照组、IR组和rAd-p53治疗组(P<0.01),而肿瘤细胞凋亡显著增加(P<0.01).结论 rAd-p53+IR联合治疗较单独放疗能显著抑制肝癌的生长,rAd-p53能增强肝癌对放疗敏感性.     

野生型p53基因提高肝癌细胞化疗药物敏感性的实验研究

目的:研究野生型p53(wtp53)提高肝癌细胞化疗药物敏感性的作用.方法:采用p53基因型不同的三种人肝癌细胞株HepG2 (部分wtp53)、Hep3B(p53-/-)和 PLC/PRF/5(mtp53),观察携wtp53基因的重组腺病毒联合化疗药物争光霉素(bleomycin,bleo)、丝裂霉素(mitomycin, mito)或甲氨蝶呤(methotrexate, meth)对肝癌细胞的杀伤效应.结果:HepG2、Hep3B和 PLC/PRF/5分别耐受600 μg/ml bleo、100 μg/ml mito或1 000 μg/ml meth,但转入wtp53基因后再使用上述质量浓度范围的化疗药物,则肝癌细胞出现了明显的被杀伤效应.结论:wtp53基因能提高肝癌细胞对化疗药物的敏感性,wtp53基因联合化疗药物治疗可望开辟克服肝癌耐药的新途径.     

奥曲肽诱导人肝癌细胞HepG2凋亡

目的探讨奥曲肽诱导人肝癌细胞HepG2凋亡作用及机理.方法采用DNA末端原位标记染色法(TUNEL)、Annexin Ⅴ荧光标记法分别检测肝癌细胞早期和晚期凋亡,细胞免疫化学法检测p53表达.结果 1×10-5mol/L奥曲肽使HepG2细胞早期凋亡阳性率和凋亡指数(AI)增加至(14.2±2.6)%和(18.8±3.3)%,与对照组(1.2±0.1)%(P＜0.05)和(3.6士0.9)%(P＜0.01)比较差异显著;该浓度奥曲肽能明显增加HepG2细胞野生型wp53表达(P＜0.05).结论奥曲肽能诱导肝癌细胞早期及晚期凋亡,这和奥曲肽能使HepG2肝癌细胞wp53表达增加有关.     

腺病毒介导的野生型p53基因对人肺腺癌细胞放疗敏感性的影响

目的:研究腺病毒介导的野生型p53基因(Ad-p53)对人肺腺癌细胞生长及放疗敏感性的影响。方法:将重组的含野生型p53基因的腺病毒导入A549细胞,通过免疫细胞化学方法检测p53基因的表达。A549细胞分为4组:对照组、转染组、放疗组、转染联合放疗组。用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)和流式细胞仪检测p53基因以及联合放射治疗(2,4,6 Gy)对A549细胞生长抑制及凋亡的影响。结果:通过免疫细胞化学方法证实了p53基因在A549细胞中的表达。MTT法检测发现p53基因对A549细胞的生长抑制率为(50.60±5.69)%。当放射剂量为2,4,6 Gy时,A549细胞的生长抑制率分别为(16.06±4.35)%、(16.39±1.67)%、(17.73±4.68)%。当p53基因与放疗(2,4,6 Gy)联合作用时,抑制率分别为(80.60±5.35)%,(89.30±1.67)%、(90.30±2.01)%(P<0.01)。p53基因转染所产生的A549细胞凋亡率为(10.38±1.68)%。放疗(2,4,6 Gy)引起的细胞凋亡率分别为(3.98±0.72)%、(4.84±0.60)%、(5.40±0.70)%。当p53基因与放疗(2,4,6 Gy)联合作用时,凋亡率分别为(17.80±1.30)%、(19.03±0.54)%、(21.34±2.51)%(P<0.01)。结论:野生型p53基因与放疗对人肺腺癌细胞生长有协同抑制作用,增加了人肺腺癌细胞对放射治疗的敏感性     

外源性野生型p53基因对HepG2细胞的作用

目的 研究外源性野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG2细胞生长的影响。方法 以人源性肝癌细胞系HepG2细胞为实验对象,检测其p53基因的突变。转染阳离子脂质体介导的野生型p53基因,检测其表达和凋亡水平的变化。结果 人源性肝癌细胞系HepG2细胞存在p53基因的突变,阳离子脂质体介导的野生型p53基因可有效转染入HepG2细胞中。转染后的HepG2细胞增殖受到抑制,细胞凋亡水平增高。结论 野生型p53基因对人源性肝癌细胞系HepG2细胞有明显的抑制效应, 可能在肝癌的治疗方面起着重要作用。     

rAd-p53瘤内注射联合放化疗前后鼻咽癌原发灶细胞凋亡的变化

目的 观察重组人p53腺病毒(rAd-p53)瘤内注射联合放化疗前后的鼻咽癌原发灶组织细胞凋亡的变化情况.方法 61例确诊中晚期鼻咽癌的患者随机分为2组.治疗组:rAd-p53瘤内注射+同步放化疗.对照组:同步放化疗组.于rAd-p53瘤内注射前及放疗至20Gy(第三次rAd-p53治疗后)时取鼻咽部瘤体活组织标本,分别进行凋亡细胞的原位检测(TUNEL法).结果 对照组治疗前后的AI分别为(4.455±1.670)%、(8.252±4.076)%,治疗组治疗前后的AI分别为(4.453±1.670)%、(13.370±6.957)%,治疗组治疗前后、对照组治疗前后、治疗组与对照组治疗后AI有统计学差异(P＜0.05).结论 rAd-p53瘤内注射联合放化疗鼻咽癌原发灶细胞凋亡指数明显增高.     

外源性p53基因对人胃癌细胞的放射增敏作用

目的:评价外源性p53基因对人胃癌细胞放射敏感性的影响.方法:以复制缺陷型重组腺病毒为载体,将人野生型p53基因导入不同p53状态的4种人胃癌细胞系,用免疫组化法及Western blot法检测p53基因在胃癌细胞中的表达;用细胞存活份数来表示细胞的生长抑制情况;用流式细胞计数、细胞DNA片段化分析和TUNEL检测细胞凋亡.结果:[ HTSS 在高效靶比病毒剂量下,外源p53基因在4种胃癌细胞的胞核中均高效表达,并可使细胞产生明显的G2/M 阻滞和凋亡,使细胞存活份数明显减少.而且这种作用不依赖细胞内在的p53基因状态.单独照射4 Gy,对野生型p53细胞的生长抑制和致凋亡效应明显,而对其它3种细胞的作用较弱 .照射4 Gy结合Ad-p53时,外源p53基因可显著增强照射引起的G2/M期阻滞和凋亡及生长抑制作用,对4种胃癌细胞放射增效比高达2.3～3.6.结论:腺病毒载体介导的野生型p53基因转染4种胃癌细胞后有明显的放射增敏作用.     

原发性肝细胞癌中p33ING1b与p53基因间协同功能的研究

目的　探讨 p33ING1b与 p5 3基因间的协同功能对肝癌细胞生长、阻滞细胞周期、诱导肿瘤细胞凋亡及对 p5 3下游基因p2 1WAF1/CIP1表达的影响。方法　采用脂质体方法将 p33ING1b与wtp5 3基因分别转染入HepG2、PLC/PRF/ 5和Hep3B 3株内源性p5 3基因表达状态各不相同的肝癌细胞株 ,同时设转染反义 p33ING1b及反义wtp5 3质粒实验组和转染空载体对照组 ,转染 4 8h后检测各实验组细胞凋亡率及分析细胞周期变化 ,用Western印迹杂交分析各实验组肝癌细胞中 p33ING1b与 p5 3蛋白表达的变化 ,通过分析受 p2 1WAF1/CIP1启动子调控的荧光素酶报道基因表达的强弱 ,观察各实验组中p5 3下游基因 p2 1WAF1/CIP1的活性情况。采用 6 %乙醇为诱导剂作用于各实验组后 ,再次观察上述各指标的变化。结果　在表达内源性wtp5 3基因的HepG2细胞中 ,转染入 p33ING1b基因后 ,与对照组相比 ,细胞凋亡率增强 (2 2 5 3% ) ,细胞周期中停滞于G0 /G1期细胞的比例增多 (6 7 4 5 % ) ,下游基因p2 1WAF1/CIP1启动子的活性 (13 0 8)增强 (P <0 0 1)。对于表达突变型p5 3蛋白的PLC/PRF/ 5细胞 ,联合共转染 p33ING1b与wtp5 3实验组的G0 /G1期细胞比例 (78 16 % )及 p2 1WAF1/CIP1启动子活性(12 99)比单转染 p33ING1b或wtp5 3基因实验组高 (P     

不同肝癌细胞系中P53/P21/MDM2表达初步观察

选用P53状态不同的Hep3B、PLC／PRF／5、HCC—9204、HepG2、HepG2215细胞，通过Western印迹分析观察各细胞P53蛋白以及P53下游基因p21、mdm2蛋白表达情况；将报告基因PG13-CAT转染细胞，通过观察CAT酶表达水平反映各细胞中P53的反式活化功能；P21—LUC质粒细胞内转染，比较不同细胞中P53对P21启动子的活化情况。结果显示，PLC／PRF／5细胞中P53蛋白高表达、低功能，但P21蛋白以及报告基因P21—LUC转染细胞后荧光素酶均具有较高水平表达；Hep3B细胞中P53蛋白无表达、无功能，P21蛋白低表达，MDM2蛋白表达相对较高；HCC—9204细胞具有较高MDM2表达，P53蛋白表达及功能均较低，P21亦呈低表达；HepG2215较HepG2细胞具有较高的P53、P21蛋白表达，P53活化报告基因的活性也较强。结果提示，肝癌细胞中P53活性与其表达水平、存在状态有关；某些细胞中P21的活化表达存在不依赖于P53的途径；MDM2与P53的表达具有负性相关倾向。     

重组人腺病毒p53提高肺腺癌放射敏感性的实验观察

目的:评价重组人腺病毒p53(rAd-p53)注射液对肺腺癌A2细胞系放射敏感性的影响。方法:实验分空白对照组(C组)、照射组(R组)、加药组(D组)、照射加药组(R D组),利用单击多靶数学模型拟合辐射剂量效应曲线,应用细胞克隆形成实验观察各组细胞存活情况,应用流式细胞仪技术分析各组细胞周期分布和细胞凋亡率。结果:R组与R D组平均致死剂量(D0)分别为1.26Gy、0.45Gy,准阈剂量(Dq)分别为3.37Gy、1.05Gy;两组放射增敏比SERD(0D0之比)为2.8,SERD(qDq之比)为3.21;流式细胞仪结果提示R D组G2/M期细胞比例及细胞凋亡率增加最明显(P<0.05),二者之间存在正相关关系(rs=0.989,P<0.05)。结论:rAd-p53对体外培养的肺腺癌A2细胞具有放射增敏作用。     

重组人p53腺病毒联合奥沙利铂对结肠癌细胞的生长抑制作用

目的观察外源p53基因在结肠癌细胞内的表达、对肿瘤细胞生长的影响,及对结肠癌细胞化疗敏感性的作用和机制。方法用重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53）及奥沙利铂（OXA）单独及联合作用于结肠癌细胞株SW1116不同时间后,CCK-8法检测其对体外培养细胞的抑制率,免疫组织化学S-P法检测p53蛋白的表达情况,流式细胞仪（FCM）分析其细胞凋亡蛋白caspase3的表达情况。结果rAd-p53及OXA单独作用时,随药物浓度及作用时间的增加,细胞的生长抑制率逐渐增高;二者联合作用24 h,在较低浓度时细胞生长抑制率即明显增高（P值均〈0.05）;OXA（6.25μg/ml）与rAd-p53（5×105、5×106、5×107、5×108、5×109vp/ml）联合作用24 h后,与对照组比较,结肠癌细胞caspase-3蛋白的含量升高,但p53蛋白无明显升高。结论OXA和rAd-p53单药可抑制结肠癌细胞SW1116的生长,二者联合对结肠癌细胞的抑制作用增强;rAd-p53有增强OXA化疗敏感性的作用,其机制与通过线粒体途径激活下游的caspase-3诱导细胞凋亡有关。     

重组人p53腺病毒联合奥沙利铂对结肠癌细胞的生长抑制作用

目的观察外源p53基因在结肠癌细胞内的表达、对肿瘤细胞生长的影响,及对结肠癌细胞化疗敏感性的作用和机制。方法用重组人p53腺病毒注射液（rAd-p53）及奥沙利铂（OXA）单独及联合作用于结肠癌细胞株SW1116不同时间后,CCK-8法检测其对体外培养细胞的抑制率,免疫组织化学S-P法检测p53蛋白的表达情况,流式细胞仪（FCM）分析其细胞凋亡蛋白caspase3的表达情况。结果rAd-p53及OXA单独作用时,随药物浓度及作用时间的增加,细胞的生长抑制率逐渐增高;二者联合作用24 h,在较低浓度时细胞生长抑制率即明显增高（P值均〈0.05）;OXA（6.25μg/ml）与rAd-p53（5×105、5×106、5×107、5×108、5×109vp/ml）联合作用24 h后,与对照组比较,结肠癌细胞caspase-3蛋白的含量升高,但p53蛋白无明显升高。结论OXA和rAd-p53单药可抑制结肠癌细胞SW1116的生长,二者联合对结肠癌细胞的抑制作用增强;rAd-p53有增强OXA化疗敏感性的作用,其机制与通过线粒体途径激活下游的caspase-3诱导细胞凋亡有关。     

趋化因子受体CXCR7在人肝癌细胞株中的表达及意义

目的探讨趋化因子受体(Chemokine receptor,CXCR7)在不同肝癌细胞株中的相对表达强度及意义。方法采用RT-PCR、Western blot法,检测8株不同转移潜能肝癌细胞中趋化因子受体CXCR7在mRNA及蛋白水平的表达情况。结果 CXCR7在8株肝癌细胞中的表达水平差异存在统计学意义,无论是mRNA水平还是蛋白水平,高转移潜能肝癌细胞株(MHCC97-L、MHCC97-H、HCCLM3)CXCR7的表达明显高于普通转移潜能肝癌细胞株(HepG2、PLC/PRF/5、SMMC-7721、BEL-7402、Hep3B),P<0.01。结论 CXCR7与肝癌的发生、发展及预后有一定的相关性。     

Bcl—2和p53蛋白表达对肝硬变和肝细胞癌中细胞增殖和凋亡的 …

利用原位ＤＮＡ末端转移酶标记技术及Ｓ 疫组织化学方法检测了肝硬变和肝细胞癌（ＨＣＣ）组织中凋亡细胞,ｐ５３,ｂｃｌ－２蛋白和ＰＣＮＡ的表达。结果显示：ＨＣＣ与肝硬变组织比较,凋亡细胞密度低,ＰＣＮＡ阳性细胞密度高ｐ５３和ｂｃｌ－２蛋白阳性强度高,且均与ＨＣＣ分化程序有关。提示ｐ５３和ｂｃｌ－２蛋白可能是通过其过度表达影响细胞增殖和细胞凋亡失衡,并以“选择性细胞增殖”形式导致的发生和发展。     

阿法替尼联合Mithramycin A对人肝癌 HepG2细胞增殖､凋亡及基因表达的影响

目的:观察阿法替尼(afatinib)联合Mithramycin A(MIT)对人肝癌 HepG2 细胞增殖?凋亡的作用以及相关因子表达的影响?方法:将afatinib与MIT单独或联合作用于肝癌HepG2细胞,采用MTT法测定药物对细胞生长的抑制率,并运用倒置显微镜观察药物作用后细胞形态学变化;以流式细胞技术测定药物对细胞周期和凋亡的影响;以实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR) 定量测定细胞内表皮生长因子受体(EGFR)?Sp1?Sp3以及增殖?凋亡相关因子 Cyclin-D1?Cyclin-E2?Bcl-2?Caspase3?Caspase9和p53的表达变化?结果:afatinib与MIT均能有效抑制肝癌HepG2 细胞的生长,并且呈现时间依赖性,两药联合作用能明显增加抑制率(P均 < 0.05);联合用药48 h后,可诱导HepG2细胞产生G0/G1期阻滞并诱发凋亡,抑制作用及凋亡率均较单药组增高(P均 < 0.05);另外,给药72 h后,单药组均出现不同程度的Cyclin-D1?Cyclin-E2?Bcl-2 mRNA 表达量下降,并伴有Caspase3基因上调?单用afatinib组同时出现Caspase9和p53的表达上调,MIT组检测到EGFR?Sp1和Sp3的同步减少,联合用药组以上改变较单药组明显(P均 < 0.05)?结论:afatinib联合MIT能有效抑制肝癌 HepG2 细胞增殖?促进凋亡,这可能与药物作用后Cyclin-D1?Cyclin-E2?Bcl-2下调以及Caspase3?Caspase9和p53的表达上调相关?此项研究可能为以EGFR为中心的肝癌联合治疗提供新方向?     

二甲双胍通过miR-194-5p/RBM6通路抑制肝细胞癌细胞的恶性细胞表型的机制研究

目的 观察二甲双胍对肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)细胞HepG2增殖、凋亡的影响,并探究其潜在机制与miR-194-5p/RNA结合基序蛋白6(RNA binding motif protein 6,RBM6)通路之间的关系。方法 随机将100例接受手术的HCC患者分为对照组、试验组,每组50例。对照组患者给予安慰剂口服,试验组给予二甲双胍口服。脂质体法将antagomiRNA、antagomiR-194-5p、pcDNA 3.1、pcDNA 3.1-RBM6、二甲双胍+si-NC、二甲双胍+si-RBM6、antagomiR-194-5p+si-NC、antagomiR-194-5p+si-RBM6转染至HepG2细胞。荧光定量聚合酶链式反应实验检测血清、组织、细胞中miR-194-5p、RBM6的表达;噻唑蓝法、5-溴-2-脱氧尿嘧啶染色检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡;双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光活性;蛋白免疫印迹实验检测细胞RBM6蛋白。结果 试验组患者的2年无瘤生存期显著延长,患者治疗后血清miR-194-5p表达明显降低(P...     

p27kip1过表达对肝细胞癌细胞株细胞周期的影响

目的探讨肿瘤抑制基因p27^kip1编码的P27蛋白过表达与HCC细胞株细胞周期的关系。方法本研究从野生型p27^kip1基因真核表达质粒pEYFP-P27（WT）出发,采用定点诱变技术构建了突变型p27^kip1基因表达载体pEYFP-P27（S10A）、pEYFP-P27（T157A）和pEYFP-P27（T187A）,然后用脂质体法将上述质粒转染HCC细胞株HepG2和Hep3B,Western Blotting检测内源和转入的P27蛋白表达,流式细胞仪检测P27蛋白过表达对HCC细胞株细胞周期的影响。结果野生型和3种突变型的P27融合蛋白在HepG2和Hep3B中的过表达都能增强G0／G1期阻抑;同时,对HepG2细胞,核定位位点突变体P27（T157A）比野生型P27蛋白及其他两个突变体具有更强的细胞周期阻抑活性,而对Hep3B细胞,3个突变体和野生型p27蛋白对细胞周期的影响无明显差异。结论P27蛋白过表达能够显著增强HCC细胞株的G0／G1期阻抑。