Notch配体在哮喘小鼠肺中的表达

目的 明确Notch配体（Delta1J、agged1及Jagged2）在小鼠哮喘模型肺中的表达水平，探讨其在哮喘发病机制中的作用。方法 20只BALB/c小鼠随机分为正常对照组和哮喘组（每组10只）。通过卵清蛋白腹腔注射及雾化吸入建立哮喘模型。采用半定量PCR检测Notch配体（Delta1J、agged1及Jagged2）mRNA在哮喘组和正常对照组小鼠肺组织和肺细胞中的表达水平。结果 与正常对照组比较，哮喘小鼠肺组织及肺细胞的Delta1 mRNA表达显著降低（P均〈0.001），Jagged1和Jagged2 mRNA表达显著升高（P〈0.001或0.05）。结论 在哮喘的发病环节中，Notch配体Delta1表现为抑制作用，Jagged1和Jagged2表现为促进作用。     

Notch信号通路在小儿哮喘患者外周血单个核细胞的表达及其临床意义

目的初步探讨Notch信号通路相关分子在小儿哮喘患者中的表达及其临床意义。方法实时荧光定量聚合酶链反应和流式细胞术,分别从基因转录和蛋白表达水平检测20例小儿哮喘患者和20例健康对照者的外周血单个核细胞（PBMC）中Notch1、Notch2、Notch3、Notch4以及Notch的配体Jagged1、Jagged2、DLL1（Delta-like1）、DLL3（Delta-like3）、DLL4（Delta-like4）的表达。结果小儿哮喘患者PBMC中的Notch1、Notch3、Jagged1、Jagged2、Delta1的mRNA和蛋白的表达均明显高于健康对照组（P〈0.01）,Notch2、Notch4、Delta3和Delta4的基因和蛋白的表达在两者中未见明显差异（P〉0.05）。结论 Notch信号通路的表达在小儿哮喘发病过程中有显著改变,可能参与小儿哮喘的发生发展,为深入研究小儿哮喘的发病机制提供思路。     

Notch信号通路在宫颈癌患者外周血单个核细胞的表达及其临床意义

目的探讨Notch信号通路在宫颈癌发病机制中的作用。方法采用实时荧光定量PCR和流式细胞术,分别从基因转录和蛋白表达水平检测30例宫颈癌患者和30例健康对照者的外周血单个核细胞（PBMCs）中Notch 1,Notch 2,Notch 3,Notch 4,以及Notch的配体Jagged 1,Jagged 2,Delta 1,Delta 3,Delta 4的表达。结果宫颈癌患者PBMCs中的Notch 1,Notch 2,Jaggcd 1,Jagged 2,Delta 1,Delta 4的mRNA和蛋白的表达均明显高于健康对照组（P〈0．01）,Notch 3,Notch 4,Delta 3的基因和蛋白的表达在两者中差异均无统计学意义（P〉0．05）。结论Notch信号通路的表达在宫颈癌的发病过程中存在一定的变化,可能参与宫颈癌的发生发展,从而为官颈癌的早期诊断和临床治疗提供新线索。     

六味地黄汤通过树突状细胞Notch信号通路调节T细胞分化干预自身免疫性脑脊髓炎

目的 通过观察树突状细胞（dendritic cells,DCs）Notch信号通路对CD4+ T细胞分化的影响,探究六味地黄汤干预实验性自身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE）的机制。方法 采用主动免疫法诱导2D2小鼠EAE模型,采用磁珠分选收集脾脏和淋巴结中CD4+ T细胞;体外分离培养及诱导C57BL/6（C57）小鼠骨髓来源树突状细胞（bone marrow derived dendritic cells, BMDCs）成熟,分组干预后,与CD4+ T细胞共培养后,被动注射至C57小鼠体内,观察小鼠发病情况。将BMDCs与CD4+ T细胞的共培养细胞分为对照组、六味地黄汤组、γ分泌酶抑制剂（gamma-secretase inhibitor,GSI）组。采用Western blot法检测各组BMDCs的Notch通路蛋白表达水平,采用流式细胞仪分析各组CD4+ T细胞分化情况。结果 与正常组比较,模型组Notch通路相关蛋白Notch1、Jagged1、MAML蛋白表达水平均显著升高（P<0.05）。与模型组比较,六味地黄汤组DCs的Notch1、Jagged1、MAML蛋白水平显著下调（P<0.05）。通过BMDCs诱导的CD4+ T细胞向Treg分化增多,向Th17分化减少,并改善被动免疫诱导的EAE小鼠症状评分。结论 六味地黄汤可通过抑制DCs的Notch信号通路活化,减少CD4+ T细胞分化,进而缓解EAE残疾症状。     

哮喘大鼠肺CD4＋T细胞Notch1基因启动子甲基化的研究

目的研究支气管哮喘模型大鼠肺CD4＋T细胞中的Notch1基因mRNA表达水平、Notch1基因启动子区DNA甲基化水平及其甲基化改变的位点。方法 20只Wistar大鼠随机分为对照组和哮喘组（每组10只）,哮喘组用卵白蛋白（OVA）致敏并激发的方法建立哮喘大鼠模型。免疫磁珠分离肺CD4＋T细胞并进行纯度鉴定。Real-time PCR检测肺CD4＋T细胞Notch1基因mRNA表达水平,重亚硫酸盐测序检测Notch1基因启动子区DNA甲基化水平。结果哮喘组大鼠肺CD4＋T细胞中Notch1基因mRNA表达水平为对照组的（2.254±0.403）倍（P〈0.01）。哮喘组大鼠肺CD4＋T淋巴细胞Notch1基因启动子区DNA 10个位点整体甲基化水平低于对照组（0.150±0.108比0.300±0.667,P〈0.01）。结论哮喘大鼠肺CD4＋T细胞Notch1基因DNA低甲基化可能参与了Notch1基因的转录调控,增高了Notch1基因的表达量,从而参与了哮喘的发病。     

DAPT抑制RM-1细胞增殖的实验研究

目的研究Notch信号通路特异性阻断剂DAPT对小鼠前列腺癌RM-1细胞增殖的影响。方法体外培养RM-1细胞,实验组以不同浓度DAPT（0.25、0.5、1、2、5μmol/L）处理,对照组不加DAPT;利用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期（PI法）,RT-PCR法检测Notch1、Jagged1基因表达。结果与对照组比较,0.25μmol/L剂量组对RM-1细胞增殖、周期、Notch1及Jagged1 mRNA表达的影响无差异;0.5、1、2、5μmol/L剂量组均能显著抑制RM-1细胞增殖,随着DAPT浓度的增加,G0/G1期细胞比例逐渐增多,S期细胞比例逐渐减少,G2/M期细胞比例无明显差异,Notch1、Jagged1 mRNA的表达逐渐下调。结论当DAPT浓度≥0.5μmol/L时能够抑制RM-1细胞的增殖,且呈剂量依赖性,其机制可能与诱导细胞G0/G1期阻滞、Notch1及Jagged1 mRNA的表达下调有关。     

益气养阴方影响Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的实验研究

目的 通过对Lewis肺癌移植鼠肿瘤生长及肿瘤组织中Notch信号表达、CD4+CD25+ Treg细胞变化的观察,探讨益气养阴方干预肺癌的量效关系及机制。 方法 将肺癌移植小鼠随机分为4组,模型组只行造模;中药组按小鼠体重按不同剂量灌胃给药分为等效剂量组、大剂量组;化疗组以CTX腹腔注射化疗。记录各组小鼠瘤体大小,观察期满后留取标本行Notch信号表达检测。 结果 ①肿瘤相对体积(RTV)及肿瘤相对抑制率:大剂量组RTV低于其他3组(P＜0.01),化疗组RTV低于等效剂量组(P＜0.05);大剂量组肿瘤抑制率较其他3组高(P＜0.05)。②肿瘤组织中Notch信号通路表达及CD4+CD25+ Treg细胞:等效剂量组Notch1 mRNA表达及CD4+CD25+ Treg细胞高于化疗组(P＜0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组低(P＜0.05);等效剂量组Notch3 mRNA表达与化疗组比较差异无统计学意义(P＞0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组Notch3 mRNA表达量降低(P＜0.05);等效剂量组、高剂量组、化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达均较模型组降低(P＜0.05),等效剂量组与化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达量降低(P＞0.05);高剂量组较等效剂量组及化疗组Jagged1 mRNA及Hesl mRNA表达量降低(P＜0.05)。 结论 益气养阴方剂有抑制Lewis肺癌移植小鼠肿瘤生长的作用,此种作用与益气养阴方剂的药物用量之间存在量效关系,且此种关系提示较大剂量的益气养阴方用量可能更有利于抑制Lewis肺癌细胞生长,而这种抑制作用与益气养阴方剂调控肿瘤组织中Notch1信号通路及CD4+CD25+ Treg细胞有关。      

Notch信号在肾透明细胞癌中的表达及意义

目的 观察Notch信号在肾透明细胞癌中的表达及临床意义.方法 采用Real-time PCR法检测32例肾透明细胞癌组织和32例癌旁正常肾组织Notch信号通路中Notch1及Jagged1的表达水平,分析其与临床病理指标之间的关系.结果 Notch1及Jagged1 mRNA在肾透明细胞癌组织的表达分别为(0.53±1.48)、(0.15士0.59),均低于正常肾组织(P＜0.05);Notch1 的表达与肿瘤临床分期、病理组织分级有关(P＜0.05).结论 Notch信号通路表达失调与肾癌的发生、发展密切相关.     

苦参碱对肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1,Jagged1 mRNA表达的影响

目的:研究肝卵圆细胞增殖模型大鼠Notch1, Jagged1 mRNA表达的变化及苦参碱对其的影响.方法:雄性SD大鼠48只按体重随机分为4组:模型组(A组);苦参碱小剂量(B组);苦参碱组大剂量(C组);D组即正常对照组.用免疫组化方法观察造血干细胞标记(Thy-1)表达的变化、半定量RT-PCR方法观察肝组织中Notch1, Jagged1 mRNA表达的变化.结果:与D组比较,A组Thy-1蛋白, Notch1mRNA, Jagged1 mRNA表达显著升高(P＜0.01),与A组比较,C组Thy-1蛋白, Notch1mRNA, Jagged1 mRNA表达显著下调(P＜0.01).结论:苦参碱可有效的调节Notch信号通路、下调Thy-1蛋白表达,可能是其抑制卵圆细胞过度增殖、诱导卵圆细胞向肝细胞方向定向分化的机制之一.     

1,25-二羟维生素D3处理的树突细胞在变应性气道炎症中的免疫调节作用

目的 探讨1,25-二羟维生素D,[1,25(OH)2D3]处理的树突细胞(DC)在变应性气道炎症中的免疫调节作用及其机制.方法 小鼠骨髓来源DC分2组,分别用1,25(OH):D,和磷酸盐缓冲液(PBS)处理,RT-PCR和蛋白质印迹法检测2组Dc Notch配体Mrna和蛋白表达.将2组DC和Notch配体中和抗体封闭的1,25(OH)2D3处理DC分别与小鼠脾脏来源CIM+T细胞共培养,流式细胞仪检测CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分比.将卵清蛋白(OVA)致敏小鼠分2组,每组5只,分别过继转移1,25(OH)2D3组DC[1,25(OH)2D3-DC组]和PBS组DC(PBS-DC组),以OVA激发气道炎症后行肺脏病理、支气管肺泡灌洗液(BALF)中自细胞介素4(IL-4)、IL-5、IL-13和干扰素γ(IFN-γ)水平以及脾脏CD4+T细胞中CD4+CD25+Foxp3+T细胞百分比检查.结果 1,25(OH)2D3组DC Notch配体Jaggedl和Jagged2 Mrna表达(0.376±0.029、0.564±0.018)和蛋白表达(0.786±0.034、0.632±0.026)均明显高于PBS组(分别为0.146±0.032、0.267±0.012和0.124±0.025、0.098±0.012,均P＜0.01).与CIM+T细胞共培养后,1,25(OH)2D3组CD4+T细胞中CD4+C1)25+Foxp3+T细胞百分比(22.49%±0.56%)明显高于PBS组(6.67%±0.60%,P＜0.01);经Jagged2中和抗体封闭组CIM4CD25+Foxp3+T细胞百分比(6.56%±1.89%)明显低于未封闭组(20.37%±1.64%,P＜0.01),1,25(OH)2D3-DC组小鼠气道炎症明显轻于PBS-DC组;BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ水平(pg/ml)分别为33±5、134±23、91±11和未检测到(＜12.5),均明显低于PBS-DC组(分别为55±7、332±49、152±19、23±6,均P＜0.01);脾脏CD4+T细胞中CIM+CD25+Foxp3+T细胞百分比(14.69%±1.14%)明显高于PBS-DC组(2.38%±0.14%,P＜0.01).结论 1,25(OH)2D3处理DC对变应性气道炎症有抑制作用,这种作用可能与1,25(OH)2D3处理DC通过Jaggect2介导的Notch信号途径诱导CD4+CD25+Foxp3+T细胞生成有关.     

OVA基因修饰的树突状细胞疫苗抗裸鼠肺肿瘤效应研究

目的 探讨OVA基因修饰的树突状细胞疫苗(DC-OVA)在肿瘤模拟抗原OVA(ovabumin)的裸鼠肺癌模型体内抗肺肿瘤的效应。方法 裸鼠右肺原位接种携带OVA的Lewis肺癌细胞(Lewis lung cancer cell-OVA, LLC-OVA)悬液,建立裸鼠肺癌模型。获取DC,经基因转导制备DC-OVA疫苗。Western 印迹法检测OVA蛋白的表达。获取T细胞,进而制备DC疫苗系统(DC-OVA/T)。CCK8试剂检测DC-OVA刺激后T细胞的增殖。模型建立2周后,尾静脉注射DC-OVA/T。Micro-CT扫描荷瘤裸鼠的胸部,观察肺部影像。H-E染色观察肺部及肿瘤组织形态结构。IHC方法观察脾、淋巴结、肿瘤组织中CD8的表达;观察肿瘤组织中SOX2、BMI1的表达。ELISA法检测血清中IL-12水平。结果 Western印迹法在样本中检测出清晰的OVA条带。DC-OVA强有效地刺激了T细胞的增殖(P<0.05)。DC-OVA/T治疗4周,疫苗组裸鼠肺micro-CT未见明显肿瘤阴影;取材,裸眼可见疫苗组病灶减小,H-E染色显示疫苗组的肿瘤组织较少,肺组织形态较完整。疫苗组裸鼠的脾、淋巴结、肿瘤组织内CD8阳性表达均明显高于对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.01),肿瘤组织中的SOX2、BMI1阳性表达明显低于对照组(P<0.05,P<0.05);血清中的IL-12含量较对照组明显升高(P<0.001)。结论 基因修饰的DC疫苗在裸鼠体内具有强大的抗肺癌效应,为临床治疗肺癌提供了新的实验依据。     

大鼠单侧输尿管梗阻后肾脏Notch1／Jagged1的表达及其意义

目的:观察大鼠单侧输尿管梗阻(UUO)后不同时期Notch1/Jagged1、纤维连接蛋白(FN)表达的变化,探讨在肾脏间质纤维化发病机制中的意义。方法:建立大鼠UUO模型,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和westernblotting动态观察(第1、3、7、14天)梗阻侧肾脏及假手术对照组Notch1/Jagged1mRNA、蛋白和FN的表达。结果:UUO模型梗阻侧肾脏Notch1/Jagged1mRNA蛋白及FN蛋白在输尿管结扎后第1、3、7、14天不同时间点均显著高于对照组和非梗阻侧肾脏(P<0.05或P<0.01),Notch1/Jagged1mRNA在第7天达高峰,但Jagged1于第1天达高峰,Notch1、FN在第14天达高峰。结论:在整体条件下,随着肾间质纤维化程度的加重,FN聚积也随之增加,同时Notch1/Jagged1表达增强,提示Notch1/Jagged1信号通路在肾间质纤维化发病机制中起重要作用。     

阳和平喘颗粒通过上调miR-139-5p和下调Notch1/Hes1通路促进哮喘大鼠BMSCs归巢

目的 观察阳和平喘颗粒对哮喘miR-139-5p、Notch1/Hes1信号通路及骨髓源性间充质干细胞（BMSCs）归巢的影响。方法 50 只 SD 大鼠随机均分为 5 组：正常对照（NC）组、模型对照（MC）组、BMSCs 移植（BMSCs）组、BMSCs+地塞米松（BMSCs+DXM）组[地塞米松 0.0625 mg/ （kg·d）]、BMSCs+阳和平喘组[阳和平喘颗粒3.5 g/ （kg·d）]。采用卵清蛋白致敏激发建立大鼠哮喘模型,BMSCs组、BMSCs+DXM组、BMSCs+阳和平喘组大鼠在激发最后1 d经尾静脉移植入1×106/mL BMSCs悬液。NC组、MC组以生理盐水灌胃,药物干预组分别予相应药物灌胃,灌胃量为1 mL/100 g,均持续1周。HE染色观察肺组织病理形态学,流式细胞术检测肺组织中CXCR4蛋白表达,酶联免疫吸附法检测肺组织γ干扰素（IFN-γ）、白介素-4（IL-4）表达。免疫荧光观察支气管上皮细胞CXCR4、Notch1、Hes1表达。RT-PCR法检测肺组织miR-139-5p、Notch1、Jagged1、RBP-J、Hes1基因表达,免疫印迹法检测肺组织 Notch1、Jagged1、Hes1 蛋白表达。结果 （1）与 NC 组比较,MC 组肺组织 CXCR4、IL-4、Notch1mRNA、Jagged1mRNA、RBP-JmRNA、Hes1mRNA及Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达升高,INF-γ、miR-139-5p mRNA表达降低（P<0.05）;（2）与MC组比较,BMSCs组、BMSCs+DXM组、BMSCs+阳和平喘组CXCR4、IFN-γ、miR-139-5pmRNA升高,IL-4、Notch1mRNA、Jagged1mRNA、RBP-JmRNA、Hes1mRNA及Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达降低（P<0.05）;（3）与BMSCs组比较,BMSCs+阳和平喘组CXCR4、IFN-γ、miR-139-5pmRNA表达升高,IL-4、Notch1mRNA表达量降低（P<0.05）。结论 阳和平喘颗粒通过上调miR-139-5p,下调Notch1/Hes1通路,强化BMSCs归巢对Th2炎症反应的抑制作用。     

佐剂关节炎大鼠肺功能变化与Notch1、Notch2/Jagged1、Jagged2通路的相关性

目的观察佐剂关节炎(AA)大鼠肺功能降低与肺组织Notch1、Notch2、Jagged1、Jagged2的关系。方法将40只大鼠随机均分为正常组和模型组,模型组大鼠右后足跖皮内注射弗氏完全佐剂(CFA)0.1 ml致炎,复制成AA模型。致炎30 d后,观察两组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数、肺功能、肺组织形态学变化,RT-PCR法检测肺组织Notch1、Notch2及Jagged1、Jagged2的表达。结果模型组大鼠足跖肿胀度、关节炎指数升高,肺功能参数用力肺活量(FVC)、50%肺活量的最大呼气流量(FEF50)、75%肺活量的最大呼气流量(FEF75)、用力最大呼气流量(PEF)降低,肺组织Notch1、Jag-ged1、Jagged2的表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。相关分析显示,模型组大鼠肺功能参数FVC与Jagged1呈正相关,1s内平均呼气流量(FEV1/FVC)与Notch1呈正相关,FEF50与Jagged2呈正相关,FEF75与Notch1、Notch2呈正相关,与Jag-ged1呈负相关(P<0.05,P<0.01)。结论 AA大鼠在发生关节炎症的同时出现肺功能降低,而肺功能降低与Notch受体/配体呈高度相关,提示致炎后形成的免疫复合物沉积于肺组织,激活肺组织Notch信号通路,通过级联放大效应进一步导致肺功能降低。