两种方法培养人早孕绒毛滋养层细胞的比较***

背景：人早孕绒毛滋养层细胞体外培养是研究各种妊娠疾病的基础,如何获得纯度高、数量多的滋养层细胞以及如何简化实验步骤,仍是目前研究的热点。 目的：寻求一种培养高纯度人早孕绒毛滋养层细胞方法。 方法：取5~10周正常绒毛组织,胰酶消化和差速贴壁联合应用法与组织块培养法分别进行人早孕绒毛滋养层细胞原代培养,免疫组织化学观察细胞角蛋白7和波形蛋白的表达,进行滋养层细胞纯度的鉴定。 结果与结论：两种方法均能培养出人早孕绒毛滋养层细胞,呈三角形,多边形。抗-细胞角蛋白7阳性表达,抗-波形蛋白阴性表达。胰酶消化和差速贴壁联合应用法培养细胞纯度高于组织块培养法(P < 0.05)。提示胰酶消化和差速贴壁联合应用法是一种培养人早孕绒毛滋养层细胞较好的方法。      

绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的分离培养与鉴定

目的探索绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的分离和培养方法,并进行鉴定。方法采用胰蛋白酶和胶原酶两步消化法分离培养滋养层细胞,倒置相差显微镜观察滋养层细胞的形态学特点;应用常规HE染色和免疫组织化学染色,透射电镜技术进行绵羊多核绒毛膜滋养层细胞鉴定。结果倒置相差显微镜下,滋养层细胞为双核及多核细胞,细胞形态为上皮样,呈片状铺展生长;绵羊胎盘子叶与培养的滋养层细胞爬片的细胞角蛋白免疫组织化学染色均显示多核滋养层细胞胞质为棕色阳性信号,透射电镜可见滋养层细胞表面微绒毛发达,胞质内有较多膜包小泡及丰富的微丝和脂滴。结论建立了胰蛋白酶和胶原酶两步消化法分离培养绵羊多核绒毛膜滋养层细胞的方法,获得了较高纯度的具有生物学活性的多核绵羊绒毛膜滋养层细胞。     

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。     

分散人绒毛膜滋养层细胞及细胞培养

目的获取人绒毛膜滋养层细胞.方法应用胰酶/DNA酶法进行消化后进行培养.经光镜和电镜观察.结果我们获取了人绒毛滋养层细胞并成功培养.结论取人妊娠45～55D刮宫术后的绒毛组织,经胰酶、DNA酶消化可得绒毛滋养层细胞.     

预损伤与改良传代体外培养许旺细胞的比较

背景：通过组织工程方法构建神经桥接体修复神经损伤,需要大量纯化体外培养的许旺细胞。 目的：对比观察预损伤法和改良传代法获取许旺细胞的纯度与质量。 方法：①预损伤法：预损伤SD乳鼠坐骨神经,3 d后取出坐骨神经,分离神经外膜,用胰酶、胶原酶消化,差速贴壁除去成纤维细胞,接种培养。②改良传代法：直接获取SD乳鼠坐骨神经,分离神经外膜,运用双酶消化法结合单酶消化法进行许旺细胞原代培养,5~7 d后采用单酶快速消化离心法行传代培养,同时纯化许旺细胞。 结果与结论：预损伤法和改良传代法体外培养的许旺细胞纯度均达95%以上,两种方法获得的许旺细胞纯度差异无显著性意义(P > 0.05)。两种方法获取的许旺细胞形态正常,数量及纯度高,增殖旺盛,说明预损伤法和改良传代法都是体外获取高质量与高纯度许旺细胞的理想方法。     

人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性

背景：胎盘间充质干细胞来源稳定,正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。 目的：比较从胎盘组织绒毛膜与绒毛滋养层分离获取人胎盘间充质干细胞生物学特性的差异。 方法：手术剪剥离人胎盘表面羊膜,分别剪取胎儿侧的绒毛膜与绒毛滋养层组织机械破碎后,分别加含Ⅱ型胶原酶的PBS消化液消化,分离为单个核细胞,用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基在37 ℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度下培养,48 h后全量换液,去除非贴壁细胞,添加新鲜培养基,当细胞融合90%左右时,胰酶传代。通过观察原代细胞总数,细胞生长形态,以及间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105的流式细胞测定结果比较从不同胎盘组织分离获得胎盘间充质干细胞的差异。 结果与结论：流式细胞仪测定结果显示,从绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞间充质干细胞表面标记CD90、CD73以及CD105的阳性率都在90%以上,两种来源的细胞生长都呈现典型的成纤维细胞形态,这表明绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞都具有间充质干细胞的特性。提示消化时间相同,酶浓度相同,以及摇床转速相同的情况下,可从绒毛膜中可以得到更多的细胞,对于后续培养更易获得较多的细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

新生大鼠心肌成纤维细胞培养方法的比较

 目的:建立并比较新生大鼠心肌成纤维细胞的培养方法。方法:分别通过胶原酶+胰酶消化法和胰酶消化法对新生大鼠心肌组织进行消化,利用贴壁时间差分离心肌细胞和心肌成纤维细胞,然后对收集的心肌成纤维细胞进行形态、纯度及对药物反应方面的检测。结果:在细胞形态和纯度方面,2种方法收集的心肌成纤维细胞没有明显差异,但用胶原酶+胰酶消化法可以获得更多数量的心肌细胞;在药物反应方面,采用胰酶消化法获得的心肌成纤维细胞比胶原酶+胰酶消化法具有更强的增殖能力。结论:采用胶原酶+胰酶消化法和胰酶消化法可以获得相同形态和纯度的心肌成纤维细胞,但是采用胰酶消化法获得的心肌成纤维细胞对药物具有更强的增殖反应能力。     

一种高效实用的人卵巢表面上皮细胞培养方法

背景：体外分离培养纯度高、活力强且生物学特性稳定的卵巢表面上皮难度很大,目前原代培养主要采用组织块贴壁法和酶消化法,但这两种方法在取材、细胞活力及细胞纯度上都存在一定的问题。 目的：建立一种高效实用的人卵巢表面上皮分离、培养和鉴定方法。  方法：创新性地运用细胞刷刷取人卵巢表面上皮,以红细胞裂解法、差速贴壁法对细胞进行分离纯化,并向无血清DMEM-F12培养基中添加人表皮生长因子进行细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞形态,应用苏木  精-伊红染色和免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定,并绘制生长曲线。  结果与结论：卵巢表面上皮培养24 h开始贴壁生长,7-12 d后基本达到融合,细胞呈多角形或扁平型,透光性及折光性强。细胞形态符合正常上皮细胞特性,所分离的细胞几乎完全表达上皮细胞表面标志物CK19。细胞生长良好,可以传6-8代,细胞生长曲线呈“S”形,纯度达95%以上。结果提示细胞刷取培养法操作简单,能够快速分离获得大量卵巢表面上皮,所获得的细胞经红细胞裂解法和差速贴壁法处理后纯度达95%以上,且细胞生长稳定。     

成人真皮成纤维细胞原代培养及鉴定

目的探讨建立成人真皮成纤维细胞原代培养方法。方法新鲜皮肤组织用分散酶Ⅱ(dispaseⅡ)消化,分离上皮和真皮层,分别采用组织块法和Ⅰ型胶原蛋白酶消化法分离真皮层成纤维细胞。用倒置相差显微镜观察细胞生长情况,波形蛋白免疫荧光细胞化学染色法鉴定细胞类型及纯度;噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖活性绘制生长曲线,流式细胞术检测细胞周期分布。结果培养48 h,经胶原蛋白酶分离得到的成纤维细胞95%以上贴壁,同时细胞开始从组织块边缘贴壁延伸生长。培养5 d时,组织块周围有大量细胞贴壁增殖。细胞生长迅速,第7天,增殖细胞层铺满培养皿。组织块法分离的成纤维细胞中可混杂少量上皮细胞团,而胶原蛋白酶消化法分离的细胞波形蛋白阳性率接近100%,几乎均为成纤维细胞。结论胶原蛋白酶消化和组织块法均是快速、经济、有效获取真皮成纤维细胞的方法。胶原蛋白酶消化法可以更有效避免上皮细胞污染,分离的真皮成纤维细胞有较好的增殖能力。     

壁虎胚胎大脑皮层神经元和胶质细胞的分离、培养及纯化

目的 建立多疣壁虎胚胎大脑皮层神经元和胶质细胞的分离、培养及纯化方法.方法 分离孵化15d的多疣壁虎胚胎的大脑皮层,经胰酶消化,细胞计数后接种于培养瓶.采用差速贴壁及反复传代相结合的纯化培养方法培养胶质细胞;采用添加B27的神经元培养基培养神经元,并用免疫细胞化学方法鉴定.结果 获得体外培养的壁虎GFAP阳性表达胶质细胞,4代后纯度达95%以上;采用神经元培养基,神经元生长良好,NF、MAPⅡ表达阳性,第10d纯度达95%以上.结论 建立了壁虎细胞的培养方法,并获得高纯度的胶质细胞和神经元,为进一步对神经系统的深入研究提供细胞模型.     

胎鼠肺成纤维细胞的改良培养法

目的改良胎鼠肺成纤维细胞的培养方法。方法取19d胎龄129孕鼠,开胸取出胎肺,用胰酶稍微消化,再进行组织悬液贴壁培养。传代的肺成纤维细胞用免疫组化检测其vimentin和laminin的表达。结果24h后镜下可见组织块周边有长梭型细胞爬出,48h后生长迅速,3d接近融合。传代后杂细胞基本去除,5代后细胞的增殖能力逐渐下降。结论胰酶轻度消化后组织悬液贴壁法是一种可靠快速的肺成纤维细胞分离纯化培养方法。     

人脐带Wharton’s jelly源间充质干细胞培养中碱性成纤维细胞生长因子的作用

背景:培养脐带源间充质干细胞过程中,细胞形态常易变得宽大不规则,传代不易贴壁,死亡率高,找到一个维持细胞稳定的方法是有必要的。目的:拟采用组织块培养法从人脐带Wharton’s jelly中分离培养间充质干细胞,观察碱性成纤维细胞生长因子对其生物学特性的影响。方法:采用组织块法分离培养和扩增脐带组织间充质干细胞,对照组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清培养,实验组用DMEM/F12培养基+体积分数为10%胎牛血清+20μg/L碱性成纤维细胞生长因子培养。观察组织块游出细胞的时间和细胞形态,每隔3d或4d更换培养液,待细胞达到80%~90%融合时,用0.25%胰酶消化后,按1:2或1:3的比例传代。结果与结论:倒置显微镜下观察对照组中从8~10d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,实验组中从6~8d开始有细胞从组织块四周游出贴壁,1周后可见多数呈长梭形或扁平形的成纤维样细胞,围绕组织块成旋涡状,前3代细胞形态及传代间隔时间两组基本相同;3代以后实验组细胞较对照组易于贴壁,传代死亡率低,生长曲线提示增殖能力强。流式细胞术分析两组细胞周期显示第3,6代70%以上的细胞处于G0/G1期,且第3,6代细胞均阳性表达CD29,CD44,弱表达HLA-ABC,不表达CD34、CD45和HLA-DR。结果提示采用组织块培养法可从人脐带Wharton’s jelly中分离出具有间充质干细胞特性的细胞,且碱性成纤维细胞生长因子能使细胞从组织块游出时间提前和有助于促使细胞贴壁,一定程度上维持细胞形态稳定性,提高增殖能力,并且不改变细胞的表面标志物表达。     

平滑肌细胞对共培养体系滋养细胞侵袭力与MMP-2及MMP-9表达的影响

目的模拟体内环境,建立可保持平滑肌细胞与绒毛外细胞滋养层细胞(EVCT)生物学特性的共培养细胞模型,应用于研究平滑肌细胞与滋养细胞理化特性与滋养细胞的侵袭行为。方法利用组织块培养法培养脐动脉平滑肌细胞,组织块培养、胰酶消化和Percoll梯度沉降,收集纯化人早孕绒毛组织的滋养细胞,免疫组化检测细胞的纯度。将滋养细胞与平滑肌细胞分别放入Transwell的上下小室,观察该模型下滋养细胞形态变化、细胞活力、侵袭力改变与分泌功能等特性。结果免疫组化显示EVCT的细胞角蛋白7阳性表达的细胞数占95%以上,SMC a-actin阳性表达的细胞数也超过95%,证实共培养系统中EVCT和SMC纯度均在95%以上,且生物学特性得以维持。上室中的EVCT保持了其侵袭能力,且平滑肌细胞能促进滋养细胞增殖活性、侵蚀能力及MMP2、MMP9的表达。结论成功地建立了平滑肌细胞与滋养细胞原代共培养系统模型,便于研究滋养细胞侵袭和子宫螺旋动脉重铸障碍的分子机制。     

人类膀胱移行上皮细胞的体外培养与鉴定

背景：移行上皮细胞的分离方法有酶消化法、组织块法及刮削法3种。 目的：探讨培养人类膀胱移行上皮细胞和其传代的最佳方法。 方法：培养人类膀胱移行上皮细胞,观察细胞在MEM-F12和KSFM培养基中的生长增殖以及形态变化。免疫荧光染色观察上皮细胞特异性蛋白标记AE1及仅在尿路上皮组织中特异表达的尿空斑蛋白Uroplakin III,以鉴定膀胱移行上皮细胞。分别利用4步胰蛋白酶消化法和组织块再植法对细胞进行传代培养。 结果与结论：①细胞在MEM-F12培养基中较KSFM培养基中爬出及融合均快,生长状态良好。②细胞免疫荧光鉴定证实为移行上皮细胞。③胰蛋白酶消化传代细胞,传代第18~24 h贴壁,贴壁后无法继续生长,60~72 h后细胞开始凋亡;组织块再种传代细胞生长稳定迅速,24~48 h细胞开始爬出,第10~16天达到80%融合,传至第4代后开始出现衰退。说明以DMEM-F12培养基进行组织块培养法和组织块再种法是人类膀胱移行上皮细胞原代培养和传代培养经济有效的方法。     

低分子量肝素对滋养层细胞MMP-2、TIMP-2表达及侵袭力的影响

目的:探讨低分子量肝素对体外培养人早孕绒毛滋养层细胞MMP-2、TIMP-2表达及侵袭力的影响。方法:将经胰蛋白酶/DNA酶Ⅰ联合消化,通过Percoll细胞分离液纯化得到的绒毛滋养层细胞进行体外培养。采用不同浓度低分子量肝素干预培养24h后,ELISA法测定细胞上清液中MMP-2、TIMP-2的浓度;采用Tr-answell小室观察滋养层细胞的侵袭能力。结果:不同浓度的低分子量肝素(1.0×102IU/L,1.0×103IU/L,1.0×104IU/L)干预人早孕绒毛滋养层细胞后,与对照组相比,MMP-2的表达上调,滋养层细胞侵袭力增强,在1.0×103IU/L时MMP-2表达最高,滋养层细胞侵袭力最强(P0.05)。TIMP-2的表达随着低分子量肝素浓度的增加而逐渐下降,与对照组比较,在1.0×103IU/L、1.0×104IU/L组明显降低(P0.05),但1.0×103IU/L组与1.0×104IU/L组之间TIMP-2的表达无差异(P0.05)。结论:低分子量肝素可能直接通过影响绒毛滋养层细胞MMP-2、TIMP-2的表达进而影响绒毛滋养层细胞的侵袭能力。     

改良法体外培养大鼠脑膜间皮细胞

建立大鼠脑膜间皮细胞(rat meningeal mesothelial cells,RMMC)的体外原代培养模型。用机械吹打法和0.25%胰酶-0.01%EDTA轻消化法收集原代细胞,多次差速黏附处理及传代。传三代,分别进行倒置相差显微镜观察细胞大体结构、扫描电镜(SEM)观察细胞超微结构、苏木素伊红(HE)染色法观察细胞形态、细胞免疫荧光法及免疫细胞化学法鉴定细胞。结果显示:分离培养的原代细胞在倒置显微镜下为多边形,汇合时呈铺路石样排列;SEM下细胞表面可见大量密集的微绒毛;免疫荧光染色结果显示培养细胞呈细胞角蛋白抗原阳性;免疫细胞化学结果显示培养细胞呈细胞角蛋白和波形蛋白抗原阳性,第Ⅷ因子相关抗原阴性,培养细胞的纯度达96%以上。结论:本实验成功建立了RMMC培养模型,可为脑膜纤维化的形成机制研究提供理想的细胞模型。     

改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞

背景：目前采用的A型胶原酶和胰蛋白酶混合酶分离乳腺细胞团的方法操作复杂,实验条件要求高。 目的：观察改良型混合酶消化法能否成功进行乳腺上皮细胞的体外培养。 方法：采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(1∶1∶1)混合消化直接用眼科剪剪碎的小鼠乳腺组织,37 ℃振荡消化获取乳腺细胞团,并采用差速贴壁法去除成纤维细胞,将细胞团接种于细胞培养瓶进行培养。 结果与结论：倒置显微镜下观察显示,改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且培养12 h后细胞团绝大多数贴在细胞瓶壁,培养72 h后细胞团完全铺开融合成片,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光细胞化学染色结果显示,培养细胞角蛋白18呈阳性反应。说明应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。     

胚胎小鼠肠神经胶质细胞的分离与鉴定

目的:建立一种简便的分离与鉴定胚胎小鼠肠神经胶质细胞的方法。方法:分离14～16 d胚胎小鼠肠道组织,制备单细胞悬液,用神经胶质细胞生长专用的培养基进行培养,在倒置显微镜下观察胶质细胞的生长情况。在细胞贴壁达90%以上时进行纯化并传代,待细胞贴壁后使用GFAP、S100b和Sox10蛋白抗体作为胶质细胞的特异性标记物用免疫荧光法进行EGCs纯度的鉴定。结果:培养24 h部分细胞贴壁,随培养天数延长贴壁细胞的数量逐渐增多,胞体较前饱满,突起进一步向外延展。12～14 d时细胞贴壁达90%以上,传代后细胞状态良好。免疫荧光染色可见其GFAP、S100b和Sox10蛋白质染色阳性率均达90%以上,鉴定为肠神经胶质细胞。结论:我们建立了一种简便的分离与鉴定胚胎小鼠肠神经胶质细胞的方法,今后可以用于EGCs自身功能及与其他肠道细胞相互作用的研究。     

人脐带间充质干细胞生物特性比较:胰酶冷消化和组织块法体外培养

背景:以往采用胰酶冷消化法培养脐带间充质干细胞的研究较少。目的:比较两种方法体外培养人脐带间充质干细胞的生物学特性。方法:采用胰酶冷消化法和组织块法从人脐带中分离、纯化和传代培养人脐带间充质干细胞,记录首次出现贴壁细胞时间及原代培养周期,倒置相差显微镜观察脐带间充质干细胞的形态及生长情况,制作第3代脐带间充质干细胞生长曲线,流式细胞仪分析检测第3代脐带间充质干细胞表面标志的表达,第3代脐带间充质干细胞加入成神经诱导培养基诱导分化第3天行荧光免疫化学染色检测Nestin的表达。结果与结论:使用上述两种方法均可获得脐带间充质干细胞,胰酶冷消化法首次出现贴壁细胞时间早于组织块法(P0.05);原代培养周期差异无显著性意义(P0.05)。倒置相差显微镜下细胞均为贴壁生长,形态为成纤维细胞样,但胰酶冷消化法培养的少数原代细胞呈多角形,不规则,细胞的体积较组织块法大。组织块法获得第3代细胞的增殖速率显著快于胰酶冷消化法,在进入对数生长期后各个时间点细胞数量差异有显著性意义(P0.05)。两种细胞具有均一的细胞表型,均表达CD29,CD105,不表达CD34,CD45。两种方法培养出来的第3代脐带间充质干细胞经诱导后,免疫荧光均显示神经干细胞特征性标志物nestin阳性表达。结果表明胰酶冷消化法与组织块法均能培养出脐带间充质干细胞,但组织块法更适合于此类细胞的培养,对细胞的伤害更低。     

人早孕绒毛细胞滋养层细胞培养方法的改良

目的 探索一种简便高纯度的早孕滋养细胞的体外培养方法。方法 采用完整早孕绒毛通过胰蛋白酶联合胶原酶消化法分离,Percoll梯度分离法提纯体外培养,应用光镜HE染色和免疫细胞化学法检测细胞纯度。 结果 CK-7表达阳性细胞数可以达到90%以上。结论 完整绒毛消化和Percoll纯化联合可在短期内获得高纯度、高产量的滋养细胞以供后期试验,方法更加简便。