HPRT gene mutation in ovarian cells and TK gene mutation in lymphoma cells induced by Bupirimate

目的:采用体外培养细胞基因突变试验,评价乙嘧酚磺酸酯原药对中国仓鼠卵巢CHO细胞基因HPRT位点和小鼠淋巴瘤L5178Y细胞基因TK位点的诱变性.方法:使用乙嘧酚磺酸酯原药对CHO细胞和L5178Y细胞进行染毒,实验设置5、15、50、150 μg/ml共4个浓度组,分别对CHO细胞进行集落形成率,HPRT位点突变频率的测定;对L5178Y细胞进行接种效率,相对存活率,TK位点突变频率的测定.结果:随着乙嘧酚磺酸酯原药剂量的逐渐增高,CHO细胞的集落形成率较阴性对照组明显降低(P＜ 0.01); L5178Y细胞的平板接种效率和相对存活率与阴性对照组相比均明显下降,但是设计的4个剂量组基因突变率与阴性对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05).结论:在本实验条件下,乙嘧酚磺酸酯原药对CHO细胞和L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,但其对细胞基因HPRT位点和TK位点的突变率无明显影响.     

用TK基因突变试验评价土荆芥精油的遗传毒性

目的： 采用TK基因突变试验评价土荆芥精油的遗传毒性,为其安全性评价提供资料。方法：土荆芥精油浓度设置分别为体积分数0.002%、0.004%、0.006%和0.008%,对L5178Y细胞进行3 h染毒处理;同时分别设二甲基亚砜(DMSO)和环磷酰胺(CP)为溶剂对照和阳性对照,微孔板法进行TK基因突变试验。检测土荆芥精油对L5178Y细胞的细胞毒性及TK基因位点突变频率。结果：随土荆芥精油浓度的增大,L5178Y细胞相对存活率(RS)、相对悬浮生长率(RSG)和相对总生长率(RTG)较溶剂对照组有下降趋势;0.008%剂量组时,RS、RSG和RTG分别为溶剂对照组的29.38%、38.13%和5.75%,表现出明显的细胞毒性;与溶剂对照组相比,突变频率(TMF)随土荆芥精油浓度增加则呈上升趋势(F=410.5,P=0.00)。TMF在土荆芥精油各浓度组间以及和阳性、溶剂对照组间的多重比较差异均有统计学意义(P<0.05)。小集落百分比(SC)均超过95%。结论：土荆芥精油具有一定的细胞毒性,可诱导L5178Y细胞TK基因位点突变频率增高,有一定的致突变性。     

丙烯酰胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究

背景与目的:研究丙烯酰胺(Acrylamide,AA)对小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk /-细胞tk基因突变频率的影响。材料与方法:使用丙烯酰胺对L5178Y细胞进行梯度染毒,分别进行细胞毒性,细胞接种效率,相对悬浮生长率和突变频率的测定。结果:随着AA剂量的增加,L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率均明显降低。在150～750μg/ml范围内诱导L5178Y细胞tk基因的突变频率高于自发突变频率1～9倍,表明具有较强的致突变性。结论:AA对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,并可以诱导tk基因的突变。     

硝酸羟胺诱导小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变的研究

背景与目的:研究硝酸羟胺对小鼠淋巴瘤L5178Y-3.7.2c tk /-细胞tk基因突变的影响.材料与方法:使用硝酸羟胺对L5178Y细胞进行梯度染毒,再分别进行细胞毒性,细胞接种效率,相对存活率,相对悬浮生长率和突变频率测定.结果:随着硝酸羟胺的剂量增加,L5178Y细胞的相对存活率和悬浮生长率均下降.在硝酸羟胺50～500μg/ml范围内可以诱导细胞tk基因的突变率达到自发突变率几倍至十几倍.结论:硝酸羟胺对L5178Y细胞具有明显的细胞毒性,并可以诱导tk基因突变.     

TK基因突变试验—L5178Y细胞与TK6细胞的比较研究

TK基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外短期致突变实验,它具有很高的灵敏度,可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。TK基因突变试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等,其基因型均为tk^ /-。使用L5178Y细胞的试验（即小鼠淋巴瘤细胞试验）发展较早,已形成一套比较完善的方法。而TK6和WTK1等人类来源的细胞在TK基因突变分析中的应用时间还不长,其方法尚不太成熟且资料有限,但因为来源于人类,在评价受试物对人体的损伤方面意义可能更大。有关小鼠淋巴瘤细胞和人类淋巴母细胞在TK基因突变试验中的灵敏度和特异性方面的比较性研究的报告尚不多见。本研究使用3种常规诱变剂（MMS、EMS、MMC）和一种非诱变剂（KCl）,分别采用琼脂平皿血和微孔平板法对两种细胞（L5178Y与TK6）的灵敏度和特异性进行比较研究。研究结果表明,直接比较同一受试物诱发两种细胞的突变频率,TK6细胞显著低于L5178Y细胞。比较两种细胞的相对突变指数时,TK6细胞突变指数显著高于L5178Y细胞。而且TK6细胞在较低浓度的受试物剂量下即可诱发突变频率、突变指数的显著增加。说明TK6细胞在本试验中比L5178Y细胞敏感。两种细胞采用两种方法对4种受试物的致突变性评价结果一致,即3种强致突变剂的检测结果均为阳性;微孔法检测KCl的结果两种细胞均为阳性,而琼脂法的检测结果均为无反应。结论：使用TK6细胞和L5178Y细胞对4种受试物的检测结果基本一致,但TK6细胞在检测低毒性、低浓度受试物时优于L5178Y细胞。另外,从对人类的实际意义来看,也应推广TK6细胞在TK细胞突变分析中的应用。     

69. TK基因突变试验-L5178Y细胞与TK6细胞的比较研究

TK基因突变试验是一种国外已广泛使用的体外短期致突变实验，它具有很高的灵敏度，可检出包括点突变、大的缺失、重组、染色体异倍性和其他较大范围基因组改变在内的多种遗传改变。TK基因突变试验采用的靶细胞系主要有小鼠淋巴瘤细胞L5178Y以及人类淋巴母细胞TK6和WTK1等，其基因型均为tk+/-。使用L5178Y细胞的试验（即小鼠淋巴瘤细胞试验）发展较早，已形成一套比较完善的方法。而TK6和WTK1等人类来源的细胞在TK基因突变分析中的应用时间还不长，其方法尚不太成熟且资料有限，但因为来源于人类，在评价受试物对人体的损伤方面意义可能更大。有关小鼠淋巴瘤细胞和人类淋巴母细胞在TK基因突变试验中的灵敏度与特异性方面的比较性研究的报告尚不多见。本研究使用3种常规诱变剂（MMS、EMS、MMC）和一种非诱变剂（KCl），分别采用琼脂平皿法和微孔平板法对两种细胞（L5178Y与TK6）的灵敏度和特异性进行比较研究。研究结果表明，直接比较同一受试物诱发两种细胞的突变频率，TK6细胞显著低于L5178Y细胞。比较两种细胞的相对突变指数时，TK6细胞突变指数显著高于L5178Y细胞。而且TK6细胞在较低浓度的受试物剂量下即可诱发突变频率、突变指数的显著增加。说明TK6细胞在本试验中比L5178Y细胞敏感。两种细胞采用两种方法对4种受试物的致突变性评价结果一致，即3种强致突变剂的检测结果均为阳性；微孔法检测KCl的结果两种细胞均为阳性，而琼脂法的检测结果均为无反应。结论：使用TK6细胞和L5l78Y细胞对4种受试物的检测结果基本一致，但TK6细胞在检测低毒性、低浓度受试物时优于L5178Y细胞。另外，从对人类的实际意义来看，也应推广TK6细胞在TK基因突变分析中的应用。     

微囊藻毒素Microcystin-LR体外遗传毒性

背景与目的:应用人类淋巴母细胞TK6研究微囊藻毒素(Microcystin_LR,MCLR)的体外遗传毒性。材料与方法:MCLR体外染毒TK6细胞4h或24h后检测细胞毒性、微核及tk位点突变频率。结果:4h染毒未引发明显细胞毒性,24hMCLR染毒导致TK6细胞相对存活率下降,细胞微核率及TK基因突变频率明显上升,并有剂量-反应关系。最高浓度组(80μg/ml)的细胞微核率及TK基因突变频率分别是对照组的4.8及5.1倍。MCLR诱发tk位点两种不同表型的突变细胞集落,即正常生长集落及缓慢生长集落,并以后者为主。结论:24h染毒MCLR可以诱发TK6细胞微核及基因突变,揭示MCLR可能是一种断裂剂。     

乳腺癌患者放疗前后外周血淋巴细胞HPRT基因位点突变频率的初步研究

目的:研究乳腺癌患者手术及放疗前后外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率的变化,探讨体细胞HPRT基因突变频率与乳腺癌手术及放疗的关系。方法:采用多核细胞法研究乳腺癌患者手术前后及放疗前后外周血淋巴细胞HPRT基因位点的突变频率,并与正常人群进行对比。结果:去除吸烟以及年龄对HPRT基因突变频率的影响后,乳腺癌患者手术前的外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率均数为1.118×10-3,高于对照组均数1.040×10-3,t=6.848,P<0.01;乳腺癌患者手术后HPRT突变频率均数1.103×10-3,与手术前HPRT突变频率均数1.118×10-3比较,差异无统计学意义,t=1.328,P>0.05。乳腺癌患者放疗后外周血淋巴细胞HPRT基因突变频率均数为1.187×10-3,高于放疗前均数1.103×10-3,t=7.179,P<0.01。结论:HPRT基因位点突变频率可能适合乳腺癌高危人群的筛选和生物学检测,也有可能作为放疗损伤的生物学监测指标。     

Ames试验与MLA试验检测两味含马兜铃酸中药的致突变性

背景与目的:检测单味马兜铃及复方龙胆泻肝丸的遗传毒性.材料与方法:鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames test)检测含马兜铃酸的两味单、复方中药的细菌回复突变率;采用96孔微孔板接种法进行小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验(mouse lymphoma assay,MLA),经单、复方含马兜铃酸浓度5 μg/ml对L5178Y/tk(+/-)-3.7.2c细胞进行染毒,分别测定其接种效率(PE),相对总增长率(RTG)和突变频率(MF).结果:Ames试验结果为阴性,而小鼠淋巴瘤试验显示单味马兜铃具有一定细胞毒性并诱导tk基因突变,产生突变集落;而复方龙胆泻肝丸未诱发tk基因突变.结论:受试的单味马兜铃具有一定的遗传毒而复方龙胆泻肝丸具有对马兜铃的减毒效应.     

小鼠淋巴瘤L5178Y细胞tk基因自发分子突变研究

背景与目的:研究小鼠淋巴瘤L5178Y3.2.7c-tk /-细胞tk基因的自发突变频率和分子突变。材料与方法:进行4次平行试验,计算自发突变频率。选择tk基因自发突变子(tk-/-),提取基因组DNA,经等位基因特异性PCR扩增,杂合性缺失(Lossofheterozygosity,LOH)分析和测序等技术,分析其分子突变谱。结果:L5178Y细胞tk基因的平均自发突变频率为145×10-6,tk基因自发突变LOH平均发生率为79.8%。由LOH分析的试验结果显示,自发突变的LOH在大集落(Largeclone,LC)与小集落(Smallclone,SC)之间差异无统计学意义。序列分析证实,自发tk基因点突变主要为碱基置换。结论:tk基因的自发突变是以功能性等位基因缺失为主的分子突变,其中点突变以碱基置换为主。     

丙烯酸-2-乙基己酯的遗传毒性研究

目的： 检测丙烯酸-2-乙基己酯的遗传毒性,为其安全性评价提供资料。方法：采用鼠伤寒沙门菌回复突变试验 (Ames试验),小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验和小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验检测丙烯酸-2-乙基己酯的遗传毒性。Ames试验设每皿0.08、0.4、2.0、10.0和50.0 μL剂量组,另设空白、溶剂、阳性对照;微核试验设350、700和1 400 mg/kg剂量组,另设溶剂、阳性对照;TK基因突变试验设12.5、25、50和100 μmol/L剂量组,另设溶剂、阳性对照。 结果：Ames试验中,加或不加S9的情况下,丙烯酸-2-乙基己酯对TA97、TA98、TA100和TA102菌株均显示致突变作用。微核试验中,雌雄鼠微核率均呈现剂量-反应关系;雄鼠高剂量组微核率与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05);雌鼠各剂量组微核率与溶剂对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。TK基因突变试验中高剂量组突变频率与对照组比较,差异具统计学意义(P<0.05)。结论：在本实验条件下,Ames试验和TK基因突变试验均显示阳性结果,微核试验显示可疑阳性。丙烯酸-2-乙基己酯遗传毒性需结合其他检测系统综合评定。     

烯啶虫胺的致突变性试验

目的：研究烯啶虫胺的致突变性,为其安全生产和使用提供参考依据。方法：采用小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、Ames试验、中国地鼠肺细胞（CHL）染色体畸变试验和小鼠淋巴瘤细胞L5178YTK基因突变试验检测烯啶虫胺的致突变性。结果：烯啶虫胺未引起骨髓嗜多染红细胞微核率的异常增高（P〉0.05）;在直接作用或代谢活化条件下,鼠伤寒沙门氏菌TA97、TA98、TA100、TA102各剂量组回复突变菌落数均未超过自发回变菌落数的2倍;烯啶虫胺各剂量组的CHL细胞染色体畸变率和L5178Y细胞TK基因突变频率,与阴性对照组比较,其差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论：在本试验条件下,未发现烯啶虫胺有致突变性。     

大黄素和大黄酸的体外遗传毒性评价

目的：评价大黄素和大黄酸的体外遗传毒性。方法：使用不同浓度的大黄素和大黄酸（均分别为20、40、80、120μg/ml）处理人的类淋巴母细胞WTK1后,进行彗星实验、体外微核试验和TK基因突变试验。并设溶剂对照组和甲基甲烷磺酸（mthylmethane sulfonate,MMS）阳性对照组。结果：大黄素80和120μg/ml剂量组TK基因突变频率、细胞拖尾率及平均尾长均增高（P〈0.05）;大黄酸120μg/ml剂量组TK位点总突变频率增高（P〈0.05）。结论：在本实验条件下,大黄素和大黄酸均表现出弱致突变作用。     

基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法的建立

目的：建立基于人成淋巴TK6细胞的体外磷脂酰肌醇聚糖A类（PIG-A）基因突变试验方法,研究甲基磺酸乙酯（EMS）与苯并芘（B[a]P）诱导TK6细胞PIG-A基因突变的能力,并探讨该方法用于药物开发初期遗传毒性筛选和评价的前景。方法：通过免疫磁珠分离清除TK6细胞株中预先存在的GPI （-）细胞（即PIG-A基因突变细胞）,然后连续40 d测定正常传代培养TK6细胞PIG-A基因的自发突变率。设不添加体外代谢活化系统长时处理组（24 h-S9）和添加体外代谢活化系统短时处理组（4 h+S9）,并分别采用3个不同浓度50、75、100 μmol/L的EMS和4、8、16 μmol/L的B[a]P处理TK6细胞10 d,在第11天收获细胞。使用CD19、CD55、CD59抗体和核酸染料7-AAD对细胞进行标记,然后用流式细胞仪分析CD19阳性细胞中,CD55和CD59表达阴性的细胞频率。结果：经过免疫磁珠分离,TK6细胞中预先存在的PIG-A基因突变细胞频率降低至2.5×10^-5。连续测定40 d TK6细胞的PIG-A基因自发突变率,计算得到其自发突变率为5.04×10^-7个/d。与阴性对照组比较,不同浓度EMS和B[a]P诱导产生的PIG-A基因突变细胞比例均呈剂量依赖性增加,并超过阴性对照组的2倍以上。结论：本研究初步建立了基于TK6细胞的体外PIG-A基因突变检测方法。该方法成本较低,简便、快速,具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。     

二溴乙腈对L5178Y细胞的遗传毒性及促凋亡作用

目的:研究饮用水中消毒副产物二溴乙腈对小鼠淋巴瘤L5178Y细胞的遗传毒性及促凋亡作用。方法:以L5178Y细胞为靶细胞,采用胞质分裂阻滞微核组学法(CBMN-cyt)和流式细胞术(FCM)分别检测不同浓度(0.1、1、5和10μmol/L)二溴乙腈对L5178Y细胞的遗传毒性及凋亡诱导作用。结果:与阴性对照比较,1和5μmol/L二溴乙腈染毒L5178Y细胞的微核率显著升高(P<0.05);1和10μmol/L二溴乙腈染毒L5178Y细胞的核质桥率显著升高(P<0.05);10μmol/L二溴乙腈染毒L5178Y细胞的核芽率升高(P<0.05);5和10μmol/L二溴乙腈染毒L5178Y细胞的核分裂指数率显著下降(P<0.05)。二溴乙腈各剂量组L5178Y细胞凋亡率均明显高于对照组,差异均具有统计学意义(P均<0.05)。结论:二溴乙腈可致L5178Y细胞遗传毒性并诱导其凋亡。     

用TK基因和HGPRT基因突变试验检测人参皂甙Re的抗诱变性

背景与目的： 用TK基因和HGPRT基因突变试验评价人参皂甙Re的抗诱变性,为其进一步的开发利用提供资料。 材料与方法： 设人参皂甙Re 12.5、25、50、100 μg/ml分别与致突变物甲基磺酸甲酯(MMS)5 μg/ml 同时处理TK6细胞的实验组,同时设溶剂对照组(1％ DMSO),阳性诱变对照组(MMS 5 μg/ml)和抗诱变阳性对照组(VitC＋MMS),各组处理TK细胞4 h后,采用微孔板法检测TK和HGPRT两个位点的突变频率。 结果： 随着剂量的增加,人参皂甙Re拮抗MMS诱变性的作用增大,表现在TK和HGPRT两个位点突变频率均较阳性诱变对照组降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。 结论： 人参皂甙Re具有拮抗MMS诱导的TK基因和HGPRT基因突变的作用;TK基因突变试验比HGPRT基因突变试验更为敏感。     

芦荟大黄素及芦荟提取物的诱变性和抗诱变性

目的:用L5178Y小鼠淋巴瘤细胞体外微核试验评价芦荟大黄素和芦荟提取物的诱变和抗诱变作用,为其安全性评价提供依据。方法:设溶剂对照、阳性对照和抗诱变对照,芦荟大黄素和芦荟提取物诱变和抗诱变试验各设4个剂量组,处理L5178Y细胞12 h后按常规方法进行体外微核试验分析。结果:较高浓度(6.67μg/ml)的芦荟大黄素可致微核细胞率增加,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.05);而芦荟提取物未见此效应。在一定剂量范围内,芦荟大黄素(0.22～6μg/ml)和芦荟提取物(20～180μg/ml)对甲磺酸甲酯(MMS)所致微核细胞率均有一定程度的拮抗作用,与对照组比较,差异有统计学意义(P0.01)。结论:芦荟大黄素具有一定的诱变作用,而在本实验剂量范围内的芦荟提取物未见遗传毒性。两种受试物在一定范围内均能较好地拮抗MMS所致的染色体损伤。     

淫羊藿水提取物的食用安全性研究

背景与目的:淫羊藿是一种传统的中药材,但是其安全性毒理学的资料相对缺乏,故我们对其安全性进行评价,以便为淫洋霍的综合利用提供依据。材料与方法:运用急性毒性试验、细胞毒性试验、遗传毒性试验(包括小鼠骨髓微核实验、Ames实验和TK基因突变实验)对淫羊藿进行了较系统的安全性评价。结果:淫羊藿的半数致死剂量(LD50)大于80g/kg,对中国仓鼠卵巢细胞CHO和中国仓鼠肺细胞CHL的半数致死浓度(IC50)分别为55.4mg/ml和19.53mg/ml,并且小鼠骨髓微核实验、Ames实验、TK基因突变实验的结果均为阴性。结论:淫羊藿属无毒物质,在较高剂量下对CHO和CHL均表现出一定的细胞毒性,本试验条件下无致基因突变和染色体畸变作用。     

不同焦油释放量卷烟诱导TK基因突变能力的比较研究

目的：研究卷烟烟气冷凝物对TK基因的致突变作用,并比较不同焦油释放量卷烟样品的TK基因致突变能力。方法：以盒标焦油为5、8和11 mg的市售卷烟（分别为1、2和3号样品）烟气冷凝物为受试物,分别以20、40、60、80、100、150 μg/mL的卷烟烟气冷凝物对小鼠淋巴瘤细胞L5178Y tk^+/-3.7.2C进行染毒处理,以15 μL/mL的二甲基亚砜为溶剂对照,3 μg/mL的环磷酰胺为阳性对照,处理3 h,细胞洗涤重新接种培养2 d,加入三氟胸苷继续培养12 d后,计数有突变集落生长的孔数,计算各样品剂量组的三氟胸苷抗性突变频率,并比较不同样品的致突变强度。结果：1号样品在剂量为150 μg/mL时、2号样品和3号样品在剂量为100 μg/mL时,小鼠淋巴瘤细胞三氟胸苷抗性突变频率是溶剂对照组3倍以上,并且随着卷烟烟气冷凝物剂量的增加,三氟胸苷抗性突变频率呈上升趋势,呈现明显的剂量-反应关系,3种卷烟样品的TK基因致突变强度分别为0.37、0.36和0.38。结论：3种卷烟样品的烟气冷凝物均对小鼠淋巴瘤细胞表现出TK基因致突变作用,比较3种样品的致突变强度发现,卷烟烟气的致突变强度与焦油释放量无明显相关关系。