使用PCR-SSP方法检测HLA-DR抗原

目的采用顺序特异引物聚合酶链反应(PCR-SSP)建立人类白细胞抗原DR位点的DNA分型方法.方法合成29个特异性引物和1对阳性对照引物,组成20个PCR反应用于DR位点,建立一步法PCR-SSP.结果所有样本PCR-SSP基因分型获得成功,分型结果经标准DNA,限制性核酸内切酶分析证实符合,特异性和重复性100%.结论 PCR-SSP检测HLA-DR的方法具有快速、准确、特异性高等优点,适合临床应用.     

人类白细胞抗原新等位基因B*07:110的序列分析及确认

背景：近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。 目的：采用序列分析确认1例中国人的人类白细胞抗原新等位基因。 方法：应用聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术进行样本的人类白细胞抗原基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。 结果与结论：聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸探针结果显示,该样本人类白细胞抗原B基因座反应格局出现异常;基因测序结果表明,其B基因座第2外显子序列与所有已知人类白细胞抗原B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列同源性最高的等位基因B*07:01:02的差异是在第2外显子发生了nt 226和nt 228两个A->G核苷酸取代,导致第76位密码子由ATA->GTG,相应的导致氨基酸由异亮氨酸(I)改变为缬氨酸(V)。将其序列提交国际基因数据库(GenBank)及IMGT/HLA数据库,证实该新人类白细胞抗原等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原B*07:110 (HM989017)。中国组织工程研究杂志出版内容重点：干细胞;骨髓干细胞;造血干细胞;脂肪干细胞;肿瘤干细胞;胚胎干细胞;脐带脐血干细胞;干细胞诱导;干细胞分化;组织工程全文链接：     

汉族人群中新等位基因人类白细胞抗原-DPA1*01:11的鉴定

背景：在群体遗传学研究中,发现一个样本人类白细胞抗原-DPA1位点结果异常,而国际上与人类白细胞抗原-DPA1等位基因相关的报道较少。 目的：鉴定一个人类白细胞抗原-DPA1*01相关的新变异等位基因。 方法：在群体遗传学研究中,采用PCR产物直接测序分型方法,对人类白细胞抗原-DPA1基因第2外显子进行双向测序。对出现异常分型结果的样本,进行分子克隆和单倍体测序。 结果与结论：发现一个样本的人类白细胞抗原-DPA1位点结果异常,经分子克隆和单倍体测序,检出了一个正常的人类白细胞抗原-DPA1*01:03和一个DPA1*01相关的新变异等位基因,该新等位基因的序列与DPA1*01:03的序列最接近,其差异是在第二外显子区域的242位碱基发生A>G的替换,并导致了相应的第50位密码子由CAA>CGA,编码的氨基酸残基由谷氨酰胺变成精氨酸。该等位基因为人类白细胞抗原新的等位基因,已被世界卫生组织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原-DPA1*01:11(提交序列号HWS10015443)。     

HLA-Ⅰ类抗原的组织配型基因芯片的建立及应用

目的:应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLA-Ⅰ类抗原中分辨度分型研究,建立稳定的HLA检测芯片.方法:采用寡核苷酸芯片分型方法,依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献,同时考虑遗传的连锁不平衡,及强脊炎、幼年型糖尿病等与HLA密切相关的遗传病等因素,选择了中国人群基因频率较高的等位基因,根据HLA-Ⅰ类不同基因亚型的独特序列,完成了探针的设计与筛选,最后设计了122条探针(HLA-A56条,HLA-B66条)制成基因分型芯片.采用带荧光标记的引物,用合适的PCR方法扩增HLA-Ⅰ类抗原上的多态性区域,产物与芯片上探针杂交.杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断阳性探针,以此确定样品基因型.结果:所有样本的HLA-Ⅰ类抗原基因分型均获成功.此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因,可检出Ⅰ类抗原特异性57个.结论:基因芯片用于HLA-Ⅰ类抗原分型可行.其分辨率高,特异性强,可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查.     

HLAⅠ、Ⅱ类抗原的组织配型基因芯片的建立及应用

目的应用基因芯片技术进行北方汉族人群HLAⅠ、Ⅱ类抗原中分辨度分型研究,建立稳定的HLA检测芯片。方法采用寡核苷酸芯片分型方法,选择了中国人群基因频率较高的等位基因,同时考虑遗传的连锁不平衡,根据HLA-A、HLA-B、HLA-DR、HLA-DQB、HLA-DQA不同基因亚型的独特序列,完成了探针的设计与筛选,共设计了213条探针(HLA-A 56条,HLA-B 66条,HLA-DQA 22条,HLA-DQB 38条,HLA-DR 31条)制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物,用合适的PCR方法扩增HLAⅠ、Ⅱ类抗原上的多态性区域,产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断,以此确定样品基因型。结果所有样本的HLAⅠ、Ⅱ类抗原基因分型均获成功。此中分辨度探针可分出598个Ⅰ类抗原等位基因,511个Ⅰ类抗原等位基因,可检出Ⅰ类抗原特异性57个,Ⅱ类抗原特异性30个。结论基因芯片用于HLAⅠ、Ⅱ类抗原分型可行。其分辨率高、特异性强,可用于HLA基因分型、骨髓移植、器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗传性疾病的人群筛查。     

序列分析及确认HLA新等位基因B*55:46

背景：近几年来,随着中华骨髓库的建立和人类白细胞抗原分型技术的不断发展和提高,中国人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。 目的：探索中国人的人类白细胞抗原新等位基因。 方法：应用PCR-序列特异性寡核苷酸探针基因分型技术,对1名27岁男性汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA基因分型,并应用基于测序的方法分析该基因序列及与最相近等位基因序列的差异。 结果与结论：PCR-序列特异性寡核苷酸探针结果显示该样本HLA-B基因座反应格局出现异常提示;基因测序结果表明其B基因座第3外显子序列与所有已知HLA-B等位基因序列均不一致,在所检测的第2、3外显子中,与序列最相近的等位基因B*55:02:01的差异只是在第3外显子发生了nt 412 A→G一个核苷酸替代,导致第138位密码子由AAC→GAC,相应的编码的天冬酰胺改变为天冬氨酸。将其序列提交国际基因数据库及IMGT/HLA 数据库,证实该HLA等位基因为国际上首次发现,被世界卫生组织织人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为HLA-B*55:46 (HM989018)。     

浙江汉族人群KIR3DL2等位基因的多态性分析

目的探讨浙江汉族人群KIR3DL2等位基因的多态性分布情况。方法KIR3DL2等位基因分型采用聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法，利用引物特异性扩增KIR3DL2基因的两个片段，合成21条探针检测KIR3DL2基因的多态性位点，根据探针的格局判断出样本的KIR3DL2等位基因情况。结果样本中共发现17种探针格局，检测到7种等位基因，其中KIR3DL2＊002等位基因占57％。1例样本无法用现有等位基因探针格局进行分析。结论聚合酶链反应寡核苷酸探针杂交方法可有效检测KIR3DL2等位基因，浙江汉族人群KIR3DL2等位基因的分布有其特点。     

3种分型方法在HLA-B分型中的应用分析

在人类白细胞抗原（Human leucocyte antigen，HLA）的多种分型技术中，以血清学方法、序列特异性引物．聚合酶链反应（Polymerase chain reaction sequence—specific primer，PCR-SSP）方法和多聚酶链反应-序列特异寡核苷酸探针（PCR—sequence—specific oligonucleotide probes，PCR—SSOP）杂交配型技术实用性较强。我们采用此3种方法同时对30份标本进行HLA—B位点进行分型和比较，报道如下：     

人类白细胞Ⅱ类抗原DR、DQ基因型与妊娠期糖尿病的相关性研究

目的探讨人类白细胞II类抗原DR、DQ基因型与妊娠期糖尿病的相关性。方法对26例GDM孕妇及同期入院的42例正常健康孕妇,采用序列特异性引物聚合酶链反应技术(PCR-SSP)检测HLA-II类抗原DR和DQ的等位基因。结果研究中发现,DQA1*0101、DQA1*0201、DQB1*0609、DRB l*07-DQA1*0201-DQB1*0201基因频率在GDM中显著高于正常对照组,两组比较,统计学有差异(Ρ<0.05)。DQB1*0301基因频率在GDM中显著低于正常对照组,两组比较,有统计学差异(Ρ<0.05)。结论人类白细胞II类抗原DR、DQ基因型与GDM的易感性和保护性存在关联。DQA1*0101、DQA1*0201、DQB1*0609、DRB l*07-DQA1*0201-DQB1*0201基因是GDM的易感基因。DQB1*0301基因是GDM的保护基因。     

新等位基因HLA-A*11:97与HLA-B*44:127的确认

背景：近几年来,随着分子生物学的发展及人类白细胞抗原分型技术的提高,人类白细胞抗原新等位基因不断被发现。 目的：识别并确认两个新的人类白细胞抗原等位基因。 方法：应用PCR-SBT、GSSP及单链测序基因分型技术对两份中华骨髓库供者样本进行人类白细胞抗原A,B,DRB1位点进行基因分型,对新等位基因进行DNA测序并与已知同源性最高的等位基因型进行序列比对。 结果与结论：两个样本各有一个位点与目前已知的相应人类白细胞抗原A、B等位基因序列均不一致,样本1与其同源性最高的A*11:01:01的差异表现在第2外显子区域中的193G>T,194C>T,导致第41位密码子由丙氨酸变为亮氨酸,样本2与其同源性最高的B*44:02比较差异表现在第2外显子区域中第320位碱基由G>A,导致编码的第83位密码子由精氨酸变为组氨酸。说明两个样本分别为人类白细胞抗原A 和B位点的新等位基因,并已被WHO 人类白细胞抗原因子命名委员会正式命名为人类白细胞抗原A*11:97和B*44:127。     

建立DNA芯片技术检测丙型肝炎病毒基因型及其初步应用

目的 建立一种简便、快速的以DNA芯片技术为基础的丙型肝炎病毒基因分型检测方法。方法 根据丙型肝炎病毒HCV的基因序列信息设计分型探针，将采用荧光标记的寡核苷酸引物所扩增的丙型肝炎病毒基因产物与结合在芯片上的特异性探针进行快速杂交，通过扫描荧光强度值定性和定量判定结果。结果 应用本法对65例患者血清中的丙型肝炎病毒核酸进行基因分型，对部分标本检测结果与测序法进行对比，吻合率达100％，说明检测结果有很高的特异性。结论 我们所用DNA芯片技术检测HC VRNA及其基因分型，简便、快速、特异性好、灵敏度高、结果判定指标客观，可望在临床推广使用。     

线粒体多态性检测寡核苷酸芯片的构建

目的构建用于线粒体DNA（mtDNA）D-环控制区（D—LOOP区）多态性多个位点集成检测的寡核苷酸芯片。方法根据GenBank中人mtDNA D—LOOP区序列设计2组引物[普通引物和N,N＇-对羧苄基吲哚三菁（Cy5）标记引物]和55种寡核苷酸探针。将探针固定于醛基修饰载玻片表面,制备mtDNA多态性检测芯片。提取40例健康人外周血标本mtDNA,应用Cy5标记引物不对称PCR扩增mtDNA D—LOOP区片段。取未变性和变性后扩增产物分别与芯片进行杂交,观察二者杂交信号强度差异,并将芯片检测结果与DNA测序结果进行比较。观察等倍稀释的不对称PCR扩增产物的杂交信号强度,检测芯片的灵敏度;将DNA测序结果与探针进行BLAST2比对,找出与PCR扩增产物完全匹配和仅1个碱基不匹配的探针,分析二者在芯片上相应位点杂交信号强度的差异,观察芯片的特异性;以放置6个月后的芯片检测外周血mtDNA,观察杂交信号强度的变化。结果不对称PCR扩增获得的mtDNA D—LOOP区片段（466bp）与预期表达片段大小一致。不对称PCR扩增产物直接杂交和变性后杂交的信号强度无明显差异,40例健康人外周血标本mtDNA的芯片杂交检测结果均与DNA测序结果完全吻合。灵敏度检测结果显示,杂交信号强度随扩增产物稀释程度的增加而减弱,芯片检测靶分子的灵敏度为0．1ng;与DNA测序结果完全匹配的探针174和仅相差1个碱基“C”的探针174c的杂交信号强度具有明显差异;而保存6个月后的芯片杂交信号强度基本保持不变。结论构建的寡核苷酸芯片可满足对mtDNA D—LOOP区多态性进行多个位点快速通量检测的需要,具有较高的灵敏度和特异性,适用于法医鉴定及线粒体疾病的检测。     

HLAⅠ类抗原的基因芯片分型技术研究

目的：采用DNA芯片技术进行汉族人群HLAⅠ类抗原A、B位点的DNA分型研究，并实现将A、B位点的DNA分型集中于一张芯片上，同时完成。方法：根据HLAⅠ类抗原A、B位点不同基因亚型的独特序列设计探针，制成分型芯片；待检测样品经PER反应标记上荧光之后，与探针在芯片上进行杂交，通过对杂交产生的荧光信号值进行分析，确定样品的HLA-A、B基因亚型。将这一方法应用于220份样本的HLAⅠ类DNA分型并将部分样品进行基因测序。结果：所有样本的HLAⅠ类基因芯片分型均获得成功，无假阳性和假阴性出现，80份样本的重复率为100％，总耗时2．5h。分型结果经双盲验证完全符合。可准确分辨出A位点等位基因20个，B位点等位基因41个，实际检出汉族人群A抗原特异性13个、B抗原特异性32个。结论：基因芯片用于HLAⅠ类A、B分型技术可行，其分辨率高、特异性强、重复性好、操作简便快速、结果直观，可以在一张芯片上同时检测HLA-A、B位点，并实现一张芯片多人份，适合于临床应用。     

HLA-DQA1基因多态性与HBV感染结局相关

目的探讨中国汉族人群人类白细胞抗原(HLA)-DQA1基因多态性是否与乙型肝炎病毒(HBV)感染结局相关联。方法以213例HBV自限性感染者和420例慢性乙肝患者为研究对象,应用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)技术进行HLA-DQA1基因分型,用EPI和SPSS软件分析DQA1多态性的分布频率及其组间差异。结果DQA1*0102在慢性乙肝组的分布频率显著低于HBV自限性感染组(15.47%比较20.42%,P<0.05),而DQA1*0201在慢性乙肝组的分布频率显著高于HBV自限性感染组(10.48%比较6.10%,P<0.05)。调整性别、年龄等混杂因素影响的非条件logistic回归分析结果显示,与HLA-DQA1其他等位基因相比,携带DQA1*0102者降低慢性乙肝发生的风险(P<0.05,OR=0.69,95%C I:0.49-0.96),而携带DQA1*0201者增加慢性乙肝发生的风险(P<0.05,OR=1.77,95%C I:1.09-2.87)。结论HLA-DQA1基因多态性可能是影响HBV感染结局的重要宿主遗传因素。     

中国海南黎族群体HLA-DRB1、DQA1、DQB1基因多态性研究

[摘要] 目的 了解海南黎族群体HLA-DRB1、DQA1、DQB1基因的遗传多态性。方法 应用PCR-SSP方法对随机抽取的94名海南黎族无血缘关系的健康个体进行HLA-DRB1、DQA1、DQB1基因分型。结果 鉴定了海南黎族群体HLA-DRB1位点的16种等位基因,DQA1位点的10种等位基因,DQB1位点的19种等位基因,包括了DR、DQ位点目前已知的全部血清学特异性,三个位点的基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P>0.5）。结论 提供了一套比较完整准确的海南黎族群体DRB1、DQA1、DQB1等位基因的基因频率和连锁不平衡参数。对群体遗传和疾病关联研究具有参考意义。     

两例罕见的血小板抗原HPA-21bw等位基因报告

目的:调查中国人群人类血小板抗原HPA-21w多态性.方法:采用聚合酶链反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)基因分型技术,对广州汉族血小板献血者进行HPA-21w基因分型,并使用PCR扩增HPA-21w基因片段,进行DNA测序验证.结果:在200例受检者中发现2例HPA-21 a/b杂合子个体,DNA测序表明GPIIIa编码基因1960位G→A,导致GPIIIa膜糖蛋白第628位谷氨酸被赖氨酸所取代,产生HPA-21 bw抗原特异性.中国人群HPA-21 bw的等位基因频率为0.50％.结论:在中国人群首次检出HPA-21 bw等位基因,提示在血小板同种免疫症的诊断和血小板输注治疗中,该抗原具有免疫学意义.     

应用毛细管参考链介导的构象分析法进行HLA-DR4等位基因分型

目的应用毛细管参考链构象分析法对HLA—DR4进行等位基因分型,并与测序分型结果相比较,评价该方法的准确性及实用性。方法首先应用FAM标记的引物扩增HLA-DRBl等位基因为纯合型的样本DRB1*0803、DRB1*0901的第二外显子作为参考链,与标准样品HLA-DR1第二外显子杂交获得异源双链,借助测序仪通过毛细管电泳建立中国人HLA-DR48个高频率等位基因的标准迁移率,再对30例DR4样本进行分型,并与测序分型法检测结果进行比较。结果30例样本中28例与测序法测得的等位基因结果一致。结论毛细管参考链介导的构象分析法具有准确性高、分辨率高的优势,与测序法相比具有成本低、高通量的特点,值得在移植、相关疾病等领域的HLA分型中推广应用。     

应用顺序特异性引物聚合酶链反应检测华南人群HLA-B座位第4外显子变异

目的：为探明中国华南人群中因HLA-B座位发生基因突变而引起表达变异存在的可能性。方法：用顺序特异性引物聚合酶链反应（PCR-SSP）对75例经血清血分型为纯合型样本再次分型，对有差异的结果使用PCR-SSP方法检测第四外显子突变情况。结果：75例血清学指定为纯合型标本经DNA分型证实有12例为杂合型。12例结果有差异的样本经PCR-SSP法表达变异的筛查发现有1例存在第四外显子额外胞嘧啶插入，经DNA分型发现的第二基因为沉默基因。结论：应用PCR-SSP方法可检测HLA-B等位基因突变，该突变导致HLA-B基因表达无效，进行HLA基因表达变异的检测可提高HLA分型的准确性，更加有效的指导临床进行器官和骨髓的选配。     

人类白细胞抗原新等位基因HLA-A*31∶22的序列分析及确认

目的 序列分析及确认一例中国人群中的人类白细胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)新等位基因.方法 应用基于Luminex平台的聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSOP)基因分型法、PCR产物测序法和组特异性引物测序法,通过软件分析该样本DNA基因序列及与最相近HLA等位基因序列的差异.结果 PCR-SSOP结果显示该样本HLA-A基因座的反应格局与已知HLA-A等位基因均不一致;DNA序列分析显示,在所检测的第2～4外显子中,该样本HLA-A基因座序列与所有已知HLA-A等位基因序列均不一致,与同源性最高的等位基因A*31∶01∶02的差异只在外显子2区域中产生了nt 245 A—C一个碱基取代,并导致相应的82位密码子由GAG→GCG,编码的氨基酸由谷氨酸(Glu)变为丙氨酸(Ala).结论 该基因为HLA新等位基因,被世界卫生组织HLA因子命名委员会正式命名为HLA-A*31∶22.     

人类白细胞抗原-A基因芯片分型研究

目的 探索人类白细胞抗原-A（HLA-A）基因芯片分型，为器官移植临床配型服务。方法 根据中国汉族南方人常见的HLA-A位点基因及其多态性的独特序列，设计并合成48条特异性的寡核苷酸分型探针，将其点在玻片上，制成芯片。基因组DNA通过组间特异性引物扩增，并用荧光素Cy5标记。标记后的产物与结合在芯片上的探针进行杂交，通过荧光扫描仪获得杂交产生的荧光信号值，再经过计算机软件自动分析，确定样品的HLA-A基因亚型。用该方法对120份样本进行HLA-A基因分型。结果 120份待检样本，其中6份因PER无产物，不能分型。1份信号杂乱，不能分型。其余113份样本分型成功。实际检出A抗原特异性结果为A2（含A203）：56；A11（含A1101）：52；A24：33；Al：8；A30（含A3001）：7；A33：21；A26：1；A29：2；A31：3；A68：2；A3：9；A32：1。未检出A＊3002基因型。整个检测耗时约4．5h。芯片检测的重复率为100％。结论 HLA-A基因芯片是一种理想的分型方法，具有特异性高、重复性好、操作简便、所需样本量少、结果判读容易、一次可作多份样本的优点，适合临床器官移植配型应用。