大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库.方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre 菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库.分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因.结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性.结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体.     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

抗地高辛人源小分子抗体的获取

目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体,并构建双体抗体.方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性,对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的克隆进行改造,构建双体抗体.结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因,阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第一亚群,重链分别属于第三和第四亚群.选取4号克隆进行基因改造,构建双体抗体表达载体,获得了活性较好的双体抗体.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的双体抗体,可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体.     

人源抗HBsAg噬菌体抗体的筛选、鉴定及基因序列分析

目的筛选与鉴定人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)噬菌体抗体,并对其进行基因序列分析。方法利用噬菌体表面递呈技术,从人的外周淋巴细胞中分离和扩增抗体基因,构建抗体组合文库,经亲和淘洗从该文库中筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体,通过ELISA及竞争抑制实验鉴定其活性和特异性,并分析获得的抗HBsAg人源抗体重链和轻链基因序列。结果从第3轮淘洗洗脱下来的噬菌体感染细菌长出的菌落中挑出30个,进行ELISA检测,取A490值最高(1.47±0.08)的一株进行竞争抑制试验,结果A490为0.35±0.10,抑制率为76%,所筛出的噬菌体抗体为HBsAg的特异性抗体,酶切分析显示其包含重链和轻链基因,序列分析表明重链可变区(VH)属人免疫球蛋白VHⅠ亚群,轻链可变区(VL)属于VκⅠ和VκⅢ亚群。结论从所构建的抗体库中,筛选出能特异结合HBsAg的抗HBsAg噬菌体抗体,说明通过噬菌体抗体库筛选人源抗HBsAg噬菌体抗体在技术上是可行的,这为抗HBsAg基因工程抗体的应用以及设计针对乙型肝炎的新型靶向治疗策略奠定了基础。     

全合成人源性噬菌体抗体库的构建

目的:构建全合成人源性噬菌体抗体库。方法:选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成,同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因。然后利用限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体。连接后的重组噬粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌TG1,构建抗体库。结果与结论:PCR结果显示,通过优化后的方法能在保证抗体库多样性的前提下,高效地获得抗体基因。经过数十次电击转化构建了库容量为2×109的全合成抗体库,菌落PCR、测序及筛选结果表明,抗体库质量优良,为筛选人源性治疗抗体奠定了基础。     

抗人红细胞单链抗体基因的克隆与表达

目的：获得抗人红细胞单链抗体（single-chain antibody,ScFv)基因,并在大肠杆菌中表达具有能与人红细胞特异性结合的ScFv。方法：以从分泌抗人红细胞单克隆抗体细胞株中提取细胞的总RNA为模板,利用扩增鼠源性抗体可变区基因的通用引物,通用RT－PCR分别获得轻链（VL）、重链（VH）可变区基因,并通过15个氨基酸的加接肽（Gly4Ser)3按VL－接头－VH的顺序连接起来,组建成ScFv基因。结果：核苷酸序列分析证明,获得的单链抗体基因VH基因属于小鼠抗体重链可变区基因家族的V（A）组,VL基因属于小鼠抗体k轻链可变区基因家族的IV组。与PGEX－5X－3表达载体上的GST融合蛋白表达后,在相对分子质量54000有一明显的空载体对照没有的蛋白带（ScFv28000,GST26000）。间接免疫荧光证明该表达产物能与人红细胞特异性结合。结论：获得抗人红细胞ScFv基因和具有抗体活性的抗人红细胞ScFv,为建立患者自身红细胞凝集试验奠定了基础。     

人源性抗丙型肝炎病毒核糖体展示单链抗体库的构建

核糖体展示抗体库技术是制备人源性单链抗体的良好技术平台,该技术将表型与基因型相联系,可以从构建的抗体库中筛选到高亲和力的抗体,同时可找到编码此抗体的基因.本实验从丙型肝炎病毒(HCV)阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建了大容量的人源性核糖体展示scFv,文库,为获得特异的人源性抗HCv scFv奠定了基础.     

轻链替换文库对抗HBs基因工程Fab抗体亲和力的影响

目的测定轻链替换文库对基因工程Fab抗体的亲和力的影响。方法将PCR扩增的人抗体轻链基因插入已克隆有人源抗乙肝表面抗原(HBsAg)抗体重链Fd基因的噬菌粒中,构建成轻链替换文库,经亲和淘洗,从该文库中筛选与重链Fd基因相匹配的轻链基因。结果链替换的噬菌体抗体(phab)的ELISA光吸收值(A)从0·43±0·09提高到最高为1·24±0·10。序列分析ELISA光吸收值(A)最高的5株phab的轻链基因,3株κ链的碱基序列基本一致,属VκIII亚群,2株λ链的基因序列相同,属VλⅠ亚群。结论所筛选出来的phab具有抗HBsAg的特异性。     

从半合成噬菌体抗体库筛选抗角蛋白人抗体

目的;从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：经表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体。用ＥＬＩＳＡ和ＤＮＡ指纹分析对所获抗体进行鉴定。结果：经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判定所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

手背深度烧伤早期治疗不当的原因分析

手为暴露部位 ,烧伤机会多 ,约占 4 4 % 〔1〕。临床上以手背烧伤最多见 ,深度烧伤后如果早期治疗不当常造成严重畸形和功能障碍。我科自 1996年以来共收治手背深度烧伤 98例 ,其中 11例因早期治疗不当造成不良后果。现报告如下 :1　临床资料1 1　一般资料　本组 11例 ,男 7例 ,女 4例 ;年龄2 0岁～ 4 8岁。火焰烧伤 7例 ,热液烫伤 4例 ;手背烧伤为深Ⅱ度～Ⅲ度。入院后手部创面均采用暴露疗法 ,涂ＳＤ—ＡＧ液 ,手的姿势任患者自由摆置。 5例手背深Ⅱ度～Ⅲ度烧伤患者于伤后 3周行创面切削痂游离点状植皮术 ;6例手背深Ⅱ度烧伤患者任其自然…     

毛细支气管炎免疫机理及干扰素疗效研究

本文测定50例毛细支气管炎患儿T淋巴细胞亚群,同时观察干扰素(INF)治疗前后的变化并判定临床疗效,结果表明急性期呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿CD_8细胞明显升高,CD_4/CD_8比值明显降低(P<0.01),CD_3、CD_4细胞与正常对照组比较无明显差异(P>0.05);INF治疗后CD_8细胞显著降低,CD_4/CD_8比值明显升高(P<0.01);且临床疗效及病程均明显优于未用INF组。作者对本病发病机理及INF作用机制进行了讨论。     

大规模猪肝细胞低温保存方法的建立

目的　建立大规模猪肝细胞的低温保存方法以满足生物型人工肝治疗的需要。方法　用酶法从中国实验用小型猪肝脏分离出猪肝细胞 ;加入本实验室配制的含有 10 %二甲基亚砜 (dimethylsulfoxide,DMSO)的营养液中 ;分别采用两种降温方法使 (12 )× 10 10 猪肝细胞保存在 - 196℃液氮中 ;1个月后复温 ,观察在同一条件下培养不同时间后猪肝细胞形态、存活率和白蛋白、尿素、葡萄糖合成功能及对利多卡因的转化功能。结果　用两种降温方法保存的肝细胞 ,复温后细胞的存活率均较高 (梯度降温组和程控降温组存活率分别较冻存前降低了 4 7%和 8 6 %) ,其中前者肝细胞的尿素、葡萄糖合成功能较后者高。结论　所建立的冻存方法简单易行 ,可保存大量的猪肝细胞。     

八种动物甲状腺组织几何学参数的定量分析(一)

用图象分析仪测定了8种动物甲状腺随机切片的显微照片(经涂墨加工),获得了该组织胶体的二维平面的图象数据。根据体视学原理计算了与胶体有关的几何学参数值,包括体积密度、表面积密度、平均自由程、数密度、平均体积、平均表面积、平均半径以及三维空间截线平均长度。结合对滤泡上皮细胞高、宽的测量结果,进一步计算了与滤泡有关的上述参数值。分析表明,甲状腺对碘的代谢功能与表征胶体结构的5项参数值显著相关。综合胶体的8项参数,各类动物可构成各自的种系星座图;分类判别有很高的正确判别率。     

胰腺囊性肿瘤15例分析

作者报告了该院３０年来经手术及病理证实的１５例胰腺囊性肿瘤，男５例，女１０例，其中囊腺瘤３例，囊腺瘤恶变３例，囊朱癌９例，肿瘤位于胰尾部８例，体尾部６例，胰头部１例。２例有肝转移，１例肿瘤浸润胃后壁，根治生切除１０例，单纯肿瘤切除、肿瘤切除加肝转移瘤局部切除、囊腺癌内外引流、肿瘤活检各１例。术后死亡１例。随访１２例，１０例效果满意，２例囊腺癌行内外引流者术后６、９个月死亡。文中讨论了胰腺囊性肿瘤的     

益欣康泰胶囊对老龄小鼠体内睾酮水平的影响

目的：研究益欣康泰胶囊对老龄小鼠体内睾酮的影响。方法：选用昆明种雄性小鼠５０只,随机分为五组,即对照组,阳性药物组及益欣康泰胶囊高,中,低剂量组,分别灌服蒸馏水,红参水煎液及益欣康泰胶囊高,中低,剂量的水溶液,于第１０天时统一在颈动脉取血做Ｔ测定;结果：红参组及益欣康泰胶囊三组与对照组比较,灌服益欣康泰胶囊后Ｔ含量明显升高,益欣康泰胶囊高剂量组与红参组比较Ｔ明显升高;     

结肠息肉癌变相关因素分析

目的　更好地认识癌变息肉的临床特点 ,找出与癌变息肉相关的因素 ,为临床初步判断息肉的性质提供依据。方法　回顾整理连续 4年内资料完整可用的结肠息肉病例 ,分析性别、年龄、息肉部位、数目、是否有蒂、黏膜情况、是否分叶、病理类型、息肉大小、不典型增生程度等因素。结果　单因素分析显示癌变与未癌变息肉在大小、黏膜情况、不典型增生程度、病理类型、是否分叶状等因素方面的差别具有统计学意义。逐步Logistic分析显示与癌变息肉独立相关的因素包括息肉大小、不典型增生程度、黏膜情况、是否有蒂及病理类型。结论　息肉越大、病理为腺瘤、不典型增生程度越重、黏膜有糜烂甚至溃疡、亚蒂或无蒂是与癌变息肉独立相关的因素 ,以上因素符合的越多则该息肉为恶性的可能性越大     

Ⅲ级胎盘亚分级的显微结构观察及体视学分析

目的:探讨Ⅲ级胎盘超声亚分级显微结构改变。方法:利用光镜观察各亚级胎盘的组织显微结构形念变化,并用体视学方法进行组织计量学分析。运用电子显微镜观察各亚级胎盘的组织超微结构形态变化。结果:两组胎盘显微结构形态学上有明显变化,组织计量学分析发现血管合体膜数、合体结节数、纤维素样坏死、绒毛间隙距离、绒毛血管直径等指标两组胎盘有非常显著差异,P<0.01。结论:ⅢA亚级胎盘和ⅢB亚级胎盘在组织学改变方面有明显差异,Ⅲ级胎盘超声亚分级有足够的组织学依据支持。     

Semmes-Weinstein单丝检测糖尿病足部神经感觉的应用研究

应用５．０７／１０ｇ Ｓｅｍｍｅｓ－Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ Ｍｏｎｏｆｉｌａｍｅｎｔ（单丝）随机检测１３２例糖尿病患者右足５个部位的感觉,结合足部震颤阈值分析研究每个单丝的敏感性和特异性。同时应用弯曲力分别为５ｇ和１５ｇ的单丝随机对２００例糖尿病患者右足５个部位进行检测。     

慢性肝炎213例临床病理分类探讨

应用传统分类及法Ｓｃｈｅｕｅｒ分类法观察２１３例慢性肝炎的肝穿病理切片，共２６０例次，结果显示Ｓｃｈｅｕｅｒ分类法与传统分类基本一致。但对反映病