胰高血糖素样肽1通过Keap1-Nrf2信号通路减轻糖尿病大鼠心肌微血管损伤

目的:探讨胰高血糖素样肽1(GLP-1)对糖尿病大鼠心肌微血管的保护作用及分子机制。方法:腹腔注射链脲佐菌素构建糖尿病大鼠模型,予以艾塞那肽(GLP-1类似物)连续干预3个月,干预前后检测各组大鼠体重、血糖和血压的变化;硝酸镧灌注大鼠离体心脏,采用透射电镜观察心肌微血管通透性变化;酶消化法体外分离培养心肌微血管内皮细胞,分别给予高糖(25 mmol/L葡萄糖)和GLP-1(10~(-8 )mol/L)处理;体外血管通透性测定试剂盒评估内皮细胞通透性变化;超氧化物检测试剂盒和超氧化物阴离子荧光探针检测细胞超氧化物的生成;Western blot法检测GLP-1受体(GLP-1R)、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、核因子E2相关因子2(Nrf2)和血红素加氧酶1(HO-1)等蛋白表达。结果:(1)艾塞那肽干预3个月可降低糖尿病大鼠心肌微血管通透性;(2)心肌微血管内皮细胞表达GLP-1R;(3)与单纯高糖组相比,GLP-1干预后心肌微血管内皮细胞活性氧簇生成显著降低(P0.05);(4)与单纯高糖组相比,给予GLP-1处理的心肌微血管内皮细胞Keap1表达显著降低(P0.05),Nrf2和HO-1表达显著升高(P0.05)。结论:GLP-1可抑制高糖诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞氧化应激反应,改善心肌微血管屏障功能,这些保护效应可能是通过Keap1-Nrf2信号通路介导实现的。     

高糖诱导内皮细胞氧化型低密度脂蛋白受体表达

目的:研究高浓度葡萄糖对内皮细胞凝集素样氧化型低密度脂蛋白受体(LOX-1) mRNA和蛋白表达的影响,探讨糖尿病易合并血管病变的可能机制。方法:用倒置相差显微镜观察细胞生长情况, RT-PCR检测不同浓度D-葡萄糖(7.5、15、30 mmol/L)作用48 h及15 mmol/L浓度作用不同时间0、12、24、48、72、96 h内皮细胞LOX-1 mRNA表达;免疫组化观察葡萄糖15 mmol/L作用48 h LOX-1蛋白表达。结果:高糖组细胞粗糙,轮廓增强,细胞内有许多发亮的颗粒;不同浓度高糖均可诱导LOX-1 mRNA表达,30 mmol/L作用最强(P＜0.01);同一浓度下作用不同时间,LOX-1 mRNA表达随时间延长而增加,48 h达高峰(P＜0.01),之后下降;免疫组化显示葡萄糖组细胞棕色着色颗粒位于胞膜和胞浆,与对照组差异明显(P＜0.01)。结论:高浓度D-葡萄糖呈浓度依赖性和时间依赖性地诱导内皮细胞LOX-1 mRNA的表达;也可诱导LOX-1蛋白表达,表达的蛋白存在于细胞浆中和细胞膜上。葡萄糖的这种作用可能是糖尿病容易合并血管病变的原因之一。     

核转录因子κB抑制剂PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞VEGF和PEDF表达的影响

目的:探讨核转录因子κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)血管内皮生长因子(VEGF)及色素上皮衍生因子(PEDF)表达的影响。方法:NRK按培养条件分为常糖组:5.6mmol/L葡萄糖;高糖A组:15mmol/L葡萄糖;高糖B组:30mmol/L葡萄糖;PDTC对照组:5.6mmol/L葡萄糖+5.0μmol/LPDTC;PDTCA组:15mmol/L葡萄糖+10μmol/LPDTC;PDTCB组:30mmol/L葡萄糖+20μmmol/LPT-DC。采用半定量RT-PCR方法及ELISA测定各组培养24h、48h后NRK的VEGF及PEDFmRNA及蛋白的表达。结果:与常糖组相比,高糖各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTC干预各组NRK的VEGF蛋白含量及mRNA表达呈下降趋势(P<0.01,P<0.05)。与常糖组相比,高糖各组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显下降(P<0.01,P<0.05);与高糖B组相比,PDTCB组NRK的PEDF蛋白含量及mRNA表达明显升高(P<0.01)。结论:PDTC能明显抑制高糖培养大鼠NRK的VEGF表达并明显上调PEDF的表达,间接提示NF-κB可能通过参与VEGF和PEDF的表达失衡导致糖尿病肾病(DN)的发生。     

霉酚酸酯对高糖培养下人肾小球系膜细胞MCP-1和FN表达的影响

目的:探讨高糖以及霉酚酸酯(MMF)对人肾小球系膜细胞(HMCs)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)和纤维连接蛋白(FN)表达的影响。方法:将培养的HMCs分为正常对照组(5 mmol/L葡萄糖);高糖组(30 mmol/L葡萄糖);甘露醇渗透压对照组(5 mmol/L葡萄糖+25 mmol/L甘露醇);高糖+MMF-10组(30 mmol/L葡萄糖+10μg/mL MMF);高糖+MMF-100组(30 mmol/L葡萄糖+100μg/mL MMF),采用RT-PCR检测每组不同时间点(24、48、72 h)MCP-1 mRNA的表达,ELISA法检测培养上清液MCP-1及FN蛋白的表达。结果:高糖组HMCs MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN的分泌较正常对照组显著增加(P<0.01),且48 h表达最高;不同浓度的MMF均能下调MCP-1 mRNA、蛋白及FN的表达(P<0.01);不同浓度的MMF对MCP-1 mRNA、蛋白的表达及FN分泌的抑制程度不同,呈时间剂量依赖性(P<0.05)。结论:MMF可以阻抑MCP-1的表达及FN的分泌,可能对延缓肾小球硬化及间质纤维化有一定作用。     

足细胞损伤的诱导途径:血管紧张素Ⅱ-足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6信号通路

背景:瞬时受体电位阳离子通道蛋白6是足细胞上一种新发现的阳离子通道蛋白,是组成裂隙隔膜重要蛋白之一,其表达变化与糖尿病肾病蛋白尿密切相关。目的:观察高糖刺激对足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6表达的影响,探讨糖尿病肾病发生发展的可能机制。方法:以永生化小鼠足细胞(MPC5)作为实验对象,将其设为:正常糖组(D-葡萄糖5.6 mmol/L);渗透压对照组(D-葡萄糖5.6 mmol/L+甘露醇25 mmol/L);高糖组(D-葡萄糖30 mmol/L);缬沙坦组(D-葡萄糖30 mmol/L+10-5mol/L缬沙坦);高糖+U73122组(D-葡萄糖30 mmol/L+10μmol/L磷脂酶抑制剂U73122)。各组细胞干预时间为48 h。采用荧光定量PCR和western-blot方法检测各组足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、nephrin、血管紧张素ⅡmR NA和蛋白的表达。结果与结论:与正常糖组相比,高糖组足细胞瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ蛋白及mR NA水平明显升高(P0.01),nephrin m RNA及蛋白水平明显降低(P0.01);与高糖组相比,缬沙坦组瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ的表达显著降低(P0.05,P0.01);高糖+U73122组瞬时受体电位阳离子通道蛋白6、血管紧张素Ⅱ表达较高糖组明显下降(P0.05,P0.01);渗透压对照组与正常糖组之间各因子差异无显著性意义(P0.05)。结果说明高糖可能通过血管紧张素Ⅱ-瞬时受体电位阳离子通道蛋白6反馈信号通路损伤足细胞,同时也为血管紧张素受体拮抗剂通过此通路保护足细胞而治疗糖尿病肾病的提供了一新的理论基础。     

LY333531对高糖所致心肌微血管内皮细胞通透性上调的拮抗作用

目的:观察LY333531对高糖所致心肌微血管内皮细胞通透性上调的拮抗作用,并探讨其机制.方法:将分离培养并鉴定后的大鼠心肌微血管内皮细胞分为正常组,高糖组(葡萄糖浓度25 mmol/L),高糖(葡萄糖浓度25 mmol/L)+LY333531(10 μmol/L)组,高糖(葡萄糖浓度25 mmol/L)+生理盐水组,通过离体血管通透性检测试剂盒检测单层细胞通透性,TUNEL法检测细胞凋亡,免疫荧光和Western blot法检测PKCβⅡ的表达.结果:与正常组比较,高糖组单层细胞通透性明显上调(400.0±20.00 vs 223.3±25.17;P<0.01),凋亡率升高(55.00%±5.000% vs 2.333%±1.155%;P<0.01),PKCβⅡ的表达增加(0.4767±0.07506 vs 0.1733±0.02082;P<0.01);LY333531可明显降低PKCβⅡ的表达(0.2800±0.070 vs 0.4767±0.07506;P<0.01)并拮抗上述病理性通透功能上调(360±17.32 vs 400.0±20.00;P<0.05)和凋亡率升高(25.00%±5.000% vs 55.00%±5.000%;P<0.01),而生理盐水对细胞通透性、凋亡率和PKCβⅡ表达的影响不明显.结论:高糖损害心肌微血管内皮细胞的通透功能,LY333531可拮抗此损伤作用.     

低氧微环境促进人乳腺癌细胞系MCF-7的侵袭和增殖

目的探讨合并2型糖尿病乳腺癌组织中HIF-1α、PAR-1、VEGF的表达及低氧微环境对人乳腺癌细胞系(MCF-7)侵袭和增殖的影响。方法乳腺癌合并2型糖尿病手术切除送检的标本37份,免疫组化检测乳腺癌和癌旁组织中HIF-1α、PAR-1、VEGF表达,测定微血管密度(MVD);将MCF-7细胞分为对照组(5.6 mmol/L葡萄糖)、高糖组(30 mmol/L葡萄糖)、低氧组(1%O_2,5%CO_2,94%N_2)、高糖低氧组。采用显微镜观察各组细胞形态;CCK-8法检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;RT-qPCR和Western blot检测HIF-1α、PAR-1、VEGF mRNA和蛋白表达。结果乳腺癌组织中HIF-1α、PAR-1、VEGF表达及MVD计数高于癌旁组织(P0.05);高糖低氧组MCF-7穿过基膜的细胞数及细胞存活率明显升高(P0.01);低氧组、高糖低氧组HIF-1α、PAR-1、VEGF mRNA及蛋白表达较空白组明显升高(P0.05)。结论低氧高糖促进MCF-7细胞增殖和侵袭及HIF-1α、PAR-1、VEGF表达,可为临床2型糖尿病乳腺癌检测及治疗提供靶点。     

PDTC对高糖培养大鼠肾成纤维细胞中MCP-1表达的影响

目的:探讨核因子-κB(NF-κB)抑制剂吡咯烷二硫氨基甲酸(PDTC)对高糖培养大鼠肾成纤维细胞(NRK)中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法:将NRK分4组进行体外培养:(1)正常组:5.6mmol/L的葡萄糖;(2)高糖组:30mmol/L葡萄糖;(3)高糖+PDTC1组:30mmo/L葡萄糖+5μmol/LPDTC;(4)高糖+PDTC2组:30mmo/L葡萄糖+10μmol/LPDTC,分别于培养24h、48h取各组NRK采用RT-PCR检测其MCP-1mRNA表达水平,采用WesternBlot检测MCP-1蛋白表达水平。结果:与正常组相比,高糖组MCP-1mRNA和蛋白表达水平显著升高(P<0.05),不同浓度PDTC干预后,MCP-1mRNA和蛋白表达水平显著下降(P<0.05),且随PDTC浓度增大,下降更明显。结论:高糖可使NRK中MCP-1表达增高,PDTC能抑制NRK中MCP-1表达。     

红景天苷上调HIF-1α减轻高糖诱导的大鼠肾小球内皮细胞损伤

目的:观察体外不同浓度葡萄糖对大鼠肾小球内皮细胞(rRGECs)表达低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子A(VEGFA)及血管内皮钙黏素(VE-cadherin)的影响,探讨红景天苷减轻高糖诱导rRGECs损伤的作用及可能相关机制。方法:体外培养rRGECs,分为正常糖组、高糖(20、30和50 mmol/L)组、高渗组及红景天苷+高糖组。采用MTT法检测rRGECs的活力;RT-qPCR法检测rRGECs内HIF-1α、VEGFA及VE-cadherin的mRNA表达;Western blot法检测rRGECs内HIF-1α蛋白的表达。结果:与正常糖组相比,培养24 h后,高糖(20mmol/L)组rRGECs HIF-1α的mRNA及蛋白表达均上调(P 0.05);培养120 h后,高糖组HIF-1αmRNA表达下调(P 0.05)。与正常糖组相比,培养24 h和120 h后,高糖组rRGECs内VE-cadherin的mRNA表达下调(P 0.05)。与正常糖组相比,培养24 h后,高糖组rRGECs内VEGFA的mRNA表达上调(P 0.05);培养120 h后,高糖组rRGECs内VEGFA的mRNA表达下调(P 0.05)。与正常糖组相比,培养24 h和120 h后,高渗组rRGECs内HIF-1α、VE-cadherin及VEGFA的mRNA表达无变化。与高糖组相比,培养24 h后,红景天苷(50μmol/L)组rRGECs的活力增加(P 0.01),且细胞内HIF-1α和VE-cadherin的mRNA及HIF-1α蛋白表达均上调(P 0.05)。结论:体外高糖培养能影响rRGECs表达HIF-1α,可能与细胞活力、葡萄糖的浓度、作用时间及HIF/VEGF通路有关。红景天苷能减轻高糖诱导的rRGECs损伤,其机制可能与增加rRGECs内HIF-1α的表达有关。     

氯沙坦通过ERK1/2 MAPK途径抑制高糖诱导小鼠系膜细胞CTGF表达

目的: 研究高糖环境下, 氯沙坦对CTGF的影响以及其作用机制.方法: 体外培养小鼠系膜细胞株(MMCs), 用高糖(25 mmol/L葡萄糖)刺激细胞分别作用24 h、 48 h、 72 h, 用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达.再将细胞分为低糖组(5.6 mmol/L葡萄糖), 山梨醇组(5.6 mmol/L葡萄糖+19.4 mmol/L山梨醇), 高糖组(25 mmol/L葡萄糖), 氯沙坦组(25 mmol/L葡萄糖+10-5 mol/L氯沙坦)以及 ERK抑制剂组(25 mmol/L葡萄糖+ 25 μmol/L PD98059), 48 h后采用Western blot方法检测磷酸化ERK1/2的表达, 72 h后采用Real-time PCR方法及Western blot分别检测 CTGF mRNA表达量以及蛋白的表达.结果: 高糖刺激小鼠系膜细胞后, ERK1/2磷酸化的蛋白表达逐渐增高, 呈现一定时间依赖性.与低糖组相比, 高糖组磷酸化ERK1/2、 CTGF的蛋白表达明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组磷酸化ERK1/2的蛋白表达以及CTGF的蛋白均明显下降有统计学意义(P<0.05).与低糖组相比, 高糖组CTGF mRNA表达量明显增加(P<0.01), 而与高糖组相比, 氯沙坦组以及ERK抑制剂组CTGF mRNA表达量明显下降, 且有统计学意义(P<0.01).结论: 氯沙坦可抑制高糖对CTGF的诱导作用, 其机制可能与抑制ERK1/2 MAPK途径有关.     

Ghrelin促进大鼠胰岛素合成及高葡萄糖诱导的胰岛素分泌

Ghrelin是由胃黏膜分泌的小分子脑肠肽。本研究探讨了Ghrelin对于大鼠胰岛细胞合成与分泌胰岛素的影响。将分离培养的大鼠胰岛分为Ghrelin处理组和对照组 :(1)在高浓度葡萄糖 (16 7mmol L)刺激时加入不同浓度Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 8mol L孵育 6 0min ,测定胰岛素分泌量。 (2 )在培养液中加入不同浓度Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 8mol L预处理 2 4h后 ,用RT PCR方法检测胰岛内前胰岛素原mRNA表达 ,并测定不同浓度葡萄糖 (5 6mmol L ,16 7mmol L)刺激时胰岛素分泌量。离体大鼠胰岛 ,在高糖刺激时加入Ghrelin 10 - 1 1 ～ 10 - 1 0 mol L共同培养 6 0min ,胰岛素分泌量增加高于对照组 (P <0 0 5 )。Ghrelin 10 - 1 2 ～ 10 - 1 0 mol L预处理 2 4h后 ,高糖刺激时胰岛素分泌量增加高于对照组 (P <0 0 5 ) ,同时Ghrelin 10 - 1 0 mol L促进胰岛内前胰岛素原mRNA表达高于对照组 (P <0 0 5 )。一定浓度的Ghrelin促进胰岛在高葡萄糖诱导下的胰岛素分泌 ,经Ghrelin预处理 2 4h后该作用更为显著。Ghrelin增加大鼠胰岛内前胰岛素原mRNA的表达 ,促进胰岛素合成。     

渗透压制剂对人腹膜间皮细胞透明质酸合成酶的调节作用

目的: 了解不同渗透压制剂对人腹膜间皮细胞(humanperitonealmesothelialcells,HPMCs)透明质酸合成酶(hyaluronansynthase,HAS)的调节作用及对透明质酸(hyaluronan,HA)合成的影响。方法: 分离培养的HPMCs随机分为5组:正常对照组(对照组);90mmol/L葡萄糖组(高糖组);30mmol/L葡萄糖组(低糖组);5%缩合葡萄糖(缩合葡萄糖组)及90mmol/L甘露醇组(甘露醇组)。给予上述刺激后继续培养24h,以RT-PCR法检测HAS-2mRNA和HAS-3mRNA的表达;收集细胞培养上清液,以放射免疫法检测HA浓度;以微粒排除法观察细胞胞衣样结构的面积。结果: 高糖组、低糖组、缩合葡萄糖组、甘露醇组HAS-2mRNA的表达均显著高于对照组(P均<0.05);高糖组HAS-3mRNA的表达亦明显增加(P<0.05),低糖组、缩合葡萄糖组、甘露醇组HAS-3mRNA表达与对照组相比差异无显著(P>0.05)。各实验组细胞胞衣样结构面积与细胞体面积的比值无显著差异(P均>0.05)。对照组、高糖组、低糖组、缩合葡萄糖组、甘露醇组细胞培养上清液HA的浓度均显著高于对照组(P均<0.05);高糖组HA浓度显著高于低糖组、缩合葡萄糖组和甘露醇组(P<0.05)。结论: 与高浓度葡萄糖相比,缩合葡萄糖虽增强HPMCsHAS-2mRNA表达,但对与炎症反应相关的HAS-3mRNA表达无影响,提示缩合葡萄糖可能在对腹膜组织生物相容性方面优于高浓度葡萄糖。     

不同浓度葡萄糖、胰岛素对新生大鼠心肌细胞脂联素表达的影响

目的: 观察心肌细胞能否表达脂联素(APN),并探讨高糖、高胰岛素状态下心肌细胞APN表达的变化。方法: Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠心肌细胞原代培养,分为葡萄糖6组:高渗对照组、5.5 mmol/L组、20 mmol/L组、25 mmol/L组、30 mmol/L组和50 mmol/L组。胰岛素6组:0 mol/L组、10^-10 mol/L组、10^-9 mol/L组、10^-8 mol/L组、10^-7 mol/L组和10^-6 mol/L组。干预48 h,用RT-PCR法测定心肌细胞APNmRNA表达的差异,并检测心肌细胞APN蛋白表达的变化。结果: 在葡萄糖浓度小于30 mmol/L组中,心肌细胞APN表达随葡萄糖浓度的增加而减低(P<0.05),30 mmol/L和50 mmol/L组APN表达显著差异;渗透压对于心肌细胞APN表达无影响;在胰岛素浓度低于10^-7 mol/L组中,心肌细胞APN表达随胰岛素浓度的增加而减低(P<0.05),在高于10^-7 mol/L组中,心肌APN表达无显著差异。结论: 心肌细胞能够表达脂联素。在一定范围内,随葡萄糖、胰岛素浓度增加,心肌细胞APN的表达水平下降。     

PPARβ及NO在高糖高胰岛素诱导心肌细胞肥大中的作用

目的:观察过氧化物酶体增殖物激活受体β(PPARβ)及一氧化氮(NO)相关信号通路在高糖高胰岛素(HGI,25.5 mmol/L葡萄糖+0.1μmol/L胰岛素)诱导心肌肥大中的作用。方法:体外培养乳鼠心肌细胞,以细胞表面积、蛋白含量和心房钠尿因子(ANF)mRNA表达作为心肌肥大的指标;利用real-time PCR、Western blotting、硝酸还原酶法和分光光度法分别检测mRNA表达、蛋白表达、NO含量和NO合酶(NOS)活性。结果:HGI诱导心肌细胞出现肥大(P0.01),PPARβmRNA和蛋白表达明显降低(P0.05),诱导型NOS(i NOS)mRNA和蛋白的表达则升高(P0.01),NO含量和NOS活性增加(P0.01)。PPARβ激动剂GW0742能抑制HGI诱导的心肌肥大(P0.01),上调PPARβ的表达,降低i NOS的表达,使NOS活性和NO含量恢复正常(P0.01)。PPARβ拮抗剂GSK0660可阻断GW0742对心肌肥大的保护作用,取消其对PPARβ、i NOS mRNA和蛋白表达水平以及NOS活性和NO含量的作用(P0.05)。结论:PPARβ下调,激活i NOS-NO信号通路参与高糖高胰岛素诱导心肌肥大过程。     

荜茇酰胺通过抗炎作用缓解糖尿病心肌病小鼠的心肌病变

目的:探究荜茇酰胺(PL)对糖尿病心肌病模型中心肌损伤和纤维化的作用。方法:高糖刺激心肌H9C2细胞模拟高糖环境建立细胞模型,随后分为对照组、高糖组、低剂量(2.5μmol/L)PL组及高剂量(5μmol/L)PL组,qPCR检测炎症因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)的mRNA表达水平,Western blot检测纤维化指标转化生长因子β(TGF-β)和Ⅳ型胶原蛋白(collagen IV)的蛋白表达水平。将C57BL/6小鼠随机分为对照组、1型糖尿病模型组、低剂量(2.5 mg/kg)PL组及高剂量(5 mg/kg)PL组,每组6只。除对照组外,其余各组每日腹腔注射链脲佐菌素(STZ) 50 mg/kg,连续5日,1周后检测空腹血糖≥12 mmol/L认为造模成功。造模成功后,按不同分组给予不同剂量PL,腹腔注射给药13周,每隔2周尾静脉取血检测空腹血糖,第13周检测超声心动图,第13周末麻醉后处死小鼠,取血清检测肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平;取心脏固定包埋切片,HE染色和天狼星红染色观察病理变化。结果:(1)高糖诱导下的H9C2细胞TNF-α和IL-6的mRNA表达水平以及TGF-β和collagen IV的蛋白表达水平较对照组明显升高,PL处理后上述指标均有所下降(P0.05);(2) STZ造模成功后,腹腔注射PL可逆转糖尿病心肌病小鼠心肌组织结构排列紊乱及纤维化等病理改变,并降低心肌损伤血清学指标CK-MB及LDH水平(P0.05)。结论:PL可以减轻糖尿病心肌病模型的炎症反应和心肌组织损伤,延缓纤维化进程。     

抗衰老Klotho蛋白对高糖作用下血管内皮细胞的保护作用

目的:研究抗衰老Klotho蛋白对高糖作用下血管内皮细胞的保护作用及其作用机制。方法:体外培养人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs),设置PBS对照组、5.5 mmol/L葡萄糖组、33.3 mmol/L葡萄糖组、0.1μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组、1μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组和10μmol/L Klotho+33.3 mmol/L葡萄糖组。使用MTT法检测各组细胞活力;同时检测各组细胞培养上清中丙二醛(MDA)的含量以及乳酸脱氢酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)和还原型谷胱甘肽(GSH)的活性;流式细胞术检测各组细胞中活性氧(ROS)含量变化;ELISA检测各组细胞培养液中一氧化氮(NO)、内皮素1(ET-1)和细胞间黏附分子1(ICAM-1)的浓度变化;Western blot法检测各组细胞中核因子κB(NF-κB)蛋白的表达。结果:与PBS对照组相比,33.3 mmol/L葡萄糖能够显著降低HUVECs的细胞活力,增加细胞中ROS的含量,增加细胞培养上清中LDH活性和MDA含量,降低SOD和GSH的活性,同时降低NO分泌,诱导ET-1、ICAM-1分泌及细胞中NF-κB蛋白的表达(P0.05)。不同浓度Klotho蛋白和33.3 mmol/L高糖同时作用HUVECs时,细胞活力逐渐上升,ROS和MDA含量以及LDH活性逐渐下降,SOD和GSH活性则逐渐上升,同时NO分泌增加,ET-1、ICAM-1分泌及NF-κB蛋白表达显著下降(P0.05)。结论:抗衰老Klotho蛋白能够提升高糖作用下HUVECs的细胞活力,减少高糖诱导的ROS生成及氧化损伤,恢复HUVECs的正常分泌功能,并通过减少NF-κB蛋白表达发挥抗损伤作用。     

缺氧和高糖对大鼠肾成纤维细胞ICAM-1mRNA表达的影响

目的:探讨缺氧和高糖对肾成纤维细胞(NRK)细胞间粘附分子-1(ICAM-1)mRNA表达的影响。方法:将大鼠NRK分6组进行体外培养:(1)正常浓度葡萄糖组(常糖组):5.6mmol/L葡萄糖;(2)常糖+缺氧组:5.6mmol/L的葡萄糖+100μmol/L的CoCl2;(3)高糖A组:15mmol/L葡萄糖;(4)高糖+缺氧A组:15mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl2;(5)高糖B组:30mmol/L葡萄糖;(6)高糖+缺氧B组:30mmol/L葡萄糖+100μmol/L的CoCl2。分别于24h、48h取各组NRK采用RT-PCR检测ICAM-1mRNA表达水平。结果:与常糖组相比,高糖A组,高糖B组ICAM-1mRNA表达量逐渐升高(P<0.01),常糖+缺氧组、高糖+缺氧A、B组ICAM-1mRNA表达量也升高(P<0.01);高糖+缺氧A、B组ICAM-1mRNA表达量分别比高糖A、B组明显升高(P<0.01);高糖A、B组和常糖+缺氧组、高糖+缺氧A、B组48hICAM-1mRNA表达量均高于24h表达量(P<0.01)。结论:高糖和缺氧均可导致ICAM-1mRNA高表达,缺氧可能进一步增加高糖上调ICAM-1的表达。     

ROCK通过抑制PI3K/Akt通路促进高糖诱导的心肌细胞凋亡

目的:探讨Rho相关卷曲螺旋激酶(ROCK)是否通过调控PI3K/Akt信号通路参与高糖诱导的原代心肌细胞凋亡。方法:培养原代Wistar乳鼠心肌细胞,用α-横纹肌肌动蛋白(α-SCA)免疫组化法进行鉴定;建立心肌细胞高糖模型,采用5.5、33和40 mmol/L葡萄糖作用于细胞48 h。采用MTT法检测细胞活力;RT-qPCR检测各组心肌细胞中ROCK1和ROCK2的表达水平;流式细胞术检测各组心肌细胞的凋亡水平;Western blot检测ROCK1、ROCK2、cleaved caspase-3、Bcl-2、PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平;为了证实ROCKs对PI3K/Akt信号通路的调控作用,将细胞分为对照组(5.5 mmol/L葡萄糖处理细胞)、高糖组(33 mmol/L葡萄糖处理细胞)和高糖加Y27632(ROCK抑制剂)组,Western blot检测ROCK1、ROCK2、PI3K、Akt和p-Akt的蛋白水平。结果:高糖培养48 h后,33和40 mmol/L葡萄糖组细胞相对活力分别为(79.71±2.43)%和(68.41±7.49)%,与对照组相比显著降低(P<0.05)。各组细胞培养48 h后,33和40 mmol/L葡萄糖组ROCK1和ROCK2的mRNA相对表达量较对照组显著增加(P<0.05)。与对照组相比,33和40 mmol/L葡萄糖组细胞凋亡率均显著增加(P<0.05)。与对照组相比,33和40 mmol/L葡萄糖组的ROCK1和ROCK2蛋白表达增高(P<0.05),caspase-3活化片段的蛋白水平增加(P<0.05),Bcl-2的蛋白表达降低(P<0.05)。3组间心肌细胞PI3K与Akt蛋白水平的差异无统计学显著性,33和40 mmol/L葡萄糖组细胞p-Akt蛋白的水平较对照组降低(P<0.05)。与高糖组相比,高糖加Y27632组的ROCK1和ROCK2表达被抑制;3组间心肌细胞PI3K和Akt的蛋白水平差异无统计学显著性;与对照组相比,高糖组的p-Akt蛋白水平降低(P<0.05),高糖加Y27632组的p-Akt蛋白水平显著增加(P<0.05)。结论:高糖环境下,ROCK可能通过抑制PI3K/Akt信号通路,降低了p-Akt水平,从而促使心肌细胞凋亡的发生。     

过表达Cdh1蛋白对高糖诱导的视网膜Müller细胞株GFAP表达的影响

目的 探讨过表达Cdh1蛋白对高糖诱导的视网膜Müller细胞株GFAP表达的影响.方法 培养的Müller细胞分为4组:对照组(Control)、高糖组(HG group,30 mmol/L葡萄糖)、Cdh1过表达组(Cdh1,30 mmol/L葡萄糖+过表达Cdh1蛋白的慢病毒载体)、病毒阴性对照组(NC-Cdh1,30 mmol/L葡萄糖+慢病毒载体稀释液),显微镜下观察Müller细胞一般生长状况,免疫荧光检测GFAP在Müller细胞的表达情况,Western blot检测Müller细胞GFAP及Cdh1蛋白的相对表达.结果 HG组和NC-Cdh1组GFAP表达水平明显高于Control组,Cdh1明显低于Control组(P＜0.05);Cdh1组GFAP表达水平明显低于HG组,Cdh1高于HG组(P＜0.05),而HG组和NC-Cdh1组之间无统计学意义(P＞0.05).结论 过表达Cdh1蛋白下调高糖诱导的视网膜Müller细胞GFAP表达,对高糖诱导的Müller细胞损伤起到保护作用.     

氢分子对高糖状态下肾小球系膜细胞凋亡相关蛋白及Nrf2信号通路的影响

目的:探讨氢分子对高糖状态下肾小球系膜细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3表达水平的影响及其可能的机制。方法:体外培养小鼠肾小球系膜细胞,实验分为正常对照组(C组,5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(G组,5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)、高糖组(H组,25 mmol/L葡萄糖)和高糖+富氢水组(HH组,25 mmol/L葡萄糖+富氢水),培养48 h。采用Western blot法检测Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、核因子E2相关因子2(Nrf2)、血红素加氧酶1(HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO-1)的蛋白水平;RT-PCR检测HO-1和NQO-1的mRNA表达;超氧化物阴离子荧光探针二氢乙啶检测活性氧簇(ROS)的水平;总超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(WST-8法)检测SOD活性。结果:与C组比较,H组Bax和cleaved caspase-3的蛋白水平增加,Bcl-2蛋白表达减少(P0.05),而HH组上述蛋白表达水平与C组的差异均无统计学显著性;与H组比较,HH组的Bax和cleaved caspase-3蛋白下调,Bcl-2蛋白上调(P0.05)。H组细胞内的ROS水平较C组明显增高,SOD活性较C组明显降低(P0.05),而HH组的SOD活性与C组比较差异无统计学显著性;HH组细胞内的ROS水平较H组明显降低,SOD活性明显高于H组(P0.05)。与C组比较,H组的Nrf2蛋白以及HO-1和NQO-1 mRNA及蛋白表达均减少(P0.05);HH组的Nrf2、HO-1和NQO-1蛋白以及HO-1和NQO-1的mRNA表达均明显高于H组(P0.05)。结论:氢分子可抑制高糖状态下肾小球系膜细胞促凋亡蛋白的表达,同时诱导其抗凋亡蛋白的表达,其机制可能与激活Nrf2信号通路有关。