体外分化过程中小鼠拟胚体的细胞学特征及基因表达模式

目的探讨小鼠胚胎干细胞来源的拟胚体(EBs)形成以及分化发育90d过程中的形态学特征及基因表达模式。方法将小鼠胚胎干细胞通过悬浮培养获得EBs,EBs在不添加其他诱导因子的体系中连续悬浮培养,采用形态学观察、免疫组织化学染色和RT-PCR检测EBs培养过程中的细胞发育分化特征和基因表达模式。结果将胚胎干细胞转移到去除白血病抑制因子(LIF)的悬浮培养液中培养24h左右即可形成EBs;培养3d左右,部分EBs出现简单胚体结构;在EBs分化7d左右,逐步向空腔化胚体发育;培养9d左右,EBs可发育为原始的囊性胚体结构;培养11d左右,EBs形成典型的、结构完整的三胚层结构。HE染色结果显示,发育早期的EBs包含大量尚未完全分化的ES细胞,随着培养时间的延长,EBs向空腔化、囊性胚体发育,逐渐形成类似于早期组织的形态。悬浮培养7周左右,EBs的发育分化基本停止。免疫组织化学染色结果表明,中胚层心肌细胞特异性标志蛋白cTnT,外胚层特异性标志蛋白Nestin在15d的EBs中表达呈阳性。RT-PCR检测也显示形成的EBs表达外胚层特征性基因Vimentin、Nestin,中胚层特征性基因Flk-1、Gata-1和内胚层特征性基因Transthyretin、-αfetoprotein。结论小鼠胚胎干细胞来源的EBs具有分化为3个胚层的能力,EBs形成的三维结构能够有效的启动细胞的分化;EBs来源的三胚层细胞的发育分化时序和特征,将为鉴定胚胎干细胞来源的分化细胞提供重要参照。     

人包皮成纤维细胞来源的多能性干细胞的建立

目的 探讨人包皮成纤维细胞重编程为诱导多能性干细胞(iPSCs)的方法.方法 利用反转录病毒携带绿色荧光蛋白(GFP)作为指示,转导到人包皮成纤维细胞中,确定最佳的病毒感染剂量,应用经典的Yamanaka方法,联合小分子物质组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸盐( VPA)诱导人包皮成纤维细胞为多能性干细胞.通过碱性磷酸酶(AKP)染色及免疫荧光细胞化学方法,检测人胚胎干细胞多能性标记物在所建立的诱导多能性干细胞(iPSCs)中的表达,RT-PCR检测拟胚体(EB)三胚层特异基因的表达.结果 以GFP作为指示,建立了高效的反转录病毒感染体系,将人包皮成纤维细胞重编程为iPSCs;所建立的iPSCsAKP染色阳性,表达人胚胎干细胞多能性标记物OCT4、TRA-1-60和TRA-1-81,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达;小分子物质VPA的添加并未显著提高重编程效率.结论 在GFP所指示的最佳病毒感染剂量下,联合小分子物质VPA成功建立了人包皮成纤维细胞来源的iPSCs.     

无血清培养人胚胎干细胞的体系研究与进展

背景：人胚胎干细胞有永久自我更新和向外、中和内胚层分化的能力,具有重要的基础研究价值和临床应用前景,可应用于再生医学、药物毒性筛选、早期胚胎发育、细胞移植治疗和基因治疗等领域,但是在限定条件下的大规模细胞培养、控制和定向分化技术的发展仍然具有实质性的挑战。在治疗应用方面,许多研究者试图建立可在无异源限定性和规模化培养体系中维持细胞多能性的培养方法。 目的：综述近几年报道的人胚胎干细胞的无血清培养体系研究进展,重点是在发展适于治疗用途的无血清和无异源培养体系进程中,面临的挑战和进步。 方法：应用计算机检索CNKI和PubMed学术数据库中2008至2015年关于人胚胎干细胞无血清培养的文章,排除观点重复和陈旧的文章,最后对58篇文章进行归纳汇总。 结果与结论：研究者已经在使用人源性饲养层细胞、无饲养层基质及限定性成分培养基上做了许多尝试,旨在选择合适的基质和培养基,使异源性成分达到最小化或者不使用,以求获得临床级别的细胞株。但是目前的细胞制品距离临床应用还有很大的距离,仍有很多问题需要解决,比如细胞制品的规范化、标准化、个性化定制等。相信随着干细胞研究和行业的规范,胚胎干细胞产品将会在临床得到广泛应用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程     

无血清单层细胞诱导法培养猪诱导多能性干细胞定向分化为血管内皮细胞

背景:诱导多能性干细胞是一种新型的干细胞来源,具有多向分化潜能。猪作为人类心血管及代谢性疾病研究的良好模型,对其多能性细胞向血管内皮细胞定向分化体系的建立,将为创建心血管疾病模型提供保障。目的:建立一种无血清单层诱导分化方法,使猪诱导多能性干细胞定向分化为CD31阳性血管内皮细胞,并对获得的内皮细胞进行鉴定。方法:使用CHIR99021、骨形态发生蛋白4、碱性成纤维生长因子、血管内皮生长因子等对猪诱导多能性干细胞和人胚胎干细胞进行单层细胞诱导分化,使干细胞经历3个分化阶段最终成为血管内皮细胞,检测并比较分化过程中2种干细胞的胚层标记基因的表达,对流式分选后获得的血管内皮细胞进行鉴定。结果与结论:①通过无血清单层细胞诱导法从猪诱导多能性干细胞定向诱导分化获得的内皮细胞具有与猪永生化主动脉血管内皮细胞类似的基因表达模式及生物学功能——能够吸收低密度脂蛋白并在Matrigel上形成微血管样结构;②该诱导体系下,猪诱导多能性干细胞的分化效率高于人胚胎干细胞的分化效率,这可能与诱导过程中2种细胞谱系基因表达模式上的差异相关。     

建立并鉴定一种基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案北大核心

背景:人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞特性高度类似的多能干细胞类型,具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力。将人诱导多能干细胞定向分化成具备功能的肝脏细胞对临床肝脏替代治疗意义重大。目的:建立一种高效的基于人诱导多能干细胞的肝脏细胞定向分化实验方案。方法:利用明场显微镜、免疫荧光对人诱导多能干细胞特性进行鉴定。通过转录因子重组蛋白手段时序性调控不同信号通路,即在第0,5,10,15天顺序加入激活素A、成纤维细胞生长因子4/骨形态发生蛋白4、肝细胞生长因子、肿瘤抑制因子M,使多能干细胞经历终末内皮层、肝内胚层、肝母细胞(肝脏前体细胞)最终分化成为有功能的肝脏细胞。利用明场显微镜、实时定量PCR(qPCR)、ELISA动态观察不同阶段形态特征和分子标记物。结果与结论:①所使用的人诱导多能干细胞具备经典的诱导多能干细胞形态特征并且高表达诱导多能干细胞特异标记蛋白(SSEA4、SOX2、OCT4);②人诱导多能干细胞发生了终末内胚层、幼稚肝细胞、肝脏细胞不同阶段形态转变;③qPCR结果显示,随着肝细胞分化进展,诱导多能干细胞特异标记物(OCT4)显著下调,终末内胚层(GCS、CXCR4)和肝脏内胚层标记物(HNF4α、HNF1β)则呈现先升高再下调趋势,而肝脏细胞标记物(CYP34A、ALB)则呈现出逐渐递增趋势;④ELISA结果进一步显示,诱导15 d以后的肝脏细胞开始具备肝特异蛋白(白蛋白、尿素)分泌功能,并且随着时间延长其分泌功能进一步增加;⑤上述结果提示,成功建立人诱导多能干细胞向肝脏细胞定向分化的实验方案,为未来临床肝脏细胞替代治疗提供实验基础。     

诱导多能干细胞建系及体外造血祖细胞定向分化体系的建立

背景：目前,大量文献报道了诱导多能性干细胞系的建立,但大规模体外诱导分化造血祖细胞的研究还缺乏深入的探讨。 目的：建立诱导多能性干细胞体外定向诱导形成造血祖细胞的方法。 方法：采用慢病毒感染的方法将含有Oct4、Sox2、Nanog和Lin28全能性基因的慢病毒颗粒转导人皮肤成纤维细胞,获得了诱导多能性干细胞;在诱导分化体系中添加了Y-27632,克服干细胞扩增中的凋亡现象;运用OP9细胞产生的条件培养液建立诱导多能性干细胞体外定向分化形成造血祖细胞的分化体系。 结果与结论：①前3代细胞克隆传代时,诱导多能性干细胞发生凋亡的现象很多,很难大规模扩增培养。培养基中添加阻断ROCK活化的抑制剂,能够明显抑制胚胎干细胞的凋亡。②诱导多能性干细胞在OP9细胞条件培养液作用下,经过体外诱导分化,形成CD34+造血祖细胞。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

人原始生殖细胞的研究现状

迄今为止干细胞有三种生殖细胞来源:(一)胚胎生殖细胞(EGs):来自原始生殖细胞(PGC);(二)胚胎癌性细胞(EGCs):可由成人睾丸肿瘤得到;(三)多能生殖干细胞(GSCs):已由小鼠精原干细胞的培养得到[1]。PGC在体外分离培养,建系成功后改称为胚胎生殖细胞。类胚体实验表明,EG细胞可分化形成包括所有3个胚层的组织细胞,证明其具有多能性,与胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)具有相似的多向分化潜力,因此ES细胞在发育生物学基础研究、动物胚胎工程和临床医学上具有重要的作用和诱人的前景。人EG细胞的研究对生命科学的发展有重要意义。…     

叙利亚地鼠原始生殖细胞体外培养方法的初步研究

为建立叙利亚地鼠原始生殖细胞的体外培养方法．在体外无菌分离孕龄10．5d的叙利亚地鼠胚胎的生殖嵴，采用酶机械分离方法获取原始生殖细胞，在条件培养基中培养于饲养层细胞上，然后用酶组织化学染色方法鉴定碱性磷酸酶（ALP）的活性。去除分化抑制因素并诱导原始生殖细胞体外分化后．观察拟胚体和分化细胞的产生。实验结果显示孕龄10．5d的地鼠胚胎生殖嵴．用酶机械分离方法能成功地分离出具有发育多能性的原始生殖细胞，ALP染色鉴定呈强阳性，体外诱导分化后可观察到3种胚层来源的细胞。结果提示该细胞体外培养体系的建立，为生物医学工程学提供了一种新的细胞来源。     

成人骨髓来源的多系分化持续应激细胞的培养及鉴定

目的:建立一套简便可靠的多系分化持续应激细胞(Muse)体外分离、培养和鉴定体系。方法:利用密度梯度离心法从健康成人骨髓中分离出人骨髓基质干细胞(hBMSCs),流式细胞仪对其进行鉴定;应用长时间胰酶应激法从hBMSCs中分离出Muse细胞;免疫荧光细胞化学法对其进行鉴定,并检测其多能干细胞特性及向三胚层分化的能力。结果:hBMSCs呈CD45~-/CD11b~-/CD90~+;长时间胰酶应激法成功分离出Muse细胞,悬浮呈球状生长;Muse细胞表达SSEA3~+/CD105~+,Nanog、Oct4、Sox2等多能干细胞标记物表达阳性,贴壁分化后表达三胚层标记物α-SMA、AFP和NF-M。结论:从成人骨髓中成功分离Muse细胞,Muse细胞具有多能干细胞特性及向三胚层分化的能力。     

子宫内膜基质细胞作为饲养层培养人胚原始生殖细胞

目的探讨子宫内膜基质细胞作为饲养细胞培养人胚原始生殖细胞的可能。方法从5—9周人胚胎生殖嵴、中肾嵴、肠系膜中消化分离原始生殖细胞(PGCs),种植于经丝裂霉素c处理的人子宫内膜基质细胞饲养层上培养。结果PGCs可以在体外培养3个多月,传14代。这样培养的PGCs表达胚胎干细胞的多种标志,如碱性磷酸酶染色、SSEA和TRA抗原等。另外细胞保持正常的染色体核型。结论人子宫内膜基质细胞可以作为饲养细胞在体外培养人胚原始生殖细胞,保持未分化状态。     

多潜能干细胞的研究进展

多潜能干细胞是一类具有向外胚层、中胚层以及内胚层细胞分化的干细胞,从胚胎发育早期分离获得的胚胎干细胞、胚胎生殖细胞到成体组织骨髓、睾丸中获得的干细胞,都具有三胚层分化能力.近年来,研究证实,可以将成体分化细胞经基因操作逆转为多能干细胞.就各种来源多潜能干细胞的特点予以综述,并对细胞间可能存在的关系加以探讨.     

人脂肪间充质干细胞向限定性内胚层细胞分化体系的优化

目的探讨activin A、WNT通路激活剂、BMP4以及bFGF信号对人脂肪间充质干细胞(hADSCs)向限定性内胚层(DE)分化的影响。方法基于胚胎干细胞(ESCs)或多潜能干细胞(iPS)向DE分化的诱导体系,建立并优化hADSCs向DE细胞分化的诱导体系。在hADSCs向DE诱导体系中,分别比较不同浓度的activin A、Chir99021替代Wnt3a、添加/去除bFGF以及BMP4等对分化效率的影响。用RT-qPCR检测诱导前后限定性内胚层标志基因FOXA2和SOX17的表达;Western blot检测FOXA2和SOX17蛋白水平;用免疫荧光检测FOXA2和SOX17的表达,鉴定DE分化。结果与ESCs或iPS向DE分化的诱导体系相比,低浓度的activin A,GSK3抑制剂Chir99021替代Wnt3a,去除BMP信号和bFGF信号的诱导方案可以明显促进hADSCs向DE分化的影响(P0.01)。结论 hADSCs向DE分化与hESC/hiPS相比,需要激活不同信号通路,因此最适诱导体系不同。     

类胚体中残留胚胎干细胞数量与其致瘤性相关性的初步研究

目的 探讨类胚体(EBs)中残留未分化胚胎干细胞(ESCs)的数量与其致瘤性的相关性.方法 小鼠R1胚胎干细胞株,体外类胚体诱导分化10d,流式细胞仪检测残留未分化ESCs表面标志SSEA-1阳性率.将第10天EBs消化打散后重新给予ESCs常规培养体系培养,观察EBs中残留未分化ESCs形态,流式细胞仪检测残留细胞表面标志物;第10天EBs消化打散后以104～2×106细胞量分别注射至裸鼠四肢肌肉内,观察不同细胞数量与畸胎瘤形成的相关性.结果 ESCs分化为EBs 10 d后有(13.5±0.75)%的细胞表达SSEA-1,提示存在残留未分化ESCs.残留未分化细胞生长形态呈克隆样,高表达SSEA-1等未分化ESCs标志.EBs消化打散后仅在注射2×l06个细胞的部位形成畸胎瘤,瘤体组织中存在成熟的内胚层、中胚层和外胚层组织,其余各组均未见畸胎瘤的形成.结论 胚胎干细胞分化为类胚体后仍存在残留未分化胚胎干细胞,并需要一定细胞数量才具有致瘤性.     

骨髓基质细胞对共培养条件下的脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的诱导

目的：研究骨髓基质细胞对共培养条件下脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的情况。方法：从孕龄13 d的胚胎大鼠脊髓组织中分离神经干细胞,采用含EGF及bFGF的无血清限定性培养基培养,并通过与骨髓基质细胞进行共培养,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,用细胞免疫荧光染色鉴定分化结果。结果：从胚胎脊髓中分离得到大量的神经干细胞,通过限定性培养基培养可获得干细胞球,与骨髓基质细胞共培养可被诱导分化,用细胞免疫荧光染色鉴定,可见有胆碱能神经元生成。结论：胚胎大鼠脊髓源神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并保持稳定的性状,在与骨髓基质细胞共培养时,可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

一种人诱导多能干细胞向内皮细胞定向分化方案的建立及鉴定

背景：人诱导多能干细胞是一种与胚胎干细胞性状高度类似的多能干细胞,其具备三胚层分化潜能和持续自我更新能力,因此能够为临床细胞替代治疗提供足量目的细胞。目的：构建并鉴定一种高效的基于人诱导多能干细胞的内皮细胞定向分化实验方案。方法：采用免疫荧光技术对人诱导多能干细胞干性和增殖活性进行鉴定。采用转录因子重组蛋白和小分子化合物时序性调控系列信号通路,即在第0,1,2,5天顺序加入激活素A、GSK通路抑制剂CHIR99021/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/骨形态发生蛋白4、碱性成纤维细胞生长因子/血管内皮生长因子/CHIR99021,人诱导多能干细胞经历心脏中胚层、内皮前体细胞命运转变并最终分化成为有功能的内皮细胞。采用明场显微镜、实时定量PCR、免疫荧光动态观察不同阶段细胞形态特征和分子标记物,采用血管成环实验验证内皮细胞的体外血管形成功能。结果与结论：(1)人诱导多能干细胞内源性高表达诱导多能干细胞干性特异标记物(OCT4、NANOG、SSEA4)和增殖标记物(Ki67);(2)开始分化后的人诱导多能干细胞经历了诱导多能干细胞、心脏中胚层、内皮前体细胞、内皮细...     

人胚胎干细胞在无血清mTeSR?1培养基中维持培养和向内皮细胞的诱导分化

背景：传统的人胚胎干细胞培养扩增方法中应用含动物血清培养基,并依赖饲养层细胞培养,这种培养方法显著制约了干细胞的体外培养规模;另外异源动物血清成分介入,使病原污染及免疫排斥的概率显著增加。 目的：明确应用无血清培养基mTeSR?1对人胚胎干细胞进行长期体外培养的可行性,并建立诱导人胚胎干细胞分化为血管内皮细胞的相关技术平台。 方法：采用无血清培养基mTeSR?1以非饲养层细胞依赖的方式体外培养、扩增人胚胎干细胞株H9。经过40余次体外传代后,于倒置显微镜下观察其生长形态,并利用免疫荧光染色方法评估其细胞表型。此外,应用条件培养基诱导H9细胞株向内皮细胞方向分化。利用免疫荧光染色技术,定量RT-PCR以及低密度脂蛋白摄取实验对该胚胎干细胞源内皮细胞的表型及功能进行评价、分析。 结果与结论：mTeSR?1培养基能够支持H9细胞株在体外以非饲养层依赖的方式进行长期扩增,同时维持其未分化的干细胞潜能。添加血管内皮细胞的条件培养基能够定向诱导H9细胞向内皮细胞方向分化。该胚胎干细胞源内皮细胞不但表达内皮细胞的标志基因(kdr,pecam)和标记蛋白CD31,而且还能够摄取低密度脂蛋白,形成类似微血管结构。提示实验中所提供的培养及诱导分化体系能够支持胚胎干细胞的增殖与分化行为。     

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞（ESCs）分化为心肌样细胞的诱导作用。方法 收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α－肌动蛋白（α-Actin）的表达。结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一。结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。     

巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞的研究

目的探讨巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程为诱导多能性细胞的方法。方法应用经典的逆转录病毒介导方法,将Oct4,Sox2,c-Myc和Klf4四种人源性转录因子转导入巴马小型猪的胎儿成纤维细胞中,建立形态和特征类似猪上胚层细胞来源的猪多能性细胞(pig induced pluripotent cells,piPCs)。免疫荧光化学方法检测多能性细胞标记物,RT-PCR检测了该细胞体外三胚层相关基因表达水平。结果巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程的piPCs细胞呈AKP染色阳性,体外长期传代都保持正常的染色体核型,猪上胚层多潜能性细胞标记分子Oct4,Sox2,Nanog,Tra-1-60,Tra-1-81和SSEA-4呈阳性表达,并且表达小鼠胚胎干细胞(ES)多潜能性细胞标记分子SSEA-1,体外诱导分化后具有三胚层特异基因的表达,但是体内分化能力存在缺陷。结论巴马小型猪胎儿成纤维细胞重编程成功诱导成多能性细胞。     

小鼠来源诱导多能干细胞定向分化为神经元的体外实验研究*

 目的： 探讨源于小鼠的诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）体外定向分化为神经元的方法,为大量稳定地获得神经元及提供种子细胞治疗脊髓损伤奠定体外实验基础。方法: 源于小鼠的iPSCs在不同的诱导培养基中经悬浮、贴壁、再悬浮和再贴壁培养。免疫荧光检测iPSCs多能性标志物、神经干细胞及其分化细胞标志物的表达。RT-PCR检测神经元及胶质细胞基因表达并行神经元基因测序鉴定,流式细胞术检测iPSCs定向分化为神经干细胞及进一步分化为神经元的比例。结果: 源于小鼠的iPSCs表达干细胞多能性标志物Sox2、Oct4和SSEA1。悬浮培养可以形成类球形拟胚体;经诱导及机械分离后的细胞可形成神经球,神经球经诱导后可分化为神经元。免疫荧光显示iPSCs可诱导出表达nestin的神经球,贴壁培养的神经球可分化为分别表达微管相关蛋白2（MAP-2）、胶质细胞原纤维酸性蛋白（GFAP）及髓磷脂碱性蛋白(MBP)的神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。RT-PCR及基因鉴定结果显示形成小鼠神经元;流式细胞术检测结果显示分化细胞中神经干细胞和神经元的比例分别为63.93%±1.47%和21.40%±1.70%。结论: 源于小鼠的诱导多能干细胞能够稳定地在体外定向分化为神经元,为脊髓损伤的治疗提供了一个可靠的细胞来源。     

维甲酸诱导小鼠胚胎干细胞向神经样干细胞分化

目的探讨维甲酸（RA）诱导体外培养的小鼠胚胎干细胞（ESC）向神经样干细胞定向分化。方法在无白血病抑制因子（LIF）存在的条件下，将体外培养的ESC悬浮培养4天，形成拟胚体（EB），再经RA诱导4天后进行细胞冰冻切片，行免疫细胞化学染色计数生殖特异性基因Oct-4和神经干细胞特异性标志物Nestin的表达百分率。结果经诱导的ESC呈现Oct-4阳性细胞百分率为67．34％，而Nestin阳性细胞百分率为36．52％。结论体外培养的小鼠ESC经RA诱导后有部分细胞定向诱导分化为神经样干细胞。