酶消化法分离大鼠主动脉内皮细胞的改进方法

大鼠来源方便，价格相对较低，并有以往大量的研究基础，故往往成为急慢性实验的动物模型对象，它也是研究动脉粥样硬化的模型之一。但采用体外培养分离大鼠主动脉内皮细胞较困难。笔者曾用酶灌注消化法，机械刮取法及组织贴块法等来分离培养大鼠主动脉内皮细胞，均未取得...     

改良腹主动脉缩窄法建立心肌肥厚模型

目的 通过不同方法缩窄大鼠腹主动脉,比较构建心肌肥厚模型,探讨改良腹主动脉缩窄法(AAC)较传统AAC的优势。方法 实验大鼠45只,分3组,每组15只。假手术组,在左肾上方分离腹主动脉,不做处理;传统组,经腹正中线切口缩窄腹主动脉直径至0.70 mm,持续4周;改良组,在左肾上方缩窄腹主动脉直径至0.45 mm,持续1周。术后测量大鼠收缩末期室间隔厚度(IVSs)、收缩末期左室后壁厚度(LVPWs)。取心脏标本测量心脏指数(HW/BW)及左心室指数(LVW/BW);经HE染色、Masson染色的病理切片,测量心肌细胞横截面积、心肌胶原面积及心肌胶原面积分数。Western blotting检测脑钠肽(BNP)表达水平。结果 相比假手术组,改良组和传统组大鼠IVSs、LVPWs、心脏指数、左心室指数、心肌细胞横截面积、心肌胶原面积、心肌胶原面积分数和BNP表达水平差异均显著(P<0.05)。在改良组和传统组组间,这些指标差异无统计学意义。结论 与传统方法相比,改良腹主动脉缩窄法用时短,稳定,模型均一,易复制,心肌肥厚相关指标水平表型相似,可作为建立压力负荷性心肌肥厚模型更为理想的术...     

对经腹主动脉灌注固定兔睾丸的实验探讨

组织固定是组织染色的一个重要步骤,固定好,切片染色效果才可能好,实验的定性、定量结果才可能准确[1、2]。组织固定有浸润固定和灌注固定两种方法,灌注固定又分全身灌注固定和局部灌注固定,有作者认为局部灌注固定效果比全身灌注固定好[3],兔睾丸组织的灌注固定采用的是全身灌     

瞬间热处理大鼠主动脉内皮细胞分离培养法

血管内皮细胞体外培养使深入研究内皮细胞成为可能。目前人脐静脉、牛或猪主动脉内皮细胞培养已被广泛应用,但存在价格昂贵,来源困难,及制作动物模型诸多不便的缺点。目前研究领域多采用大鼠作为实验动物,因此进行大鼠主动脉内皮细胞体外培养无疑具有广泛的应用价值。但因其分离培养困难仍少应     

胶原酶二步消化法分离培养牛角膜基质成纤维细胞*

背景：获得纯度高、活性强、生物学特性更接近体内状态的角膜基质成纤维细胞是角膜损伤后修复研究的基础。 目的：探索体外培养牛角膜基质成纤维细胞的新方法。 方法：用Ⅰ型胶原酶对牛角膜基质层进行二步消化分离后制成细胞悬液转入培养瓶中培养,取生长良好的细胞进行传代培养。采用锥虫蓝染色检测消化分离后细胞即刻存活率;倒置相差显微镜动态观察细胞的生长状态;波形蛋白免疫组织化学染色鉴定角膜成纤维细胞;MTT法检测细胞增殖情况;取处于对数生长期的细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群倍增时间。 结果与结论：在体外成功分离培养牛角膜基质成纤维细胞,显微镜下观察及波形蛋白免疫组织化学染色后证实所培养的细胞为角膜基质成纤维细胞。锥虫蓝染色,细胞即刻成活率达93.5%。细胞生长曲线近似“S”形,其群体倍增时间为        38.70 h。说明二步消化法细胞培养技术简便、经济、高效,为原代培养角膜基质成纤维细胞提供了有效渠道。 关键词：角膜;成纤维细胞;细胞原代培养;细胞形态;生物学特性;消化法 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.07.015     

改良原代大鼠肝细胞的体外分离培养和功能研究

目的建立经济有效且功能良好的原代肝细胞体外分离培养系统。方法采用0．02％胶原酶和Percoll分离液分离纯化大鼠肝细胞．光镜和电镜下观察HepatoZYME-SFM培养的肝细胞形态，自动生化仪定期检测培养肝细胞功能，RT—PCR半定量方法检测白蛋白mRNA，高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）分析安定代谢能力。结果分离纯化的大鼠肝细胞总数（2-3）×10^8 cells／整肝，活力和纯度大于95％，生长良好形态正常。培养3d后ALT、AST显著下降，加入NH4Cl后8d内BUN保持相对稳定高水平，白蛋白合成在第3-4天达到高峰，培养的2～5d内肝细胞可有效清除安定。结论通过使用低浓度胶原酶灌流、Pereoll分离液纯化以及HepatoZYME—SFM无血清培养基培养，肝细胞可有效保持良好形态结构和一定的生物合成代谢能力。     

分次胶原酶消化法分离、培养成人肺微小动脉平滑肌细胞

目的：建立一种简便、高效分离和培养成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法并鉴定该方法培养的传代细胞生物学特性。方法：分次胶原酶消化法与传统胶原酶消化法进行细胞获得率、细胞存活率及培养成功率比较;绘制生长曲线对原代与传代细胞的生长特性进行分析;细胞形态学观察、平滑肌肌动蛋白（SMα-actin）测定及细胞免疫荧光化学法进行细胞鉴定及纯度计算;比较原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、染色体数量及形态。结果：分次胶原酶消化法优于传统胶原酶消化法,细胞获得率（3.10±0.29 vs 1.20±0.35）×108 cells/L、细胞存活率(69% vs 21%)及培养成功率（61.5% vs 16.7%）（P＜0.01);传代细胞长至融合时间7 d快于原代细胞21 d;细胞显典型的“峰-谷”状生长,胞浆内表达SMα-actin,细胞纯度达98%以上;原代与第10代细胞形态、SMα-actin含量、二倍体数量（78.13% vs 76.47%）及形态无明显差别（P＞0.05）。结论：分次胶原酶消化法是一种简便、可行,获得高纯度、功能良好的成人肺微小动脉平滑肌细胞的方法。经过此方法分离、培养的细胞在10代以内传代培养细胞生物学及遗传学特性稳定,可用于实验。     

猪肝细胞分离方法的改良

目前 ,在供体器官短缺的情况下 ,大家公认猪是最合适的异种器官和组织的提供者 ,用猪肝细胞治疗急性肝衰病人已有报道。如何将肝细胞最大限度完整地、无损伤地分离出来 ,这是非常关键和重要的一步。我室在进行猪肝细胞的分离中 ,逐渐探索出一套比较行之有效的方法。材料与方法 :采用中国实验用小型猪 ,常规麻醉、消毒、开腹 ,用 D- Hank′s液进行肝脏原位灌注 ,再用 0 .0 2 % EDTA- Hank′s液( 37℃ )灌注 1 8～ 2 0 min,摘取肝脏行多点灌注 5 min,置肝脏于 6 0目钢网上 ,用直剪迅速剪开肝脏被膜 ,用镊子夹起轻轻抖动 ,并用1 6 4 0液冲洗…     

Ⅱ型胶原酶消化法可短时间获得大量纯化大鼠关节软骨细胞

背景：建立一种经济、快捷、切实可行的软骨细胞分离培养体系对于软骨体外实验研究有着重要的意义。 目的：探讨与改进大鼠关节软骨细胞的培养方法。 方法：无菌条件下取新生1周龄SD雄性大鼠双侧髋及膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化法分离软骨细胞并进行原代、传代培养及鉴定。 结果与结论：倒置相差显微镜下见原代培养的软骨细胞12 h后开始贴壁,3 d左右可形成单层,4 d左右即可传代。传至第6代后,部分细胞变为梭形;第7代后,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状,增殖能力减弱。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞核呈异染性,免疫荧光染色显示培养的软骨细胞Ⅱ型胶原呈阳性表达。说明采用此方法可在短时间内获得大量纯化的大鼠软骨细胞。     

改良酶消化法分离培养人乳牙牙髓干细胞

背景：乳牙牙髓干细胞具有极强的增殖活力,可以在短期内获得组织工程需要的细胞量。 目的：比较传统酶消化法和改良酶消化法获取人乳牙牙髓干细胞的成功率及生物学特性。 方法：取无龋滞留乳切牙12 颗,随机数字表法均分为两组,分别应用传统酶消化法和改良酶消化法分离获取乳牙牙髓细胞,在不同代次细胞中检测细胞扩增天数、收获量、生长曲线、倍增时间、克隆形成率、细胞表面特异标记物STRO-1、CD146、CD34 和CD45 的表达。细胞成骨、成脂诱导分化能力及通过检测碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白表达水平,判定细胞牙向分化潜能。 结果与结论：两组细胞生长曲线,扩增天数、细胞收获量及细胞倍增时间相比,差异有显著性意义(P <0.05);牙向分化实验结果显示,改良酶消化法碱性磷酸酶和牙本质涎蛋白较传统酶消化法和对照组而言呈强阳性表达。然而,两组在克隆形成率、细胞表面特异标记物及多项诱导分化等方面差异无显著性意义(P > 0.05)。说明改良酶消化法与传统酶消法相比,可在较短时间内完成同源乳牙牙髓干细胞体外扩增培养,可为牙齿再生治疗提供高质量种子细胞,是乳牙牙髓干细胞体外培养的可靠方法。     

腹主动脉缩窄法致大鼠心肌纤维化模型的建立

目的用腹主动脉缩窄法建立大鼠心肌纤维化模型。方法16只雄性SD大鼠随机分为腹主动脉缩窄组（模型组）及假手术组。分别比较两组左室心肌质量指数、左室心肌病理形态HE染色及左室心肌胶原染色等指标造模4周及造模8周时的变化。结果模型组造模4周及8周时左室重量指数（LVMI）较假手术组显著升高（P〈0.05）。胶原染色、HE染色及超微结构等病理变化,模型组造模4周、8周较假手术组改变明显;假手术组4周及8周时基本一致。结论SD大鼠在腹主动脉缩窄术后4周即可达心肌纤维化模型。     

己酮可可碱和PGE1缓解大鼠腹主动脉缺血/再灌注损伤

为探讨己酮可可碱 (PTX)和前列腺素E1脂微球载体试剂 (LipoPGE1)对腹主动脉缺血 再灌注 (I R)损伤的保护作用 ,对大鼠行腹主动脉I R ,在阻断前、术中再灌注 1h、再灌注 4 8h采集假手术组、I R组、PTX治疗组、LipoPGE1治疗组、PTX和LipoPGE1联合治疗组静脉血 ,采用酶联免疫实验方法测定肿瘤坏死因子 (TNF α)、白细胞介素IL 1β、IL 8的含量。应用SAS8 1对实验数据进行双因素方差分析 ,两两比较用SNK q检验。结果显示PTX治疗组、Li poPGE1治疗组、联合治疗组可显著降低血浆TNF α、IL 1β、IL 8的含量 ,联合治疗组和PTX治疗组、LipoPGE1治疗组相比有显著性差异。提示PTX和LipoPGE1可降低促炎细胞因子 ,而联用PTX和LipoPGE1可取得更好的效果 ,减轻机体的炎症反应。     

Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞

背景：目前关节软骨细胞的分离培养技术已经比较成熟,但是研究中发现通过目前技术培养的软骨细胞生长周期慢,容易出现退变现象,不利于后续试验的进行。 目的：改进并探讨4周龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞的分离与培养的方法。 方法：无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨,采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法,分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养;采用形态学观察,甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对关节软骨细胞进行鉴定;MTT法检测关节软骨细胞增殖情况。 结果与结论：倒置显微镜下见膝关节软骨分离的原代软骨细胞6 h后开始贴壁,72 h可形成单层,96 h即可传代;前3代软骨细胞表型稳定,增殖力良好;第4,5代软骨细胞增殖能力减弱,绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色,细胞核染成深蓝色;免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色阳性表达;MTT法检测表明前3代软骨细胞增殖差异无显著性意义(P > 0.05),且第1-3代与4代软骨细胞在培养第4-7天时,吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05),与第5代软骨细胞在培养1-7天时,吸光度值差异有显著性意义(P < 0.05)。提示采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法能够获得大量生长速度快且不宜退变的新西兰大白兔膝关节软骨细胞,且培养的前3代新西兰兔膝关节软骨细胞最为适宜。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

糖尿病大鼠腹主动脉零应力状态

目的：通过腹主动脉零应力状态的研究，探讨糖尿病，高血压大鼠血管力学特性重建的规律。方法：用链脲佐菌素（STZ）分别诱导SD和自发性高血压大鼠（SHR），建立伴有高血压的糖尿病（SHRDM）和不伴有高血压的糖尿病（SDDM）动物模型，利用生物显微镜和图像分析系统对其腹主动脉张开角进行观测。结果：（1）SD组大鼠主动脉张开角在病程1周到4周加大，其后缓慢减小，8周后趋于平衡。（2）SDDM组大鼠主动脉张开角1－4周急剧升高，4－8周急剧降低，16周后又急剧升高，8周，16周时SDDM小于SD（P＜0．05），4周和24周时SDDM大于SD（P＜0．01），（3）SHR张开角的变化趋势恰与SDDM相反，且在1周，8周，16周时大于SD（P＜0．01），而4周又小于SD（P＜0．05）。（4）SHRDM张开角的变化与SDDM趋势相似，但4周时小于SDDM（P＜0．01），8，16周时大于SDDM（P＜0．05），结论：糖尿病，高血压大鼠主动脉壁零应力状态异常，在病程早期两者的变化趋势相反，提示高血压和糖尿病大血管壁均存在明显的不均匀生长，但是不均匀性生长的方式不同。     

糖尿病大鼠腹主动脉零应力状态

用链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）分别诱导SD和自发性高血压大鼠（SPontaneouslyhypertensiVerats,SHR）,建立伴有（SHRDM）和不伴有（SDDM）高血压的糖尿病动物模型,以SHR大鼠为高血压对照,以SD大鼠为正常的对照组,每组再分为1、4、8、16、24周5个时根点,每个时相点5只动物。利用生物显微镜和图像分析系统对其腹主动脉零应力状态进行研究。用血管的张开角表示其零应力状态。研究结果显示,SD主动脉张开角1周到4周有个急剧加大的过程,其后缓慢减小,至16周后又有所恢复。SDDM加大了SD的上升和下降两段趋势,8周,1…     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37 ℃超过30 min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。 目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。 方法：采用4 ℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18 h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。 结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×10⁶,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

多次胶原酶消化法培养小鼠椎间盘髓核细胞

背景：椎间盘为无血运组织,椎间盘髓核细胞为分化终末细胞,细胞增殖能力较差,体外培养难度较大。 目的：探索小鼠椎间盘髓核细胞体外分离培养的方法。 方法：取小鼠椎间盘髓核组织,使用多次胶原酶消化的方法,分离培养髓核组织细胞,接种,传代,取第2代细胞,分别采用免疫细胞化学和RT-PCR方法检测椎间盘髓核细胞特征性分泌物Ⅱ型胶原和聚合蛋白的分泌量及mRNA的表达,并与软骨细胞,成骨细胞及成纤维细胞进行比较。 结果与结论：椎间盘髓核细胞贴壁后呈现软骨细胞的形态;Ⅱ型胶原和聚合蛋白染色均为阳性;Ⅱ型胶原和聚合蛋白mRNA表达与软骨细胞相同,与成纤维细胞和成骨细胞存在明显差别。说明多次胶原酶消化的方法可以获得大量纯净的椎间盘髓核细胞,性状稳定。     

实验性低血压大鼠腹主动脉的形态结构重建

目的研究低血压状态下腹主动脉重建的规律,探讨腹主动脉的应力生长关系。方法在大鼠在肾动脉起点以下缩窄腹主动脉,建立实验性低血压大民模型,按不同的时相点,在血管组织切片上,观察腹主动脉的几何形态指标及其显微结构成份的变化。结果低血压导致腹主动脉几何形态、平滑肌、胶原纤维及弹性纤维呈“负增长”状态。结论腹主动脉壁面积减小出现早,趋势最稳定,且在各个时相点之间“负增长”率及总“负增长”幅度最大,是低血压大鼠动脉重建的特征性几何形态学指标。在血管三种显微结构成分中,平滑肌对应力的反应最敏感,总“负增长”幅度最大,是影响腹主动脉重建的主要因素。     

中药CPI对糖尿病大鼠腹主动脉顺应性影响

用STZ分别诱导SD和SHR大鼠建立伴有和不伴有高血压的糖尿病动物模型。不伴有高血压的糖尿病大鼠随机分为非药物治疗组（SDDM）、氨基抓治疗组（SDAG）、和CPI治疗组（SDCPI）;伴有高血压的糖尿病大鼠亦随机分为非药物治疗组（SHRDM）、银杏叶总黄酮治疗组（SHRY）和CPI治疗组（SHRCPI）。6组大鼠再按糖尿病病程分1、4、8、16‘24周5个时相点。除SHRYI、4周时各为4只外,其它各时相点动物各5只。对其腹主动脉在体顺应性进行研究。结果显示,各腹主组动脉顺应性均呈下降趋势。SDCPIS周起大于SDDM（P＜0．05或P＜0.01…