大鼠脂肪来源血管内皮细胞的改良式培养与观察

目的对目前常用的大鼠脂肪血管内皮细胞(VECs)的原代培养方法进行改良,建立一种操作更为简单、更经济的VECs的原代培养方法。方法取SD大鼠睾丸囊脂肪组织,采用胶原酶消化法,在保留血管及脂肪组织、缩短消化时间的条件下分离、获取细胞,普通高糖培养基培养,光镜下观察细胞形态及生长情况,CD29、CD31与Ⅷ因子相关抗原流式鉴定及Ⅷ因子相关抗原免疫荧光鉴定,MTT比色法检测细胞冻存前后增生率,并讨论改良培养法较传统培养法的优越性。结果体外培养的原代VECs在光镜下初始呈偏圆不规则多角形,细胞融合后呈铺路石样生长;流式鉴定CD31阳性和CD29、Ⅷ因子相关抗原弱阳性,Ⅷ因子相关抗原荧光染色阳性;细胞传至第20代后,仍未见贴壁困难、生长停滞等迹象,平均传代时间为5～7d;液氮中冻存12个月复苏后细胞形态及生长情况无明显改变。结论改良的大鼠脂肪来源VECs的分离和培养方法,较传统方法更简单、经济,培养时间更短,可长期传代,是一种较为理想的培养方法。     

乳鼠心肌膜微血管内皮细胞的体外培养

目的 改进心肌膜微血管内皮细胞的体外培养方法,为进一步研究其结构和功能提供实验数据.方法 选取10～15d龄的SD大鼠,采用植块法培养原代心肌膜微血管内皮细胞,在继代培养中通过差速消化和差速贴壁方法、结合倒置显微镜下形态学的观察进行继代培养和纯化,利用免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原对培养细胞进行了鉴定.结果 成功培养了大鼠心肌膜微血管内皮细胞,细胞呈多边形或鹅卵石状;免疫细胞化学染色第Ⅷ因子相关抗原显阳性.结论 改良了心肌膜微血管内皮细胞的体外培养方法,获得了较高纯度的心肌膜微血管内皮细胞,可用于进一步的科学研究.     

原代大鼠脑微血管内皮细胞的培养及鉴定

建立一种纯度较高的原代大鼠脑微血管内皮细胞的分离培养方法。取7～10日龄SD大鼠脑组织,经匀浆,牛血清白蛋白密度梯度离心,Ⅱ型胶原酶消化获得脑微血管段后,置于CO_2培养箱中进行原代培养。通过细胞形态学观察、第Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定所培养的细胞。在倒置显微镜下,体外培养24～48 h后,细胞从贴壁的脑微血管段周围爬出,单个细胞为短梭形或多角形,呈团簇状单层贴壁生长,待细胞密集融合后,则成典型的"铺路石样"涡旋状排列;Ⅷ因子免疫细胞化学染色检测,相关抗原表达为阳性,细胞胞质显棕黄色,阳性细胞率达99%以上。该方法能够成功分离培养出原代大鼠脑微血管内皮细胞。     

兔阴茎海绵体内皮细胞的培养和鉴定

本研究旨在探讨兔阴茎海绵体内皮细胞体外培养技术,为构建组织工程化阴茎海绵体提供种子细胞.无菌获取兔阴茎海绵体组织后,分别采用IV型胶原酶消化法和弹性蛋白酶消化结合机械挤压法分离内皮细胞,比较两种分离方法所获内皮细胞的纯度;进一步在添加生长因子的内皮细胞生长液中培养扩增,观察细胞形态及增殖情况,并对传代细胞进行免疫组化染色鉴定.结果显示采用弹性蛋白酶消化结合机械挤压组织法能有效分离内皮细胞且保留基质的完整性,避免基质细胞混杂,明显优于IV型胶原酶消化法;培养的内皮细胞呈典型的鹅卵石形态,内皮细胞特异性标志CD31、第Ⅷ因子相关抗原(von Willebrand factor,vWF)表达阳性.结果提示采用弹性蛋白酶消化结合机械挤压组织法能快速有效地分离纯度较高的内皮细胞,进一步在内皮细胞生长液中培养能稳定传代扩增,可为阴茎海绵体组织工程提供种子细胞.     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探索和建立一种纯度高、操作简单且重复性强的小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法。方法通过剪碎、过细胞筛网等物理方法,结合白蛋白密度梯度离心及化学酶消化法,并以严格控制1 g/LⅡ型胶原蛋白酶消化作用时间15～20 min为首要,从2～3周龄ICR小鼠脑组织中分离培养出小鼠脑微血管内皮细胞。通过细胞形态学观察和免疫细胞化学染色检测Ⅷ因子相关抗原鉴定所培养的细胞。结果接种24 h,贴壁的血管段周围爬出多角形或短梭状细胞,并逐渐扩散成团簇状; 7 d后细胞融合,呈典型的单层、"铺路石样"镶嵌式排列。Ⅷ因子相关抗原细胞免疫化学染色鉴定为阳性,胞质呈棕红色,内皮细胞纯度达95%以上。结论成功建立了一种操作简单、重复性强、目的细胞纯度高的小鼠脑微血管内皮细胞原代培养方法。     

大鼠肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养

目的培养大鼠肠黏膜微血管内皮细胞,为内皮细胞的体外研究提供实验材料。方法利用机械吹打法和酶消化法分别分离出肠绒毛固有层,采用植块培养法培养原代内皮细胞,依次以局部消化法和差速黏附法进行纯化,细胞鉴定采用第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测和硝酸银染色。结果成功分离培养出大鼠的肠黏膜微血管内皮细胞,纯化后的细胞可传到18代以上。结论为肠黏膜微血管内皮细胞的体外培养建立了一种操作简单、成本低廉的方法。     

改良贴壁法结合内皮细胞培养基培养小鼠肺微血管内皮细胞*☆

背景：肺微血管内皮细胞是研究微循环的重要内皮细胞模型之一,众多培养方法中单纯贴壁法操作相对简便,但耗时长,杂质细胞多,是批量培养细胞的最大障碍。 目的：建立优化的小鼠肺微血管内皮细胞体外培养方案,观察细胞生长状态并鉴定细胞性质。 方法：无菌状态下快速剪碎5日龄C57BL/6J小鼠的肺叶外周组织,肺组织颗粒贴壁法获得肺微血管内皮细胞,并用内皮细胞培养基培养。倒置显微镜观察培养细胞生长和行为状态,Ⅷ因子相关抗原免疫组化和免疫荧光进行细胞鉴定。 结果与结论：肺组织块培养24 h内可见梭形细胞爬出,传代后细胞生长迅速,形态规则呈鹅卵石状,纯度高达98%以上,结合Ⅷ因子相关抗原检测证实其为内皮细胞。结果可见联合运用肺组织颗粒贴壁和内皮细胞培养基可高效获得原代小鼠肺微血管内皮细胞。关键词：肺微血管内皮细胞;细胞培养;优化;鉴定;小鼠;血管组织工程 缩略语注释：PMVECs: pulmonary microvascular endothelial cells,肺微血管内皮细胞 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2012.15.007     

人胎盘微血管内皮细胞的分离培养及鉴定

背景:建立高纯度的人胎盘微血管内皮细胞体外培养体系对研究胎盘功能是十分必要的。目前,国内外研究多采用三步酶消化法结合免疫磁珠法分离胎盘微血管内皮细胞,然而步骤过于繁琐且对细胞损伤较大。因而,如何简化人胎盘微血管内皮细胞分离步骤,同时又能提高目标细胞纯度的体外培养方法成为研究热点。目的:探索一种简便高效的从早期绒毛组织中分离人胎盘微血管内皮细胞的体外培养方法,观察细胞生长状态并进行鉴定。方法:利用健康孕6-8周孕妇行人工流产后的绒毛组织,经两步酶消化法和非连续Percoll密度梯度离心得到人胎盘微血管内皮细胞,传代时利用胰酶消化法和反复贴壁法对细胞进行纯化。结果与结论:实验成功获取人胎盘微血管内皮细胞,原代培养的人胎盘微血管内皮细胞在培养24 h后基本完全贴壁,第10天进入对数生长期,第12至13天细胞浓度达80%,传代细胞较原代细胞生长活跃,培养5-7 d可长满培养瓶底,呈"铺路石样"排布。免疫荧光化学结果显示,培养的细胞中FⅧ因子与CD31相关抗原双荧光染色呈阳性,细胞阳性率达100%。MTT法测得培养第5代人胎盘微血管内皮细胞的生长曲线呈倒"S"形。结果证实,应用两步酶消化法、非连续Percoll密度梯度离心法分离细胞,并利用胰酶消化法和反复贴壁法纯化细胞,可获得大量高纯度的人胎盘微血管内皮细胞。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养

目的:探索一种简便易行、可培养出高纯度大鼠脑微血管内皮细胞的方法。方法:1月龄SD大鼠,解剖得到大脑皮质,密度离心法获得较纯的脑微血管段后进行原代培养,传代采用差速消化和贴壁方法进行纯化。通过形态学观察及第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测对培养细胞进行鉴定。结果:密度离心法分离出的大量微血管段呈"串珠样"结构,培养24h可见短梭形、多角形细胞,8～10天基本融合。第2代细胞经免疫荧光染色,第Ⅷ因子相关抗原呈阳性,阳性率达90%。结论:原代细胞采用低分子量葡聚糖加Percoll密度离心法、传代细胞采用差速消化和差速贴壁法纯化可成功培养高纯度的脑微血管内皮细胞。     

小鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与纯化

目的:探讨纯度较高的小鼠脑微血管内皮细胞的分离与原代培养。方法:取8～14周龄BALB/c或C57/BL6小鼠,无菌分离脑组织,采用改进的两种方法即2次酶消化和1次密度梯度离心法及1次酶消化和1次密度梯度离心法分离小鼠脑微血管段,接种于涂布有Ⅳ型胶原的培养皿上进行原代培养,相差显微镜下观察细胞形态,并以免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原。结果:改进的两种方法均可见内皮细胞在接种后12～16 h从微血管段周围爬出,5～7 d时细胞呈"漩涡状"生长,并可见细胞汇合,90%以上培养的细胞Ⅷ因子相关抗原表达阳性。结论:改进后的两种方法均能进行较高纯度的小鼠腑微血管内皮细胞的分离和原代培养。     

人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的体外分离与培养*

背景：体外研究人骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的分离培养与鉴定,可为探讨骨髓间充质干细胞再生汗腺的可行性打下基础。 目的：探寻在体外分离培养骨髓间充质干细胞和汗腺细胞的有效方法。 方法：采用直接贴壁法从成人骨髓中体外分离培养骨髓间充质干细胞,并进行扩增和鉴定。采用胶原酶消化法从人全层无烧伤皮肤中分离汗腺细胞,并进行扩增和鉴定。 结果与结论：倒置显微镜下见分离培养的骨髓间充质干细胞呈梭形,折光性强,免疫细胞化学染色显示细胞表达CD29、CD105,高表达CD44,不表达造血干细胞表面标志CD34和CD45。汗腺细胞呈扁平多角形,表达汗腺细胞表面标志细胞角蛋白7,8,18,19和癌胚抗原。说明直接贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞和胶原酶消化法分离培养汗腺细胞是可行的。     

冷酶消化法分离和培养新生大鼠许旺细胞

背景：常规酶消化法在许旺细胞分离培养实验中应用较多,但由于胰蛋白酶在37 ℃超过30 min对细胞有毒性作用,会对许旺细胞的数量和纯度有一定的影响。 目的：探索快速分离和培养大量许旺细胞的新方法。 方法：采用4 ℃胰蛋白酶消化剥离好的乳鼠坐骨神经6~18 h分离许旺细胞,培养一段时间,进行MTT实验绘制细胞生长曲线和苏木精-伊红染色和免疫组织化学染色观察许旺细胞的形态,并对阳性细胞进行计数。 结果与结论：结果得到的细胞数量超过1×10⁶,经抗S-100蛋白免疫组织化学染色对细胞进行鉴定,细胞纯度达到90%以上。从培养的细胞形态和细胞生长曲线可见,冷酶消化法是一种简单快捷的方法,其细胞具有良好的生物学特性,在分离时间、细胞数量和纯度、细胞的生物活性均达到临床上的要求。     

两种方法分离子宫内膜干细胞的比较

背景：目前国内外尚无统一方法分离培养子宫内膜干细胞,实验重复性较差。 目的：寻找一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。 方法：采用混合法(机械和酶消化相结合)及胶原酶Ⅰ法分离子宫内膜干细胞,比较两种方法分离所得活细胞数及细胞生长周期的差异;并采用免疫细胞化学法和RT-PCR法检测CD90和CD117的表达情况。 结果与结论：经过15 d的原代培养后,子宫内膜干细胞形态呈圆梭形,细胞贴壁平铺生长,具有成纤维细胞形态,细胞排列无极性;细胞化学染色及RT-PCR法均检测到干细胞标志物CD90和CD117表达,证明培养的细胞具有干细胞特性。混合法获得的活细胞数多于胶原酶Ⅰ法,其差异有显著性意义 (P < 0.01),两种方法分离所得的细胞具有相同的生长周期。结果说明混合法是一种方便、高效、科学的体外分离子宫内膜干细胞的方法。     

热处理延缓维甲酸诱导P19细胞的生长及向神经元分化

研究热环境对P19细胞生长和RA诱导的向神经元分化的影响,为探讨热环境刺激对神经系统发育的影响提供参考。成熟的P19细胞在热环境的条件下培养1h后,消化接种至培养皿中正常培养,于不同时间点取样分析细胞数目。热环境处理P19细胞后用维甲酸诱导分化4d,随后接种至培养皿中,参照神经元的原代培养方法培养12d,用神经元抗体免疫鉴定,计数不同培养时间NSE、NF阳性神经元在总体细胞中的比例。结果发现接受热处理的P19细胞贴壁不良,生长始终缓慢,说明热环境刺激阻止细胞生长分裂。P19细胞经RA诱导分化后出现类似神经细胞的突起和纤维网络,而热环境导致P19细胞向神经元分化明显迟缓,NF阳性细胞比例增加。     

人结直肠癌肝转移瘤中CD11b~+髓系细胞分选方法的建立与鉴定

目的:从结直肠癌肝转移瘤组织中分选出高纯度的CD11b~+髓系细胞,从而建立从一种组织中获得特异单细胞的方法。方法:采用机械联合酶消化法将实体瘤组织制备成单细胞悬液;利用流式细胞术分选出CD11b~+髓系细胞,并回测细胞纯度;采用免疫细胞化学技术对分选出细胞的特异性进行鉴定;采用吉姆萨和台盼蓝染色对获得细胞进行评价。结果:流式细胞术能从机械联合酶消化法制备的单细胞悬液中分选出高纯度、足够数量的CD11b~+细胞;分选前细胞阳性率与分选后纯度的差异有统计学意义(P0.01),分选后纯度达到实验研究的要求(P0.05);免疫细胞化学技术验证了分选细胞的特异性;分选后的细胞形态完整,活性良好。结论:机械联合酶消化法制备的单细胞悬液,经过流式细胞术分选,能够分选出高纯度、活性良好且形态完整的特异性细胞,操作方法稳定可重复,满足进一步研究的要求。     

改良型混合酶消化法培养小鼠乳腺上皮细胞

背景：目前采用的A型胶原酶和胰蛋白酶混合酶分离乳腺细胞团的方法操作复杂,实验条件要求高。 目的：观察改良型混合酶消化法能否成功进行乳腺上皮细胞的体外培养。 方法：采用Ⅰ型、Ⅱ型胶原酶和胰蛋白酶(1∶1∶1)混合消化直接用眼科剪剪碎的小鼠乳腺组织,37 ℃振荡消化获取乳腺细胞团,并采用差速贴壁法去除成纤维细胞,将细胞团接种于细胞培养瓶进行培养。 结果与结论：倒置显微镜下观察显示,改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且培养12 h后细胞团绝大多数贴在细胞瓶壁,培养72 h后细胞团完全铺开融合成片,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光细胞化学染色结果显示,培养细胞角蛋白18呈阳性反应。说明应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。     

一种快速、经济、省时的施万细胞体外培养和纯化方法

目的 探讨一种快速、简单、经济的施万细胞(SCs)培养和纯化方法,为SCs体内移植研究提供稳定及可靠的细胞来源.方法 选用SD乳鼠,取坐骨神经和臂丛神经,用单细胞双酶消化法和半植块单酶消化法培养SCs.结果 用同样多的组织材料,半植块单酶消化法所获得的SCs比单细胞双酶消化法所获细胞至少多两倍,省时40min.免疫组织化学染色显示,获得的施万细胞96%以上呈S-100阳性.结论 用半植块单酶消化法培养SCs,可以在短时间内获得足够数量和足够纯度的SCs.     

压应力对体外培养的表皮干细胞增殖分化的影响

目的： 初步观察间歇压应力对表皮干细胞增殖分化的影响并探讨其可能的作用机制。 方法： Ⅳ型胶原分离培养表皮干细胞，并用免疫组织化学PowervisionTM二步法和细胞周期分析进行鉴定；采用不同压应力（4 kPa、6 kPa、8 kPa、10 kPa、12 kPa）细胞培养体系装置培养表皮干细胞和进行细胞加压，利用表皮干细胞特异表达角蛋白19及终末分化细胞表达角蛋白10的特点和免疫组织化学PowervisionTM二步法检测加压前后表皮干细胞和终末分化细胞的变化。 结果： 分离、培养的表皮干细胞K19免疫组化染色阳性，细胞周期分析有84.80%的细胞处于G1期；8 kPa以上的间歇压应力作用粘附于硅胶膜上的表皮干细胞1周后，其数量明显增多，免疫组化染色发现其中有角蛋白10阳性细胞。 结论： 8 kPa以上的间歇压应力能诱导表皮干细胞增殖分化，表皮干细胞对机械应力的响应机制可能是其主要的生物学基础。     

曲古抑菌素A促进小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞

 目的： 观察曲古抑菌素A(TSA)诱导小鼠骨髓间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的适宜浓度。方法: C57BL/6小鼠骨髓间充质干细胞系体外培养。实验分为5组：对照组（DMSO,A组)和TSA干预组（25 nmol/L,B组;50 nmol/L,C组;100 nmol/L,D组;200 nmol/L,E组）。各组分两阶段用相应的培养基培养10 d后进行检测。双硫腙染色鉴定各组的胰岛素分泌细胞,结果进行半定量分析。免疫荧光染色鉴定各组的胰岛素分泌,比较各组胰岛素平均荧光强度。酶联免疫吸附试验检测各组胰岛素分泌细胞胰岛素的分泌量。结果: TSA作用10 d能够诱导C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞并分泌胰岛素。 B组胰岛素染色阳性面积、阳性率、胰岛素染色积分吸光度以及胰岛素平均荧光强度显著高于其它干预组,差异有统计学意义（均P<0.05）。 随着各干预组TSA浓度的升高,胰岛素的分泌量减少。B组胰岛素含量显著高于其它干预组,差异有统计学意义（均P<0.05）。结论：TSA处理10 d能诱导C57BL/6 小鼠骨髓间充质干细胞分化成为胰岛素分泌细胞,并且25 nmol/L为TSA的适宜浓度。     

Establishment and identification of human primary lung cancer cell culture in vitro

Objective: To explore a simple and practical method for human primary lung cancer cells culture in vitro. Methods: Tumor specimens from 6 lung cancer patients were isolated with collagenase digestion cultured in vitro. Then the characteristics of these cells were analyzed and identified by optical microscope observation, hematoxylin-eosin staining, immunocytochemistry, immunohistochemistry and tumor nude mice inoculation experiments, respectively. Results: Except for the small cell lung cancer, the other 5 samples were successfully isolated and cultured. The cultured cells showed typical characteristics of malignant cells and positive for cytokeratin 7 and 19. Moreover, the cancer cells readily formed subcutaneous tumors in nude mice and the pathological images of the transplanted tumor were consistent with its tumor origin. Conclusion: The primary culture for human lung cancer cells can be successfully achieved with the method of collagenase digestion.