甲基转移酶抑制剂延长小鼠心脏移植物存活期的作用研究

探讨甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷调控体内幼稚T细胞转化对同种心脏移植物存活期的影响及其机制。将C57BL/6小鼠分为实验与对照2组,实验组每日腹腔注射5-氮杂-2′-脱氧胞苷(0.25mg/kg体质量),对照组接受等体积的二甲亚砜腹腔注射。然后,提取小鼠脾细胞,抗CD3与抗CD28抗体协同共刺激后,检测CD4+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例。以BALB/c小鼠为供鼠,两组C57BL/6小鼠为受鼠,建立腹部异位心脏移植模型,监测两组移植心存活时间,检测受鼠脾细胞中CD4+T细胞凋亡率,观察移植心脏组织病理学变化。结果显示,实验组移植前脾细胞中CD4+Foxp3+T细胞占CD4+T细胞比例为(22.7±2.6)%,明显高于对照组的(12.6±1.1)%,差异有统计学意义(P0.05);实验组移植物存活(22.8±2.8)d,明显长于对照组(8±1.8)d,P0.05);实验组移植后脾细胞中CD4+T细胞凋亡率(11.5±1.22)%,高于对照组的(6.6±0.91)%,差异有统计学意义(P0.05)。实验组移植物淋巴细胞浸润数量少于对照组。以上结果提示甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2′-脱氧胞苷受体腹腔注射可延长同种移植心脏存活期,其机制可能与调控幼稚T细胞转化为CD4+Foxp3+T细胞,诱导CD4+T细胞凋亡有关。     

IL-2协同抗CD45RB抗体调节Treg/Th17细胞的比例并延长小鼠移植皮肤存活时间

目的:研究IL-2在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中对Treg/Th17细胞分化的影响,进一步阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的机制。方法:用免疫磁珠分选C57BL/6小鼠脾脏中的CD4+T细胞,在抗CD45RB抗体与IL-2的作用下培养72小时后,流式检测Treg/Th17细胞的变化。以BALB/c小鼠为供体,C57BL/6小鼠为受体建立同种异基因皮肤移植模型,分别给予抗CD45RB抗体及IL-2等治疗,术后1、3、5、7、9天取受体鼠脾细胞,动态检测Treg/Th17细胞的变化;术后第9天取移植皮肤HE染色观察炎性细胞的浸润情况;观察并记录移植皮肤的存活时间。结果:CD4+T细胞在IL-2联合抗CD45RB抗体的作用下培养72小时后,Treg比例升高,Th17细胞比例下降;IL-2联合抗CD45RB抗体治疗后明显延长小鼠移植皮肤的存活时间。结论:IL-2可以明显增强抗CD45RB抗体诱导免疫耐受的形成,使Treg细胞上调,下调Th17细胞,有利于免疫耐受的形成。     

应用Tail-cuff技术改良小鼠颈部异位心脏移植模型(英文)

背景:小鼠颈部心脏移植模型是研究移植缺血再灌注损伤和排斥反应的理想模型,由于显微血管吻合的技术问题,限制了小鼠颈部异位心脏移植模型在医学研究中的广泛应用。目的:应用 Tail-cuff 技术改良小鼠颈部异位心脏移植模型。方法:选用 Balb/c→Balb/c 小鼠进行同系心脏移植,C57BL/6→Balb/c 小鼠进行同种心脏移植。将 24G 和 22G 静脉内导管制作成带有尾巴的套管(Tail-cuff),在受体血管准备时,Tail-cuff 通过右颈外静脉或右颈总动脉近心端后,用显微血管夹一起固定其近心端和 Tail-cuff 管的尾巴,翻转血管并固定后分别与供心肺动脉主干和升主动脉连接固定。结果与结论:共 36 例次正式实验,12 例次同系移植,24 例次同种移植,移植成功率为100%。应用改良技术后总操作时间和心肌缺血时间分别缩短为(49.6±7.4) min 和(28.8±4.2) min,尤其是血管翻转和与供心连接时间明显缩短。结果提示应用 Tail-cuff 技术建立小鼠颈部异位心脏移植模型显示出一定的优越性,是一种理想的方法。     

B淋巴细胞在抗CD45RB抗体诱导的移植免疫耐受中的作用

 目的: 探讨B淋巴细胞在抗CD45RB抗体诱导的移植免疫耐受中的作用。方法: 抗CD45RB抗体对BALB/c裸鼠进行预处理后制备脾脏单细胞悬液,与BALB/c小鼠T淋巴细胞和C57BL/6小鼠脾细胞混合培养,流式细胞术分析Th1、Th2、Treg和Tm淋巴细胞。以B6.μMT^-/-小鼠为受体、BALB/c小鼠为供体建立皮肤移植模型,移植后向受体鼠腹腔注射抗CD45RB单抗,监测脾淋巴细胞CD3⁺CD45RB^hi细胞比例。在混合淋巴培养过程中加入抗CD45RB单抗,分离B细胞,建立以BALB/c小鼠为供体、B6.μMT^-/-小鼠为受体的心脏移植模型,通过尾静脉注射B细胞给B6.μMT^-/-小鼠,观察受体鼠生存期和B细胞分布。结果: 在裸鼠体内用抗CD45RB抗体处理过的B淋巴细胞,与T淋巴细胞混合培养时,可使Treg和Th2淋巴细胞比例明显升高,Th1淋巴细胞的比例明显下降,Tm细胞无明显变化。在体内B淋巴细胞缺失的情况下,抗CD45RB抗体依然能够降低T细胞表面CD45RB的表达,与对照组B淋巴细胞存在组相比,抗CD45RB抗体对T淋巴细胞表面CD45RB下调更为快速,但最终CD3⁺CD45RB^hi T细胞比例无明显变化。体外抗CD45RB抗体处理过的B淋巴细胞可以延长受体鼠的生存时间。B6.μMT^-/-鼠在接受抗CD45RB抗体处理的B细胞并进行同种异体心脏移植后,B细胞可向胸腺迁移。结论: 在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中,B淋巴细胞可能通过介导各T淋巴细胞亚群比例发挥着重要作用,且在中枢耐受中也起到一定作用,但是仅靠B淋巴细胞无法形成完全耐受。     

供体与受体移植前预处理延长大鼠移植心脏成活时间

目的：用供体品系大鼠皮肤致敏方法及腹腔内异位心脏移植模型研究雷公藤多式供体预处理及供体脾细胞受体胸腹内注射诱导免疫耐受对移植心脏存活影响及二种方法的协同效果。方法：SD大鼠作供体,Wistar大鼠作受体,所有受体在心脏移植前均无用供体皮肤致敏,A组作单纯心脏移植,B组作经供体预处理后的供心移植,C组用供体脾细胞胸腺内注射诱导耐受后作心脏移植,D组考察供受体两种预处理方法的协同效果。结果：各处理组供心存活时间均校对照组明显延长,C,D二组病检见淋巴细胞浸润及心肌坏死明显减轻,但微血管病变较严重。结论：两种方法均能明显延长移植供心成活时间,并有良好的协同效果,经胸腺途径诱导的耐受能明显抑制细胞免疫,但对急性血管排斥没有预防作用。     

供体血管内皮细胞对小鼠-大鼠移植心脏存活时间的影响

目的 探讨供体血管内皮细胞对小鼠-大鼠移植心脏存活时间的影响.方法 分离小鼠血管内皮细胞并于移植前14 d注入大鼠阴茎背静脉2×106细胞/只或联合注射环磷酰胺20 mg/kg·d.异位小鼠-大鼠心脏移植后观察供心存活时间. 结果 成功分离小鼠血管内皮细胞,注射小鼠血管内皮细胞14 d后,移植心脏平均存活时间(10±1.414)min, 组化染色显示供心有IgM、C3沉积,血浆IgM、IgG、C3、C4较未注射血管内皮细胞组明显增高;联合使用环磷酰胺能延长供心成活时间(19.44±2.603 4)min(t=2.880,P ＜ 0.01).结论 外周静脉注射供体血管内皮细胞不能诱导延迟性异种移植排斥反应(DXR)的免疫耐受,却促使发生HAR.联合环磷酰胺可延长供心存活时间.     

CD4~+CD25~+CD127~-T细胞在抗CD45RB抗体诱导免疫耐受中的作用

目的:研究CD4+CD25+CD127-T细胞在抗CD45RB抗体诱导的免疫耐受中所发挥的作用,从而阐明抗CD45RB抗体诱导免疫耐受作用的机制。方法:体内实验建立小鼠异位心脏移植模型,观察抗CD45RB抗体对移植物生存期的影响。体外实验观察抗CD45RB抗体对T细胞增殖抑制能力和对CD4+CD25+CD127-T细胞生成的影响。流式细胞术检测外周血和混合细胞中CD4+CD25+CD127-T细胞百分率,ELISA法检测血清和培养液中IL-2和IL-10含量,Real-TimePCR法检测脾脏和混合细胞中Foxp3基因的表达,移植心脏病理学观察。结果:抗CD45RB抗体显著延长移植物存活时间(P0.01),对ConA刺激引起的T淋巴细胞增殖具有明显的抑制能力(P0.05)。与对照组相比,实验组CD4+CD25+CD127-T细胞百分率和Foxp3 mRNA表达量均明显增加(P0.05),实验组IL-2水平较对照组明显降低(P0.05),但IL-10含量较对照组明显升高(P0.05)。病理结果显示对照组移植心脏出现典型细胞免疫性损伤病理改变,而实验组中几乎无炎性细胞浸润现象。结论:抗CD45RB抗体能显著延长移植物存活时间,其诱导免疫耐受机制与上调CD4+CD25+CD127-T细胞百分率和增加Foxp3 mRNA表达量有关。     

联合阻断共刺激信号对移植免疫耐受的影响

目的:探讨联合阻断共刺激信号对移植免疫耐受的影响.方法:采用野生型BALB/c小鼠作为供体,采用野生型B6小鼠作为受体进行腹部异位小鼠心脏移植.受体接受单独或联合使用抗CD40L抗体(MRl)和抗B7抗体的治疗,以阻断CD28-B7和CD40-CD40L(ligand,配体)共刺激信号.以心脏完全停跳作为排斥反应终结时间,并开腹确认心脏是否停跳.心脏移植后60日对移植物进行HE染色.为确定移植免疫耐受是否具有供体抗原特异性,对接受联合阻断共刺激信号治疗而长期存活的受体实施了第二部分来源(供体来源)及第三部分来源 (C3H来源)的皮肤移植.结果:联合阻断共刺激信号使移植心脏长期存活(>150日),而且组织病理学检查未见慢性排斥反应发生.供体来源的皮肤长期存活(>50日),而第三部分来源的皮肤则很快被排斥.结论:联合阻断共刺激信号CD28-B7与CD40-CD40L可诱导出不伴有慢性排斥反应的供体抗原特异性的移植免疫耐受.     

HSP60及TLR4信号途径在小鼠心脏移植物中的表达及意义

目的:检测HSP60及TLR4信号途径在小鼠心脏移植物中的表达情况,探讨其在心脏移植排斥反应中的作用以及它们之间的关系。方法:建立小鼠颈部心脏移植模型,随机分为2组:对照组(同系移植组),供、受体均为C57BL/6小鼠;实验组(同种异品系移植组),供、受体分别为BALB/c、C57BL/6小鼠。分别于移植后第3d、第7d取小鼠心脏及血液标本,免疫组化及Western blotting检测心脏移植物HSP60、TLR4、MyD88及NF-κB的表达情况,ELISA法检测小鼠血液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)和白细胞介素-12(IL-12)的浓度,病检分析心脏组织形态学改变。结果:实验组心脏移植物HSP60、TLR4、MyD88、NF-κB的表达及TNF-α、IFN-γ、IL-12的浓度明显高于对照组;病理学检查结果显示实验组小鼠在术后第3、7d分别发生轻、重度排斥,对照组无明显排斥现象。结论:心脏移植后HSP60表达增强,可能通过TLR4以MyD88依赖的方式激活TLR4信号途径,从而促进移植排斥反应的发生,调控HSP60及其受体后信号途径可能为抗排斥反应提供新思路。     

大鼠异位心脏移植模型的改进及组织学研究

目的:在Ono模型基础上,建立简单、可靠的大鼠腹腔异位心脏移植模型。方法:以Wister大鼠为供体,SD大鼠为受体,改良建立大鼠腹腔异位心脏移植模型,分为3组:正常Wister大鼠作为对照组;移植后亚急性排斥反应组(术后2周);移植后慢性排斥反应组(术后8周)。分组喂养后按规定时间收获心脏标本进行组织形态学观察。结果:手术成功率为87.5%。其中麻醉过深死亡2例,疑青霉素过敏死亡1例,术中出血过多死亡4例。供心移植吻合时间(24.3±7.6)min,供心冷缺血时间(34.5±8.2)min,腹部触诊移植心脏搏动时间(16.8±7.4)d。组织形态学观察示:移植心脏心肌组织内有大量粒细胞浸润;随着移植后时间延长,CAV逐渐加重,冠脉数量减少,心肌萎缩并心肌纤维化发生。结论:改良Ono模型建立的心脏移植模型具有简单、可靠的优点。收获的移植心脏标本在组织形态学上反映了CAV和心肌纤维化发生、发展的过程,为研究心脏移植后相关疾病提供理想的组织标本。     

大鼠腹腔心脏移植技术的改良

目的 探讨大鼠腹腔心脏移植手术技术的改良。方法 采用Ono创建的大鼠异位心脏移植模型，即将供体心脏主动脉和肺动脉分别与受体腹主动脉和下腔静脉吻合，对手术方法作了部分改进，缩短手术时间和移植心脏缺血时间。结果 50次实验手术成功率88％。结论 新技术的采用降低了大鼠腹腔心脏移植模型的制作难度，手术失败的主要原因是吻合口出血，减少术中出血是保证手术成功的关键，吻合血管时应遵守“宁慢勿漏”的原则。     

小鼠异位心脏移植模型的建立

目的 为方便现代移植免疫学研究，建立了小鼠异位心脏移植模型，为今后的器官移植研究打下基础。方法 以昆明鼠为研究对象，参照Ono法并加以改良，将供体升主动脉、肺动脉与受体腹主动脉和下腔静脉行端侧吻合。结果 正式试验50例，8例在72小时以内死亡，其余42例均长期存活，手术成功率为84％。结论 在熟练掌握显微外科技术的基础上，处理好心脏移植的五个关键步骤，小鼠异位心脏移植模型即可顺利建立。     

改进的小鼠颈部心脏移植模型的制作

目的探制小鼠颈部心脏移植模型手术技术的改进.方法采用供心主动脉与受体颈总动脉侧壁长度相近的切口行端-侧连续吻合的方法进行40次小鼠颈部心脏移植.结果应用该方法使供心总缺血时间缩短至30分钟;7天存活率提高到97%.结论新技术的采用降低了小鼠颈部心脏移植模型制作的难度,是一种简单实用的新方法.     

改进的小鼠颈部心脏移植模型的制作

目的 探制小鼠颈部心脏移植模型手术技术的改进。方法 采用供心主动脉与受体颈总动脉侧壁长度相近的切口行端一侧连续吻合的方法进行４０次小鼠颈部心脏移植。结果 应用该方法使供心总缺血时间缩短至３０分钟；７天存活率提高到９７％。结论 新技术的采用降低了小鼠颈部心脏移植模型制作的难度，是一种简单实用的新方法。     

苏木水提物在同种皮肤移植中诱导免疫耐受的实验研究

目的:探讨苏木水提物在小鼠同种皮肤移植中诱导耐受的作用。方法:C57BL/6和BALB/c小鼠分别为供体和受体,建立皮肤移植模型。实验分为对照组、苏木组、苏木加半量环孢素A(CsA)组、CsA组。术前3d给药,术后逐日观察移植皮片存活情况;术后3、7d时检测脾组织中CD4+ CD25+T细胞数量变化及Foxp3 mRNA表达情况。结果:与对照组比,苏木组、苏木加半量CsA组、CsA组移植皮片存活时间明显延长(P<0.01),移植后3、7d时,CD4 +CD25+T细胞数量及Foxp3的相对表达量显著增多(P<0.05)。结论:苏木水提物可延长同种移植物的存活时间,上调CD4+ CD25+T细胞及Foxp3的活性,有较强的免疫抑制作用,有望用于诱导免疫耐受。     

套管连接法在大鼠心脏腹部移植模型中的应用

目的 采用套管连接血管技术建立大鼠心脏腹部移植模型，减少手术并发症，提高术后存活率。方法 供体为SD大鼠，受体为Wistar大鼠，将供心升主动脉于受体的腹主动脉缝合，供心肺动脉于受体左肾静脉行套管吻合。结果 80次正式实验，手术成功率95%，该方法只需一人操作，手术时间和供心缺血时间缩短，吻合血管通畅，提高手术成功率。结论 该方法为建立大鼠心脏腹部移植的模型提供了一种简单而又实用的新技术。     

胸腺应急修饰诱导大鼠同种心脏移植免疫耐受

目的：与以往术前21天进行胸腺修饰常规方法不同，在手术当天进行胸腺内注射抗原，诱导大鼠同种心脏移植免疫耐受。方法：在大鼠腹腔异位心脏移植模型中，实验组在手术当天将供体SD大鼠脾细胞注射到受体Wistar大鼠胸腺，并以FK506短程处理受体鼠。单纯药物对照组在围手术期使用FK506但不进行胸腺内注射供体脾细胞；经典方法诱导组，腹腔注射抗淋巴细胞血清ALS(-1天) 胸腺内注射供体脾细胞(-21天)；无处理组，单纯将SD大鼠心脏移植到Wistar大鼠腹腔。观察供心存活天数、病理改变及混合淋巴细胞反应等指标的变化。结果：实验组供心存活时间较对照组明显延长，而与经典诱导组比较无统计学差异。实验组和经典诱导组的供受体脾细胞混合淋巴细胞培养各组增殖反应均较元处理组降低，而两者之间无差异。结论：心脏移植手术当日胸腺内注射供体同种抗原，同时给予短程免疫抑制剂与术前21天胸腺注射的经典诱导组同样能诱导宿主对移植物的低反应状态(免疫耐受或免疫抑制)。     

а-MSH基因转染的小鼠同种异体移植心脏存活期延长

目的 观察a-黑素细胞刺激素(a-MSH)基因原位转染供者小鼠心脏对小鼠同种异体心脏移植排斥反应的影响.方法 将携带a-MSH基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因的重组腺相关病毒(rAAV-a-MSH)和单纯携带GFP的重组腺相关病毒(rAAV-GFP)分别经主动脉灌注原位转染供者小鼠心脏,再行同种异体心脏移植,观察心脏移植物的存活时间.测定移植心脏的GMSH表达情况,并于术后7 d测定移植心脏的细胞因子及趋化因子水平.结果 腺相关病毒载体能有效地将a-MSH基因导人小鼠心脏,与rAAV-GFP空载体组[(7.0±0.33)d]和PBS组[(7.0±2.23)d]相比,rAAV.a-MSH原位转染组[(16.3±2.21)d]的心脏移植物存活时间延长.术后7 d,rAAV-a-MSH原位转染组心脏移植物的Thl细胞因子(IL-2、IFN-a)水平较其它两组减低,而Th2细胞因子(IL4、IL-10)水平升高,趋化因子MCP-I、RANTES水平下降.结论 携带a-MSH基因的rAAV载体经原位转染供者小鼠心脏,能促进移植心脏局部的细胞因子格局由Th1型向Th2型偏移,降低趋化因子水平,从而延长同种异基因移植心脏的存活时间.     

组蛋白去乙酰化酶抑制剂对急性移植物抗宿主病模型小鼠CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞的影响

背景:防治移植物抗宿主病,提高移植存活率是异基因造血干细胞移植急待解决的核心问题;因此寻找新的免疫抑制剂成为必要。近期的研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂具有免疫调节作用。目的:通过建立小鼠急性移植物抗宿主病模型,观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA对小鼠急性移植物抗宿主病的影响及免疫调节作用。方法:选择C57BL/6(H-2b)→BALB/C(H-2d)作为完全异基因移植供、受体建立移植物抗宿主病小鼠模型,移植后3,5,7,9,11 d,治疗组小鼠腹腔注射组蛋白去乙酰化酶抑制剂SAHA 35 mg/(kg·次)(0.2 m L),对照组小鼠腹腔注射灭菌水0.2 m L/次,通过流式细胞术、实时定量PCR、病理学等方法,比较两组小鼠的急性移植物抗宿主病临床表现、生存时间及CD4+CD25+Foxp3+细胞百分率。结果与结论:治疗组较对照组小鼠出现急性移植物抗宿主病时间推迟,程度减轻、生存时间延长。治疗组生存率显著高于对照组(P0.05)。移植后治疗组小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+细胞阳性百分率随时间延长呈逐渐递增趋势;反之对照组小鼠外周血CD4+CD25+Foxp3+细胞阳性百分率随时间延长呈逐渐递减趋势(P0.05)。提示SAHA可延迟急性移植物抗宿主病的发生,减轻急性移植物抗宿主病的严重程度,以上作用可能是通过提升CD4+CD25+Foxp3+细胞的比例来实现的。     

蛇毒因子消耗补体对大鼠同种心脏移植急性排斥反应的影响

目的探讨蛇毒因子(CVF)消耗补体对大鼠同种心脏移植急性排斥反应的影响。方法建立Wistar至SD大鼠同种异位心脏移植模型,实验组经静脉注射CVF以消耗受体血清中补体,观察移植心存活时间,并从实验组和对照组中分别抽取5只大鼠于术后1、3、5、6、7 d定时活杀,对比观察移植心急性排斥反应程度,血清补体活性以及CD4+、CD8+T细胞浸润程度。结果使用CVF的实验组,其移植心存活时间显著延长,平均达(32.39±23.82)d,部分移植心甚至达到长期存活,而对照组为(6.60±0.65)d(P<0.01),病理检查及免疫组化证实实验组急性排斥反应程度、组织内C3沉积情况和CD4+、CD8+T细胞浸润程度均较同期对照组明显减轻。结论CVF清除补体可抑制大鼠同种心脏移植急性排斥反应,显著延长移植心存活时间。