全合成人源性噬菌体抗体库的构建

目的:构建全合成人源性噬菌体抗体库。方法:选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成,同时人工设计合成半随机CDR3,通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因。然后利用限制性内切酶SfiⅠ、NotⅠ分别双酶切抗体基因和噬菌体展示载体。连接后的重组噬粒通过电击转化的方法转入大肠杆菌TG1,构建抗体库。结果与结论:PCR结果显示,通过优化后的方法能在保证抗体库多样性的前提下,高效地获得抗体基因。经过数十次电击转化构建了库容量为2×109的全合成抗体库,菌落PCR、测序及筛选结果表明,抗体库质量优良,为筛选人源性治疗抗体奠定了基础。     

人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库的构建

目的 构建人源性抗核抗体(ANA)Fab片段噬菌体抗体库.方法 从4名ANA滴度大于1∶10 000的自身免疫病患者外周血淋巴细胞中抽提总RNA,用RT-PCR技术扩增免疫球蛋白分子轻链κ、λ基因及重链Fd基因.将轻链基因片段克隆入pComb3Hss载体以构建轻链文库,随后将重链基因载入κ/λ-pComb3Hss载体,形成κ/λ-Fd-pComb3Hss质粒,然后将重组质粒转化大肠杆菌XL1-Blue.用辅助噬菌体M13 KO7感染XL1-Blue,随机的重组抗体文库即表达于丝状噬菌体表面.结果 扩增了长度为660bp的轻链κ、λ基因及重链Fd基因,并成功构建了库容为2×104的轻链基因抗体库和库容为4×104的人Fab抗体库,获得了噬菌体滴度为2×109CFU/ml的富含人源性抗核抗体Fab片段的噬菌体抗体库.结论 成功构建了人源性抗核抗体Fab片段噬菌体抗体库,为人源性抗核抗体Fab片段的制备以及进一步评价其在肿瘤免疫靶向治疗中的作用奠定了基础.     

从人源大容量噬菌体抗体库中筛选抗生存素抗体

目的从大容量天然噬菌体抗体库中筛选抗生存素(survivin)的人源单链抗体(single chainfragment variable,scFv)并进行鉴定。方法以survivin为抗原,固化在抗原管上,通过吸附—洗脱—扩增过程,从大容量天然噬菌体抗体库中筛选特异性噬菌体抗体,并转染HB2151菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导制备成可溶性抗体,采用酶联免疫吸附测定法对其抗原结合活性进行检测,指纹图谱分析法分析抗体基因的种类。结果经过4轮筛选,共获得21个与survivin结合的阳性克隆,其中10个特异性结合的克隆,指纹分析有8种不同的抗survivin的scFv基因,在这8种中有5种获得可溶性表达。结论利用噬菌体抗体库技术获得了特异性的人源抗生存素抗体,为其在今后肿瘤治疗中的应用奠定基础。     

从半合成噬菌体抗体库筛选抗角蛋白人抗体

目的;从半合成噬菌体抗体库中筛选人源性抗角蛋白抗体并进行鉴定。方法：经表皮角蛋白为抗原,通过吸附－洗脱－扩增过程从半合成噬菌体抗体库中筛选特异性抗角蛋白抗体。用ＥＬＩＳＡ和ＤＮＡ指纹分析对所获抗体进行鉴定。结果：经过４轮筛选,获得２０个能与角蛋白结合的阳性克隆,其中可产生特异性抗蛋白抗体的克隆１８个。经ＤＮＡ指纹分析,判定所获克隆分别包含４个不同的Ｆａｂ段基因。     

人源性抗丙型肝炎病毒核糖体展示单链抗体库的构建

核糖体展示抗体库技术是制备人源性单链抗体的良好技术平台,该技术将表型与基因型相联系,可以从构建的抗体库中筛选到高亲和力的抗体,同时可找到编码此抗体的基因.本实验从丙型肝炎病毒(HCV)阳性患者的外周血淋巴细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸PCR技术(gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)构建了大容量的人源性核糖体展示scFv,文库,为获得特异的人源性抗HCv scFv奠定了基础.     

大容量天然噬菌体抗体库的建立及多样性初步验证

目的:构建超大容量天然噬菌体抗体库.方法:从正常人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞(>180份),提取RNA,用RT-PCR分别扩增抗体可变区轻重链基因(VH和VL),通过重叠PCR技术将VH和VL连接为单链抗体ScFv形式,克隆插入到pDF噬菌粒载体,转化XL1-Blue细菌得到ScFv初级抗体库,并以高感染复数(MOI≥100)感染Cre 菌株BS1365,利用Cre/LoxP位点特异性重组原理,使VH和VL基因定向同源重组匹配,随后以低感染复数(MOI<1)感染XL1-Blue,获取次级工作库.分别用5种不同抗原进行筛选,所获阳性克隆送测序以获取抗体基因.结果:抗体V区基因得到有效扩增,初级库库容3.6×107,工作库容1.8×1011,5种不同抗原筛选均得到特异性结合噬菌体抗体;测序结果表明,所获取抗体涵盖了不同的基因亚群,进一步证明抗体库具有良好的多样性.结论:经Cre/Loxp定位重组系统成功构建了超大容量天然噬菌体抗体库,初步尝试对5种抗原进行筛选均获成功,提示该抗体库多样性较好,可用于制备人源抗体.     

大肠癌噬菌体抗体库的构建及抗CEA抗体的筛选

目的构建及初步鉴定大肠癌噬菌体抗体Fab呈现库,筛选人CEA单克隆抗体,并进行序列分析。方法分离大肠癌患者外周血淋巴细胞,提取淋巴细胞总RNA,逆转录成cDNA。用PCR扩增人全套抗体基因片段,克隆于pComb3载体,再经电穿孔转化大肠杆菌XL1-Blue菌株,形成噬菌体抗体库。以固相化CEA抗原淘筛抗体库,ELISA鉴定噬菌体抗体。其中一个阳性克隆进行测序。结果逆转录PCR分别扩增出约680bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接转化,成功地构建了人源性Fab抗体基因库,库容量达2.1×107,Fab基因重组率为50%。以单抗捕获的CEA抗原淘洗4轮,出现特异性富集,阳性克隆经直接ELISA和交叉反应ELISA实验证实具有良好的抗CEA抗原特异性。DNA测序表明该抗体重链属IgG亚类并含有一条IgL亚类的轻链。结论成功构建了大肠癌患者自然致敏抗体Fab段噬菌体呈现库,从中获得可与CEA抗原结合的噬菌体抗体,由此为大肠癌早期诊断及基因治疗提供了一种新的思路和方法。     

抗体库技术中辅助噬菌体的研究进展

噬菌体抗体库作为噬菌体展示和抗体库2种技术的集合体,可以不需经过免疫而直接获取各种人源抗体,目前已广泛应用于生物学及医学等领域.在通常使用的噬菌粒系统中,使用野生型辅助噬菌体会导致"噬菌体污染",使得仅有很少部分子代噬菌体带有抗体片段,这对抗体库的筛选工作非常不利.近年来,研究人员通过对噬菌体衣壳蛋白基因(g3)部分缺失、引入琥珀突变、构建新型辅助噬菌体或辅助质粒等策略,不仅有效避免了辅助噬菌体污染问题,使抗体展示效率提高了5～20倍,进而通过增加单价抗体展示在每个噬菌体表面,使抗原结合能力提高400倍,并且在第二轮筛选中即可得到有效富集(阳性克隆率超过50%).本文综述了近年来应用在噬菌体抗体库的一些新型的辅助感染系统.     

抗地高辛人源小分子抗体的获取

目的 从大容量噬菌体抗体库中筛选人源性抗地高辛抗体,并构建双体抗体.方法 以固相化的地高辛对构建的大容量噬菌体抗体库进行筛选,3～4轮后挑取克隆用酶联免疫吸附测定方法鉴定其特异性,对抗地高辛阳性抗体克隆进行DNA指纹分析及测序分析.选取活性好的克隆进行改造,构建双体抗体.结果 在抗体库的筛选过程中可见到明显的富集现象,获得了4株可与地高辛特异性结合的人源抗体,经DNA指纹分析及测序分析证明为不同克隆基因,阳性克隆的可变区基因轻链均属于λ第一亚群,重链分别属于第三和第四亚群.选取4号克隆进行基因改造,构建双体抗体表达载体,获得了活性较好的双体抗体.结论 利用噬菌体抗体技术获得了人源性抗地高辛抗体,并改造成应用前景较好的双体抗体,可能为临床诊断及治疗洋地黄类药物中毒提供具有实用价值的人源抗体.     

噬菌体抗体库技术的研究进展

噬菌体抗体库（ｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｙ）是将人抗体基因与噬菌粒载体相连，在细菌体内表达而制备人全套抗体（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）。利用抗体库技术可制备人源单克隆抗体，这是目前生物技术领域中的一项重要的新技术。该文综述了其产生，发展和前景。     

人源性大肠癌cDNA噬菌体库的构建及PCR鉴定

为构建人源性大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,从人大肠癌组织中提取总RNA ,纯化mRNA ,用RT PCR反转录合成cDNA第一链 ,用LD PCR合成cDNA第二链 ,除去小于 5 0 0bp的小片段 ,与λTriplEx2噬菌体连接 ,体外包装。转化E .coliXL1 blue大肠杆菌 ,滴定文库的滴度 ,用IPTG和X gal测定重组率。用PCR鉴定插入cDNA片段大小。构建成含 2 .0 7× 10 6 pfu/ml重组子的人大肠癌cDNA噬菌体表达文库 ,重组率为 94.5 % ,插入外源cDNA片段大小从 60 0bp～ 4kb ,平均约 1.4kb。文库合符要求 ,适合于大批量筛选cDNA克隆的大肠癌相关抗原基因     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

采用噬菌体表面展示技术，以重组的HCV结构蛋白E2为固相包被抗原，从半合成的噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，获得抗原行异性和结合活性较强的HCV E2人源单链可变区抗体（ScFv)片段，片段为771bp,阳性克隆，对其进行免疫学检测，并对HCV E2特异性ScFv的编码基因序列进行测定分析。结果筛选得到的HCV E2 ScFv片段（771bp)具有结合HCV E2抗原的生物学活性和特异性。     

应用噬菌体表面展示技术筛选丙型肝炎病毒核心蛋白抗原模拟表位

为筛选丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（core)特异性噬菌体12肽模拟表位，应用噬菌体表面展示技术，以抗－HCV核心蛋白抗原的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工化学合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程，随机挑取50个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定，并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV核心抗原的模拟表位。经免疫学鉴定后，从随机筛选的50个克隆中确定10个阳性克隆，进行DNA序列测定，确定氨基酸序列XRQXXPXXXHXX为HCV核心的模拟表位。本实验为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

X线对脑胶质瘤细胞系增殖的影响

为探讨不同Ｘ线处理对脑胶质瘤细胞增殖的影响，选用人脑星形细胞瘤ＳＷＯ－３８系，采用ＭＴＴ法观察Ｘ线对胶质瘤细胞生长的影响，ＡＢＣ法检测增殖细胞核抗原（ＰＣＮＡ）基因表达的变化。结果显示：①不同剂量（５，１０，１５，２０，２５Ｇｙ）Ｘ线对胶质瘤细胞生长具有明显的抑制作用，生长曲线低平，照射后４８ｈ的抑制率分别为３３％、４７％、５１％、５８％和６６％；②不同剂量率（８０，１６０，２４０，３２０，４００ｃＧｙ／ｍｉｎ）Ｘ线照射后４８ｈ的抑制率分别为５８％、５４％、４７％、２５％和３０％；③超分割照射后４８ｈ的抑制率为６２％，而单次照射组为５０％；④不同剂量（５，１０，１５，２０，２５Ｇｙ）Ｘ线照射后ＰＣＮＡ－标记率（ＬＩ）分别为９１％，８７％，８１％，７８％，６９％，ＰＣＮＡ－ＬＩ与存活细胞ＯＤ值呈显著性正相关关系（Ｐ＜０．０５）。说明①ＳＷＯ细胞生长曲线、抑制率与Ｘ线剂量、剂量率和照射方式之间密切相关；②ＰＣＮＡ－ＬＩ与存活细胞ＯＤ值呈正相关关系，ＰＣＮＡ是胶质瘤细胞增殖的标志之一。     

单链抗体的研究进展

抗体技术由细胞工程抗体(杂交瘤-单克隆抗体)发展到基因工程抗体,尤其是抗体库技术的出现,将抗体工程发展到了一个新阶段。本文从抗体库技术等方面介绍单链抗体(single-chain Fv antibody,sc Fv)的进展情况。     

人脑胶质瘤Tenascin和CD34表达与患者预后的相关性

为了探讨和评估Tenascin和CD34表达与人脑胶质瘤侵袭和预后的相关性，采用免疫组织化学和原位杂交方法，对35例不同级别人脑胶质瘤组织的Tenascin及CD34表达进行检测，并根据患者术后随访结果进行相关性分析。结果显示，不同病理级别的胶质瘤胞浆内Tensacin表达或微血管密度（MVD）具差异有显著性意义，随肿瘤病理级别增高，Tenascin表达和MVD密度越高，两者有显著相关性（P＜0．01）。Kaplan-Meier生存曲线表明，Tenascin表达或MVD密度与人脑胶质瘤患者预后呈显著相关，高表达Tenascin且血管密度较高的患者预后较差。提示Tenascin及CD34与胶质瘤的侵袭性生长有关，检测两者对判断肿瘤患者预后有重要参考价值。     

腺病毒介导PTEN和TIMP-2抑制胶质瘤U87体外侵袭力的研究

目的　探讨腺病毒介导PTEN和TIMP 2对人脑胶质瘤细胞体外侵袭力的抑制作用。方法　用含PTEN和TIMP 2基因的重组腺病毒载体体外转染人胶质瘤细胞系U87,用RT PCR、Westernblot检测目的基因与蛋白表达。通过Boyden小室法检测U87转染前后细胞体外侵袭力的变化 ,同时采用胶原酶谱法分析MMP 2、MMP 9酶的相对活性。结果　转染AdPTEN、AdTIMP 2后U87细胞中目的基因与蛋白的表达上调 ,U87、AdX gal、AdPTEN、AdTIMP 2和PTEN TIMP 2的侵袭细胞数分别为 5 5 6 4± 13 2 7、4 8 2 6± 14 75、35 2 7± 10 94、2 7 38± 12 81和 19 16± 5 4 5 ,转染靶基因后U87细胞的体外侵袭力受到明显抑制 ,联合转染后侵袭力的抑制更明显 ,这与MMP的改变并不完全一致。结论　重组腺病毒载体介导的PTEN与TIMP 2联合基因治疗可能是抗胶质瘤侵袭的一个有用方法     

外源性PTEN基因稳定转染对SHG44细胞周期和增殖的影响

以PTEN基因真核表达载体体外转染SHG44细胞,筛选稳定转染的细胞克隆并扩增培养,以原位杂交、免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况,并研究了PTEN基因对胶质瘤细胞周期、超微结构、生长速率等特性的影响,观察导入人PTEN基因对SHG44细胞裸鼠致瘤能力的影响。结果表明,稳定转染PTEN基因的SHG44胶质瘤细胞中PTEN基因和蛋白均稳定表达,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生抑制,细胞超微结构有退行性改变,细胞增殖活性及裸鼠致瘤能力显著降低。提示转染外源性PTEN基因可阻止SHG44胶质瘤细胞由G1期进入S期,并抑制肿瘤细胞增殖。     

间接血凝法检测抗Sm抗体和抗RNP

应用间接血凝法测定抗Sm抗体和抗RNP抗体。对不同疾病的检测结果表明,我们建立的这种方法与免疫电泳法结果无显著性差异(P〉0.05)。对SLE病45例检测抗Sm抗体阳性率为100％,抗RNP抗体阳性率为91％。抗Sm抗体可作为SLE的特异性标志抗体,抗RNP抗体在RA,PSS,DM,MCTD病人中检出,其中MCTD病23例,抗RNP抗体阳性率高达96％,且凝集效价高,可作为此病诊断的重要依据。     

人血管生成素-1基因的克隆及原核、真核表达载体的构建

血管生成素（angiopoietin）是近年来发现的与血管生成、抑制密切相关的分子。为研究其在肿瘤血管生成及转移中的作用，利用PCR技术从人胎盘组织中得到血管生成素-1基因，并亚克隆至pRSET C原核表达载体及pcDNA3.1-V5-HisC真核表达载体，成功地构建了原核及正反义真核表达载体，为下一步研究其对消化道肿瘤血管生成的影响打下了基础。