免疫酶检测技术 Ⅰ、免疫酶实验方法的探讨

<正> 免疫酶法是一种特异、敏感、快速简易的血清学试验方法。近年来国内外较为盛行,有关的资料很多。免疫酶技术其中重要的环节之一是制备免疫活性较高的酶标记物,酶标记物的制备方法,常用的有两种。一种为戊二醛法包括一步法和二步法,另一种为过碘酸钠氧化法。我们对戊二醛二     

三种辣根过氧化物酶标记羊抗人IgG方法的比较

目的：探讨三种辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗人IgG方法的差异，方法：应用过碘酸钠氧化法，简易戊二醛二步法和戊二醛－过碘酸钠法三种HRP标记羊抗人IgG方法的酶标记物含量和浓度作了比较，同时对45人份血清O．D值进行了比较，结果：应用过碘酸钠氧化法的标记率（LR）和克分子比均较简易戊二醛二步法，戊二醛－过碘酸钠法高；且应用过碘酸钠氧化法制备的酶标记物效价远远高于其它两种方法；结论：应用HRF标记羊抗人IgG制备酶标记物最好应用过碘酸钠氧化法。     

辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的简易过碘酸钠法

辣根过氧化物酶(HRP)标记葡萄球菌A蛋白(SpA)的方法多为过碘酸钠法。1982年薛采芳等采用过碘酸钠改良法获得满意效果。我们依照Wilson等报道的HRP标记抗体的方法加以改良制备了HRP-SpA结合物,并与过碘酸钠改良法作了比较,效果良好。采用本法制备HRP-SpA尚未见有报道。本法的主要特点,系将HRP在低pH4.4下进行过碘酸钠氧化,省去经典法中用二硝基氟苯封闭HRP步     

两种不同制备酶标记结合物方法的比较

①目的 对过碘酸盐经典法（经典法）和过碘酸盐改良法（改良法）制备的酶标结合物进行比较。②方法 两种方法均用过碘酸盐氧化辣根过氧化物酶（HRP）使醛基暴露以提高酶与抗体（或抗原）的结合率。但在用NaIO4氧化前应将酶蛋白分子上的氨基进行处理，以防酶经氧化后形成醛基造成自身交联，为此，经典法是用二硝基氟苯将氨基封闭，而改良法是在低PH条件下用NaIO4直接氧化HRP。用二硝基氟苯封闭仍有35%的HRP发生自身交联，而且酶的活性受影响。而改良法在低PH条件下直接氧化HRP，仅5%HRP有自身交联而且活性不受影响。我们用上述方法分别制备了两种酶结合物，并对两种酶结合物作了质量对比试验，包括对流电泳、酶活性测定。③结果 改良法酶结合物活性及产率明显比经典法高。④结论 过碘酸盐改良法制备的酶结合物活性及产率均较过碘酸盐经典法好。     

应用戊二醛──过碘酸钠法交联辣根过氧化物酶与白色念球菌MN抗原

本文介绍一种免疫学检测中酶标记抗原的新方法。将戊二醛──过碘酸钠法交联辣根过氧化物酶与白色念珠菌MN抗原上，此法可供酶联免疫EUSA检测中竞争抑制法应用。     

应用戊二醛—过碘酸钠法交联辣根过氧化物酶与白色念珠菌MN抗原

本文介绍一种免疫学检测中酶标记抗原的新方法。将戊二醛－过碘酸钠法交联辣根过氧化物酶与白色念珠菌ＭＮ抗原上，此法可供酶联免疫ＥＵＳＡ检测中竞争抑制法应用。     

一种改良NaIO_4标记法应用于HRP-IgG及其在GSH-Px研究

谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)是体内一种重要的抗脂质过氧化物酶,近年来,免疫酶技术在研究GSH-Px细胞内分布、代谢等方面得到广泛应用。这种技术需要重复性好,效果优良的标记法和高效稳定的酶标抗体。传统的辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体的过碘酸钠法(Nakane法),酶活性显著下降和IgG-HRP大分子聚合物的形成,影响了GSH-Px抗原抗体反应的敏感性,为克服这一缺陷,木文采用一种新的HRP标记IgG过碘酸钠法,将标记物用于GSH-Px的酶联免疫吸附测定(ELISA)法、免疫组化及免疫电镜研究,取得满意结果。     

蝙蝠血清IgG的纯化及兔抗蝙蝠IgG酶标抗体的制备

目的纯化蝙蝠血清IgG,制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体。方法采用亲和层析纯化法纯化蝙蝠血清IgG,SDS-PAGE电泳鉴定蝙蝠IgG纯度。免疫大白兔制备兔抗蝙蝠IgG抗血清,免疫双扩散法测定抗血清效价,亲和层析纯化法纯化抗血清IgG。用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,直接ELISA和Western blot法对兔抗蝙蝠IgG酶标抗体进行工作浓度测定。结果纯化的蝙蝠血清IgG,其SDS-PAGE测定纯度大于95%;免疫大白兔所制备的抗血清免疫双扩散效价为1∶64;用改良过碘酸钠标记法制备兔抗蝙蝠IgG酶标抗体,其直接ELISA和Western blot工作浓度分别为1∶12800和大于1∶2000。结论制备了蝙蝠血清IgG的抗血清和酶标抗体,为蝙蝠的血清学检测体系提供了技术和资源储备。     

应用免疫过氧化物酶定位对细胞和组织内抗原的研究(摘要)

<正> 应用免疫酶技术,在光学和电镜下对以3型和7型腺病毒感染的人胚肾培养细胞、实验性免疫复合物引起的兔心肌血管炎的心肌组织、腺病毒肺炎尸检的肺组织为研究材料,进行了免疫酶标定位抗原的研究。在技术上进行了试验和改进,提出了光学镜和电镜免疫酶定位材料的处理方法及免疫酶染色的操作程序,几个影响试验成败的关键性问题进行了探讨。这些问题是:(1)辣根过氧化物酶标抗体的保存及测量问对题:我们采用Nakane的过碘酸钠氧化法制备的酶标抗体,为使其活性不致丧失,将其以每小瓶0.1ml或     

过碘酸盐与戊二醛法对制备α-BT-HRP结合物的初步研究

本文报道了关于α-BT-HRP结合物制备方法的研究。在我们的实验室条件下,按照过碘酸盐法得到了这种结合物,而用经典的戊二醛一步法和二步法则没有得到。据此认为,对于制备α-BT-HRP来说,过碘酸盐法是简便而有效的。     

ELISA检测胰岛素的进一步探讨与应用

本文分别用Nakane过碘酸钠法,改良过碘酸钠法及Wilson过碘酸钠法制备了酶标记胰岛素抗体,结果表明Wilson法所制备的酶结合物活性较好。采用不同的酶促反应时间,所绘胰岛素标准曲线亦不相同,其中以15分钟较为满意,应用ELISA方法和RIA方法对22例正常人口服糖耐量试验的血清胰岛素含量进行检测,两法所测胰岛素变化曲线相平行。     

兔抗麻雀IgY酶标抗体的制备

目的制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗麻雀IgY抗体,为禽类血清学检测体系的建立提供技术储备。方法硫酸铵盐析法粗提麻雀血清IgY,进一步在SDS-PAGE上分离后,切下带有目的条带的凝胶作为免疫原,免疫实验兔制备抗血清,Protein-A柱亲和纯化兔抗IgY血清IgG,,使用改良过碘酸钠法制备酶结合物。ELISA检测酶标抗体的工作浓度,western blotting检测酶标抗体的特异性。结果硫酸铵盐析法粗提IgY,可去除部分杂蛋白,SDS-PAGE上分离后切下带有目的条带的凝胶,可以得到足够纯度的抗原,将带有IgY的凝胶作为抗原免疫后获得的抗血清经Protein-A纯化后,二抗在SDS-PAGE上鉴定,纯度达到99%以上。改良的过碘酸钠法标记获得的抗体浓度为1.008 mg/mL,ELISA检测酶标抗体效价为1∶1000。Western blotting鉴定抗体具有特异性。结论获得了优质可靠的兔抗麻雀IgY酶标抗体。     

抗慢性B淋巴细胞白血病患者血清IgM McAb的纯化及其酶结合物的制备

应用DEAE-22纤维素离子交换柱和正辛酸法从接种杂交瘤细胞BALB/C 鼠的腹水或腹腔肿瘤浸出液中纯化抗慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)患者血清IgM 单克隆抗体(McAb),纯化物经巴比妥琼脂电泳,SDS-PAGE 鉴定为高纯度。ELISA 法证明具有高效价、高度特异性。采用过碘酸钠氧化结合法制备的辣根过氧化酶 HRPO-McAb 结合物的免疫活性、酶与蛋白质二者mol比、标记率均达到质量要求。     

人胎盘泌乳素酶联免疫方法的建立及其应用

目的：建立一种检测胎盘功能的新手段。方法：从人胎盘匀浆中分离、纯化出人胎盘泌乳素（ Ｈ Ｐ Ｌ）纯品，制备 Ｈ Ｐ Ｌ 抗体。用改良的过碘酸钠法制备 Ｈ Ｐ Ｌ抗体与辣根过氧化物酶结合物，建立了双抗体夹心的酶联免疫方法，检测了正常妊娠和高危妊娠孕妇血中 Ｈ Ｐ Ｌ水平。结果：高危妊娠和血中 Ｎ Ｐ Ｌ 值低，且 Ｈ Ｐ Ｌ 低值者的胎儿宫内窘迫、低 Ａｐｇａｒ 评分的发生率均高于 Ｈ Ｐ Ｌ 值正常组，两组相比差异均有显著性。结论：该法具有特异、敏感、快速、准确等优点，可作为检测胎盘功能的一项可靠指标。     

包裹碱性磷酸酶免疫脂质体的制备

目的:制备包裹碱性磷酸酶的免疫脂质体并评价实验方法.方法:采用逆相蒸发法、薄膜分散法制备包裹碱性磷酸酶的脂质体,应用戊二醛交联法、抗体衍生化法将脂质体与兔抗人IgG结合,使脂质体既包裹酶又具有免疫活性.对制备方法进行了分析比较.结果:应用逆相蒸发法制备的脂质体数量多,圆整均匀,具有较高的碱性磷酸酶活性;以戊二醛为交联剂结合抗体方便、高效、实用.结论:通过选择适当的实验方法,制备了具有酶和抗体活性的免疫脂质体.     

人胎盘泌乳素酶联免疫方法的建立及其应用

目的：建立一种检测胎盘功能的新手段，方法：从人胎盘匀浆中分离，纯化出人胎盘泌乳素（ＨＰＬ）的纯品，制备ＨＰＬ抗体，用改良的碘酸钠法制备ＨＰＬ抗体与辣根过氧化物酶结合物，建立了双抗体夹心的酶联免疫方法，检测了正常妊娠和高危妊娠孕妇血中ＨＰＬ水平，结果：高危妊娠和血中ＮＰＬ值低，且ＨＰＬ低值者的胎儿内窘迫，低Ａｐｇａｒ评分的发生率均高于ＨＰＬ值正常组，两组相比差异均有显著性，结论 该法具有特异，敏感，     

酶标免疫实验假阴阳性原因探析

目的 比较血凝法、酶标免疫一步法与二步法测定乙肝表面抗原(HBsAg)的优缺点，避免实验中影响蛄果的因素，提高准确性。方法 分别同时用血凝法和酶标一步法测定50份血清；用一步法和二步法测定22份血清的HBsAg。结果 血凝法高效价的3份血清用酶标一步法出现假阴性；本该用酶标一步法的试剂改成二步法做的22份血清与阴性阳性对照血清全部出现假阳性。结论 酶标一步法比血凝法敏感，但可出现前带现象造成假阴性；而改用二步法，若试剂不纯则可导致假阳性。故用一步法还是二步法，应按试剂说明书的要求进行操作。     

酶联免疫定量检测人血清载脂蛋白B_(100)的研究

本文介绍一种简便,灵敏、特异测定人血清载脂蛋白(apo)B_(100)的双抗体夹心酶免疫试验。测定采用抗apoB_(100)-IgG包被的聚苯乙烯板及酶-抗apoB_(100)-IgG交联物,交联物由辣根过氧化物酶用戊二醛二步法制备。本法最小检测量为30ng;标准曲线的测定范围为30～400mg％;回收率为101.6～102.2％;批内和批间变异系数分别为5.5及4.7～8.4％。本法测定26例健康成人,血apoB_(100)含量为101.9±18.9mg％;与单向免疫扩散法(RID)测定的相关系数r=0.883。     

酶放大镧系元素发光时间分辨荧光分析中关键试剂的研究

目的研制成镧系元素发光时间分辨荧光分析中的关键试剂。方法用过碘酸钠法研制成辣根过氧化物酶标记链霉亲和素，用戊二醛二步法研制成碱性磷酸酶标记链霉亲和素和用化学合成法研制成5-氟水杨酸磷酸酯等关键试剂。结果HRP标记SA总蛋白回收率为29．8％，纯度为97％。ALP标记SA的总蛋白回收率为56％，纯度为98％，分子量为159kD，其中ALP分子量为94kD，生物活性良好。5-氟水杨酸磷酸酯，测得熔点为157℃～159℃、纯度为99．43％-100％、红外吸收光谱、紫外吸收光谱及核磁共振谱等特性鉴定与文献记载一致。结论研制成的各种关键试剂质量良好，已成功地应用于科研中。     

逆行酶标与免疫酶技术相结合的一种方法

Hancock于1984年报道了用硫酸镍铵加强的DAB进行HRP呈色反应(DAB—硫酸镍铵法),将其应用于免疫酶双标记中。我们将该方法移植于HRP逆行标记呈色反应结合免疫酶双标记技术中。结果表明:该法反应呈现之黑色颗粒细而均匀,与棕色的免疫酶标记物对比明显,是一种研究神经通路化学性质较好的方法。