Relationship between characteristics of MnSOD expression and radiosensitivity in esophageal cancer cells

目的:研究锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)在一氧化氮(nitric oxide,NO)作用下对食管癌TE-1细胞放射敏感性的影响.方法:采用慢病毒转染法将MnSOD重组质粒转染食管癌TE-1细胞,分别建立中、高水平过量表达MnSOD的稳定转染细胞(TE-1Mm、TE-1Mh)及空载体细胞(TE-1Mn).进一步采用RT-PCR、Western blot检测转染后TE-1细胞、空载体TE-1Mn细胞、稳定转染细胞TE-1Mm及TE-1Mh中MnSOD mRNA和蛋白的表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验评价NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)、放射线及二者联合对以上4组细胞的抑制;流式细胞术(FCM)及Western blot检测各组细胞凋亡、活性氧(reactive oxygen species,ROS)荧光强度及蛋白表达的变化.结果:成功建立了稳定中、高水平过量表达MnSOD的TE1细胞株TE-1Mm和TE-1Mh;RT-PCR及Western blot证实上述2种细胞中含有不同表达水平的MnSOD.MTT法及FCM显示,TE1Mm细胞的存活率下降,细胞凋亡率上调,而TE-1Mh细胞的存活率上调,细胞凋亡率下降,相应组间相比差异具有统计学意义(P＜0.05).0.5～2 mmol/L SNP及2、4、6Gy放射线处理48 h,TE-1Mm细胞生长抑制率明显增加,细胞生长明显减慢,放射增敏比增加,细胞凋亡率上调;TE-1Mh细胞抑制率反而降低,细胞生长加速,放射增敏比降低,细胞凋亡率下降,相应组间相比差异均具有统计学意义(P＜0.05).Western blot结果及FCM显示:0.5～2 mmol/L SNP及2、4、6 Gy放射线处理48 h,与TE-1Mm细胞相比,TE-1Mh细胞MnSOD蛋白表达量及细胞内ROS相对降低,相应组间相比差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论:中等水平过量表达MnSOD增加食管癌细胞放射敏感性,抑制增殖,诱导凋亡,而高水平过量表达MnSOD则与之相反,为今后通过MnSOD提高放射敏感性来抑制食管癌或通过其抗拒放射来保护正常细胞提供了可能性.     

锰超氧化物歧化酶过表达对食管癌TE-1细胞增殖及移植瘤生长的双向影响

目的:通过体内外实验探讨锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)过量表达对食管癌TE-1细胞增殖的影响。方法:采用病毒感染法将不同剂量构建有MnSOD基因的重组质粒转入食管癌TE-1细胞,建立中、高表达MnSOD的TE-1细胞pLenti6-mMnSOD/TE-1(TE-1Mm)和pLenti6-hMnSOD/TE-1(TE-1Mh);采用RT-PCR法及Western印迹法检测转染MnSOD重组质粒的TE-1细胞中mRNA和蛋白水平的表达变化情况;应用平皿克隆形成实验及FCM法观察细胞增殖、凋亡和周期变化的情况;将MnSOD转染后的TE-1细胞接种到裸鼠皮下检测成瘤及肿瘤生长情况,采用免疫组织化学和Western印迹法检测移植瘤中MnSOD蛋白的表达水平。结果:建立稳定表达MnSOD蛋白的TE-1细胞株;RT-PCR及Western印迹法检测结果均证实,感染不同剂量的MnSOD重组质粒的TE-1细胞中,MnSOD的表达水平随感染剂量的增加而上升;细胞平皿克隆检测结果提示,TE-1Mm和TE-1Mh细胞的集落形成能力为(23.0±2.7)%和(45.3±4.5)%,分别低于和高于TE-1细胞的(34.7±4.2)%及TE-1n细胞的(33.7±4.7)%,实验组间比较及与对照组进行比较,差异均有统计学意义(P<0.05);AnnexinV-PI双染FCM检测结果显示,TE-1Mm和TE-1Mh细胞的早期细胞凋亡率为(10.6±1.0)%和(1.0±0.1)%,分别高于和低于对照组TE-1细胞的(2.6±0.2)%和TE-1n细胞的(2.5±0.3)%(P<0.05);细胞周期检测结果显示,MnSOD过量表达使G0/G1期细胞数在TE-1Mm细胞中增多,而在TE-1Mh细胞中减少,G2/M期和S期细胞数则在TE-1Mm细胞中减少,在TE-1Mh细胞中增多;与亲本TE-1细胞和感染空载体TE-1n细胞相比,TE-1Mm细胞处在增殖期细胞少,而TE-1Mh细胞处在增殖期细胞多(P<0.05)。TE-1Mm细胞接种裸鼠后,肿瘤生长慢,体积小,而接种TE-1Mh细胞则相反,肿瘤生长速度明显加快;瘤组织中的MnSOD蛋白的表达水平,与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:MnSOD过量表达通过改变细胞周期和凋亡,对食管癌TE-1细胞的增殖和移植瘤的生长均表现为促进和抑制增殖的双向作用。     

一氧化氮对食管癌细胞放射增敏效应及其机制的探讨

目的:探讨一氧化氮(NO)对食管癌细胞株TE-1的放射增敏影响及其可能的机制.方法:四甲基偶氮唑蓝比色实验(MTT法)观察NO及放射线对细胞增殖的抑制作用,并分析NO、TE-1的放射增敏作用.流式细胞法(FCM)观察NO、放射线对细胞凋亡及周期的影响.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法研究NO对锰超氧化物歧化酶( MnSOD) mRNA及蛋白表达的影响.结果:0.1～4 mmol/L NO及1、2、4、6和8 Gy放射线处理后,TE-1细胞生长抑制率明显增加.1.0 mmol/L NO联合1、2、4和6 Gy放射线处理后,放射增敏比值为2.68,说明NO有放射增敏作用.细胞凋亡实验显示,NO联合放射线作用的凋亡细胞比率为(10.7±0.7)％,与NO、放射线单独作用相比,差异有统计学意义,P＜0.05.细胞周期实验显示,NO联合放射线使G0+ G1期[(29.00±1.20)％]、S期[(29.80±1.10)％]细胞数减少,G2 +M期[(41.20±2.50)％]细胞数增加,与NO、放射线单独作用相比,差异有统计学意义,P＜0.05.RT-PCR显示,NO联合放射线作用的TE-1细胞MnSOD mRNA表达量为0.12±0.03,与NO、放射线单独作用相比,差异有统计学意义,P＜0.05.蛋白质印迹法结果显示,NO联合放射线作用的TE-1细胞MnSOD蛋白表达量为0.13±0.1,与NO、放射线单独作用相比,差异有统计学意义,P＜0.05.结论:NO可能通过影响TE-1细胞周期,降低MnSOD mRNA及蛋白的表达,从而抑制食管癌细胞凋亡,增强放射线对食管癌细胞的杀伤作用.     

反义cDNA对放射线诱导食管癌细胞VEGF高表达的抑制作用

[目的]探讨反义VEGFcDNA对放射线诱导人食管癌细胞VEGF高表达的抑制作用,为食管癌放疗与反义VEGF联合治疗提供依据。[方法]阳离子脂质体作为载体,用反义VEGFcDNA质粒转染人食管癌细胞TE-1;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、原位杂交和流式细胞术检测转染后癌细胞;γ线照射转染、非转染食管癌细胞TE-1,采用免疫组化、ELISA与RT-PCR法分别观察反义VEGFcDNA对放射线诱导的食管癌细胞TE-1VEGF表达的作用。[结果]转染反义VEGFcDNA的食管癌细胞有外源性反义VEGFcDNA的整合及表达,癌细胞生长速率无明显减慢,凋亡现象并不明显。转染细胞较非转染的食管癌细胞TE-1相比,照射后细胞表达VEGFmRNA及蛋白的水平均明显降低。[结论]以抗VEGF表达为基础的抗血管生成治疗有可能成为食管癌放射治疗的有效辅助手段。反义VEGFcDNA对放射线诱导的人食管癌细胞VEGF高表达有明显抑制作用。     

反义血管内皮生长因子对食管癌细胞体外放射增敏作用

[目的]研究TE-1细胞转染VEGF反义寡核苷酸，观察转染后肿瘤细胞VEGF表达情况及其对放射敏感性的影响。[方法]将反义VEGF寡核苷酸经Lipofectamine^TM2000介导转染TE-1细胞；并经γ线照射。采用MTT法检测细胞生长状况，RT-PCR、Western blotting检测细胞照射前后VEGF基因的表达，流式细胞术检测细胞周期分布情况和凋亡率；克隆形成实验反映转染后细胞放射敏感性的变化。[结果]将反义VEGF寡核苷酸成功地转染人食管癌TE-1细胞中，VEGF表达水平明显降低，体外增殖反应无明显差异，细胞周期分布情况相似．未见明显凋亡发生。不同剂量照射后增殖情况无统计学差异；反义组细胞凋亡率略有上升．转染反义组细胞较未转染组细胞放射敏感性增加。[结论]转染反义VEGF寡核苷酸可抑制食管癌TE-1细胞VEGF表达，联合放射治疗，对TE-1细胞增殖无明显作用，而其放射敏感性有增强作用。     

三氧化二砷对食管癌细胞株Eca109的放射增敏作用及机制

目的探讨三氧化二砷（Arsenic trioxide, As2O3）及As2O3与放射线联合对食管癌Eca109细胞的增殖抑制作用;分析二者联合对Eca109细胞周期和凋亡的影响,为As2O3的临床应用提供理论依据。方法MTT法观察放射线及As2O3单独及二者联合对食管癌Eca109细胞的增殖抑制作用,利用直线相关及直线回归拟合出照射组、As2O3组及联合组的直线,计算增敏比（sensitizing enhancement ratio, SER）;流式细胞术检测As2O3联合放射线对Eca109细胞周期和凋亡的影响;Western blot印记技术观察As2O3联合放射线对锰超氧化物歧化酶（Manganese superoxide dismutase, MnSOD）和细胞色素C（cytochrome C, cyt-C）蛋白表达的影响。结果As2O3能抑制食管癌Eca109细胞的增殖,具有明显的量效和时效关系;As2O3对食管癌Eca109细胞有明显的放射增敏作用;As2O3与放射线联合作用于Eca109细胞后,G2/M期细胞比例及凋亡率明显增加,MnSOD蛋白表达下降,而cyt-C蛋白表达未见明显变化。结论As2O3可能通过G2/M期阻滞,降低MnSOD蛋白的表达,从而诱导细胞凋亡来增强放射线对细胞的杀伤作用。     

RNA干扰抑制UHRF1基因表达对食管癌细胞放射增敏作用的研究

目的 研究RNA干扰抑制UHRF₁表达对食管癌细胞系(TE-1)放射敏感性的影响及作用机制。方法 以慢病毒感染方法将UHRF₁基因的短发夹状RNA (shRNA)转入TE-1细胞,并分为未转染组、转染NC-shRNA组、转染UHRF₁-shRNA组,前二者为对照组。采用 RT-PCR和蛋白印记法检测转染前后细胞UHRF₁的mRNA和蛋白表达,成克隆法、流式细胞术及蛋白印记法检测转染UHRF₁-shRNA联合X线照射对TE-1细胞放射敏感性、周期、凋亡及DNA损伤标识蛋白γ-H₂AX的影响。     

下调ERp57抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:分析内质网驻留蛋白57(ERp57)在食管鳞癌组织中的表达情况以及下调ERp57对食管癌细胞TE-1生物学功能的影响。方法:GEPIA数据库分析食管癌中ERp57的表达;通过荧光定量PCR和Western blot检测临床食管癌标本及细胞株中ERp57的表达;利用shRNA沉默TE-1细胞内ERp57后,通过CCK8检测细胞增殖、TUNEL检测细胞凋亡、划痕检测细胞迁移、Transwell检测细胞侵袭。结果:食管癌组织中ERp57的mRNA和蛋白的表达水平均高于癌旁组织(P<0.05),食管癌细胞中ERp57的mRNA及蛋白的表达高于食管上皮细胞(P<0.05)。沉默ERp57使TE-1细胞的增殖能力减弱、凋亡比例增加,并减弱了TE-1细胞的迁移及侵袭能力。结论:沉默ERp57表达能够抑制食管癌细胞TE-1的增殖、迁移、侵袭,可为食管癌研究提供理论依据。     

Bidirectional Regulation of Manganese Superoxide Dismutase (MnSOD) on the Radiosensitivity of Esophageal Cancer Cells

The mitochondrial antioxidant protein manganese superoxide dismutase (MnSOD) may represent a newtype of tumor suppressor protein. Overexpression of the cDNA of this gene by plasmid or recombinant lentiviraltransfection in various types of cancer leads to growth suppression both in vitro and in vivo. We previouslydetermined that changes in MnSOD expression had bidirectional effects on adriamycin (ADR) when combinedwith nitric oxide (NO). Radiation induces free radicals in a manner similar to ADR, so we speculated thatMnSOD combined with NO would also have a bidirectional effect on cellular radiosensitivity. To examine thishypothesis, TE-1 human esophageal squamous carcinoma cells were stably transfected using lipofectamine witha pLenti6–DEST plasmid containing human MnSOD cDNA at moderate to high overexpression levels or withno MnSOD insert. Blastidicin-resistant colonies were isolated, grown, and maintained in culture. We found thatmoderate overexpression of MnSOD decreased growth rates, plating efficiency, and increased apoptosis. However,high overexpression increased growth rates, plating efficiency, and decreased apoptosis. When combined withNO, moderate overexpression of MnSOD increased the radiosensitivity of esophageal cancer cells, whereas highMnSOD overexpression had the opposite effect. This finding suggests a potential new method to kill certainradioresistant tumors and to provide radioresistance to normal cells.     

DAPT对食管鳞癌细胞株增殖与凋亡影响机制探讨

目的：观察γ-分泌酶抑制剂DAPT阻断Notch信号通路对食管鳞状细胞癌细胞株增殖和凋亡的影响,并初步探讨其作用机制。方法：采用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理培养的食管鳞癌Eca109和TE-1细胞株以阻断Notch信号,分别应用CCK-8试剂和流式细胞术检测两种食管鳞癌细胞株的增殖与凋亡情况;同时采用定量PCR检测细胞Notch受体及靶基因Hes-1mRNA的表达,蛋白质印迹法检测与细胞增殖、凋亡相关蛋白Cyclin D1和Bcl-2的表达。结果：DAPT处理明显抑制了食管鳞癌Eca109和TE-1细胞株增殖,5μmol/L DAPT处理Eca109细胞株72h、TE-1细胞株96h后增殖抑制率分别为（61.8±5.3）%和（59.8±2.9）%,与DMSO对照组（17.2±2.6）%和（7.0±2.1）%相比差异有统计学意义,P=0.000 2和P〈0.000 1,且抑制作用呈时间和浓度依赖关系。DAPT可诱导Eca09和TE-1细胞株凋亡,5μmol/L DAPT处理组Eca109细胞凋亡率在24和48h分别为（18.24±2.60）%和（21.77±5.82）%,与相应对照组（10.49±2.27）%和（9.74±3.38）%相比凋亡率增加,差异有统计学意义,P值分别为0.017 8和0.036 4;处理组TE-1细胞凋亡率在24和48h分别为（20.21±5.90）%和（32.14±5.92）%,与相应对照组（8.00±2.84）%和（12.59±3.72）%相比凋亡率增加,差异有统计学意义,P值分别为0.032 1和0.008 4。DAPT处理下调两种细胞株Notch2受体、Notch信号靶基因Hes-1及Cyclin D1的表达水平。DAPT处理可上调Eca109细胞Bcl-2水平,但下调了TE-1细胞中Bcl-2水平。结论：γ-分泌酶抑制剂DAPT可抑制食管鳞癌细胞株增殖并促进其凋亡,其机制可能与DAPT阻断Notch信号活化、调控Cyclin D1和Bcl-2的表达有关,阻断Notch信号通路有望成为食管鳞状细胞癌治疗的新靶点。     

尼美舒利对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用

目的：比较选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂尼美舒利对不同COX-2表达水平的食管鳞癌细胞的抑制作用。方法：选取食管鳞癌细胞株EC 109、KYSE 150和TE-1,采用Western blot方法测定COX-2蛋白表达、MTT法检测细胞增殖抑制,流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡,观察尼美舒利对各组细胞的增殖抑制和促凋亡作用。结果：COX-2蛋白在EC 109细胞中呈高表达,KYSE 150细胞中呈中等度表达,TE-1细胞不表达COX-2蛋白。尼美舒利在50μmol/L-400μmol/L浓度区间可抑制EC 109、KYSE 150细胞的增殖（P〈0.05）,并呈剂量依赖性,在400μmol/L时对TE-1细胞有抑制作用。EC 109细胞尼美舒利的IC50值最低,KYSE150次之,TE-1最高。尼美舒利可使EC 109和KYSE 150的细胞周期阻滞于G0/G1期,并诱导细胞凋亡,但对TE-1细胞无上述作用。结论：尼美舒利对表达COX-2的食管鳞癌细胞有较好的增殖抑制和促凋亡作用。     

mRNA干扰BMI-1对人食管癌细胞放射增敏作用研究

目的 研究BMI-1对食管癌TE-13细胞放射敏感性的影响及其机制。方法 以TE-13细胞为研究对象,分为转染有效BMI-1 mRNA干扰序列(siRNA)即BMI-1 siRNA组、转染阴性对照序列即NC组、未转染即control组。qRT-PCR和蛋白印迹法检测TE-13细胞中BMI-1 mRNA和蛋白表达水平;MTT法和克隆形成实验检测BMI-1对食管癌TE-13细胞增殖和放射敏感性影响;流式细胞术检测BMI-1对TE-13细胞周期、凋亡的影响;蛋白印迹法检测细胞中Bcl-2、Bax蛋白表达水平。组间差异采用方差分析。结果 BMI-1 siRNA组BMI-1 mRNA和蛋白表达水平均显著低于control、NC组(P=0.000、0.000)。照射后BMI-1 siRNA组肿瘤细胞的增殖水平、克隆形成能力均显著下降(P=0.031、0.000);照射后BMI-1 siRNA组G₂+M期细胞比例显著低于control、NC组(P=0.000、0.000),且凋亡率明显增加(P=0.000、0.000),同时Bcl-2的表达显著降低(P=0.000、0.000),而Bax表达明显增加(P=0.000、0.000)。结论 干扰siRNA抑制了食管癌TE-13细胞中BMI-1基因的表达,消除了G₂+M期阻滞,显著提高了电离辐射后细胞凋亡水平,增加了放射敏感性,该作用可能与Bcl-2和Bax基因表达有关。     

连翘叶乙醇提取物对人食管癌细胞增殖抑制作用的研究

 目的
研究中药连翘叶乙醇提取物体外对食管癌细胞增殖的影响及对TE-13细胞凋亡的影响并探讨其作用机制。方法应用MTT法分析不同浓度连翘叶乙醇提取物(ethanol extract of Forsythia suspense leaf,FSEE）对人食管癌细胞TE-13、TE-1、Yes-2和 Eca-109增殖的影响;光学显微镜下观察经FSEE处理后细胞的形态学改变; Wright-Giemsa染色观察TE-13细胞凋亡的形态学变化;经Annexin V/PI双染后用流式细胞术检测 FSEE对TE-13细胞凋亡率的影响;用不同浓度(0.1、0.2、0.5mg/ml）FSEE作用于TE-13细胞24 h后,分析细胞PARP、Caspase 3、 Caspase 8、Caspase 9蛋白表达的变化。RT-PCR法检测FSEE对TE-13细胞凋亡相关基因Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xL、Bax mRNA表达的影响。结果FSEE对人食管癌细胞增殖具有显著抑制作用(P<0.05);经FSEE处理24 h后,TE-13细胞出现明显的凋亡形态学改变,TE-13细胞凋亡率明显增高,与未处理组比较差异有统计学意义(P<0.01）;经0.1、0.2、0.5 mg/ml FSEE作用24 h后,TE-13细胞PARP、Caspase 3、Caspase 9蛋白出现裂解片段,并随药物浓度增加,裂解片段浓度升高,呈浓度依赖性,组间比较差异有统计学意义(P<0.01）。 经FSEE处理后,TE-13 细胞Bax mRNA表达上调, Bcl-2和Bcl-xL mRNA表达水平下调。结论FSEE在体外可明显抑制食管癌细胞的增殖,诱导TE-13细胞凋亡,其机制可能与其通过Caspase依赖性的内源途径诱导细胞凋亡有关。