局部注射内皮祖细胞改善糖尿病大鼠后肢血管病变

目的探讨局部注射同种异体内皮祖细胞(EPCs)对糖尿病大鼠后肢血管病变的作用,并探讨其可能机制。方法腹腔注射链佐星制备SD大鼠糖尿病模型,然后将其两后肢股动脉结扎,制成血管病变模型。将模型分为两组,移植组大鼠左后肢为实验侧,自结扎部位以下每0.5 cm注射分离自糖尿病大鼠外周血的以荧光染料标记的EPCs悬液0.5 ml(含EPCs 2.5×105个),右后肢为对照侧,注射等量的磷酸盐缓冲液;空白对照组不注射任何溶液。注射EPCs后1周,采用酶联免疫吸附试验检测后肢局部肌肉组织中血管内皮生长因子(VEGF)的表达;注射EPCs后28 d,切取局部肌肉组织,荧光显微镜下观察组织切片中荧光染料的染色情况,免疫组织化学法检测von Willebrand因子(vWF)表达情况,并计算毛细血管密度。结果注射EPCs后1周,移植组实验侧组织中VEGF含量高于对照侧和空白对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而空白对照组和对照侧的差异无统计学意义(P>0.05)。注射EPCs后28 d,荧光显微镜下可见注射部位组织中蓝染的毛细血管内皮细胞;注射EPCs的左后肢局部毛细血管密度高于未注射的对照侧和空白对照组,差异有统计学意义(P< 0.05)。结论同种异体EPCs注射至糖尿病大鼠缺血后肢能分化为毛细血管内皮细胞,从而改善局部供血,局部VEGF分泌增加可能参与这一过程。     

pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓间充质干细胞对后肢缺血大鼠血管生成的影响

目的 探讨经肌肉注射转染pEGFP-C1/Akt的鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对后肢缺血大鼠血管生成的影响.方法 Wistar大鼠30只,制成双后肢缺血模型,双盲法随机分为基因治疗组(肌注经pEGFP-C1/Akt转染的MSCs)、非基因治疗组(肌注MSCs)及对照组(肌注PBS液).造模前、造膜后即刻及MSCs移植后1～7 d内,每天用红外线皮温仪测定大鼠后肢皮温变化.28 d时经动脉造影观察后肢血管生成情况; 免疫组化染色检测后肢毛细血管密度; 逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测后肢肌肉组织中Akt及血管内皮细胞生长因子(VEGF)的 mRNA和蛋白的表达.结果 移植3 d后基因治疗组大鼠后肢皮温升高明显.28 d时经动脉造影观察基因治疗组后肢侧支血管生成明显; 荧光显微镜观察有绿色荧光细胞在基因治疗组的内收肌和半膜肌分布.毛细血管密度: 基因治疗组为(7.1±0.3)个/高倍镜,非基因治疗组为(4.2±0.4)个/高倍镜,对照组为(1.3±0.2)个/高倍镜,各组间差异均有统计学意义(P＜0.01).Akt及VEGF的 mRNA和蛋白的表达分析: 基因治疗组Akt mRNA(2.44±0.14)和蛋白(1.12±0.13)及VEGF mRNA(1.11±0.11)和蛋白(0.97±0.13)表达水平均明显高于非基因治疗组Akt mRNA(1.58±0.13)和蛋白(0.78±0.12)及VEGF mRNA(0.78±0.14)和蛋白(0.67±0.11)以及对照组Akt mRNA(0.64±0.11)和蛋白(0.36±0.12)及VEGF mRNA(0.56±0.11)和蛋白(0.33±0.13)的表达水平(P＜0.01),后2组间比较差异亦均有统计学意义(P＜0.01).结论 pEGFP-C1/Akt体外转染骨髓MSCs促进后肢缺血大鼠血管生成的效果优于单纯MSCs治疗,为基因转染MSCs治疗缺血性疾病提供可能.     

生肌玉红胶原促进大鼠后肢缺血组织血管新生的实验研究

目的探讨生肌玉红胶原在缺血组织中促进血管新生的作用效果及其作用机理。方法 Wistar大鼠48只按随机配对方法随机均分为空白组、对照组（胶原）及实验组（生肌玉红胶原）3组;在大鼠后肢缺血模型基础上于大鼠右后肢缺血组织中植入不同的胶原制剂,分别于模型制作术后3,7、14及28 d取埋植的胶原制剂标本及标本周围约0.5 cm范围的缺血肌肉组织。通过激光散斑成像系统观察大鼠右后肢缺血模型制作术后各时点的血流灌注情况,采用光度计法测定胶原制剂（生肌玉红胶原）内的血红蛋白含量,采用免疫组化染色方法检测标本周围肉芽组织中的微血管计数,采用实时荧光定量RT-PCR方法检测缺血肌肉组织中各时点低氧诱导因子（HIF）-1αmRNA以及血管内皮生长因子（VEGF）mRNA的表达。结果大鼠右后肢缺血模型制作成功即刻大鼠患肢呈现明显的缺血状态,其血流灌注值明显低于术前（P〈0.01）;在术后3 d却呈明显的充血状态,其血流灌注值明显升高,且略高于术前水平,但差异无统计学意义（P〉0.05）;在术后7～14 d大鼠患肢的血流灌注值呈逐渐下降趋势,至术后28 d又开始回升,该3个时点实验组大鼠患肢的血流灌注值均高于空白组（P〈0.05）,对照组与空白组比较其差异均无统计学意义（P〉0.05）;术后7及14 d实验组大鼠肢体的血流灌注值高于对照组（P〈0.05）。各时点实验组胶原标本内血红蛋白含量均高于对照组（P〈0.01）。实验组微血管计数于术后7及14 d高于对照组（P〈0.05）;实验组术后各时点HIF-1αmRNA及VEGF mRNA的表达水平均高于对照组和空白组（P〈0.05）,而对照组与空白组间比较差异无统计学意义（P〉0.05）。结论生肌玉红胶原通过诱导HIF-1αmRNA及VEGF mRNA血管新生相关基因的表达而改善缺血组织的血流灌注,促进微血管新生,从而达到促进组织修复的功效。     

血管内皮生长因子转染内皮祖细胞治疗大鼠缺血后肢的研究

目的 使用血管内皮生长因子(VEGF)转染内皮祖细胞(EPC)治疗大鼠缺血后肢,观察EPC、VEGF转染EPC对大鼠缺血后肢的新生血管和肢体成活的影响.方法 制作SD大鼠后肢缺血模型,将动物随机分为3组,每组6只.将构建的VEGF基因真核表达载体转染入骨髓来源的EPCs后通过尾静脉注射人大鼠体内,并与使用磷酸盐缓冲液(PBS)或EPC的动物进行比较,观察转染VEGF的EPCs在缺血部位的聚集和形成新生血管的情况.结果 (1)动物总残肢率比较,CELL组、VEGF组较PBS组明显增加的肢体恢复率(P<0.05),CELL组肢体恢复率较VEGF组差(P<0.05).(2)毛细血管密度与PBS组比较,各时间点中CELL、VEGF组MVD均明显增多(P<0.05).(3)缺血肢体VEGFa的表达:VEGF组的VEGF蛋白表达较PBS组、CELL组、明显增多(P<0.05);(4)手术后7、14、28 d,与PBS对照组比较,CELL、VEGF组细胞的血流灌注有较大程度的恢复(P<0.01).结论 VEGFa基因转染EPCs对缺血部位的血管新生有重要影响,联合应用VEGFa基因和EPCs治疗缺血后肢有较好的协同作用.     

血管内皮生长因子联合碱性成纤维细胞生长因子对大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生机制的研究

目的探讨血管内皮生长因子(VEGF)联合碱性成纤维细胞生长因子(b FGF)对大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生的机制。方法雄性SD大鼠60只,建立后肢动脉硬化闭塞模型,按随机数字表法将其分为4组:生理盐水组(NS组)、VEGF组、b FGF组及VEGF+b FGF组。NS组、VEGF组隔天于腹腔分别注射生理盐水1 m L、100μg/L rh VEGF 1 m L;b FGF组隔天于后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L rhb FGF 1 m L;VEGF+b FGF组隔天于腹腔注射100μg/L rh VEGF 1 m L及于后肢股内侧多点肌肉注射100μg/L rhb FGF 1 m L,共治疗21 d。第30 d时行血管造影检查观察大鼠后肢动脉硬化闭塞血管再生情况;第3个月时,取后肢股内侧肌肉组织分别应用Western blot和RT-PCR法检测其组织中VEGF和b FGF蛋白和m RNA表达水平。结果 1血管造影结果显示,VEGF+b FGF组侧支血管新生条数明显多于b FGF组(P0.05)、VEGF组(P0.05)及NS组(P0.001),b FGF组和VEGF组也明显多于NS组(P0.05),b FGF组和VEGF组间比较差异无统计学意义(P0.05)。2 Western blot和RT-PCR检测结果均显示,VEGF和b FGF蛋白和m RNA表达在VEGF+b FGF组均明显高于NS组(P0.001)、VEGF组(P0.001)和b FGF组(P0.001);VEGF组和b FGF组组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论 VEGF和b FGF联合应用能够上调大鼠后肢缺血区组织中VEGF、b FGF的含量,促进血管内皮细胞增殖和分化、毛细血管出芽生长,使缺血区血管新生,为外周动脉疾病的临床治疗提供新方法。     

骨髓单个核细胞和骨髓源内皮祖细胞移植促进血流重建的比较研究

目的 比较骨髓单个核细胞(MNCs)和骨髓源内皮祖细胞(EPCs)移植促进血流重建的效果,探讨非内皮祖细胞在血流重建中的作用.方法 获取Lewis大鼠骨髓MNCs,部分MNCs在体外诱导分化为EPCs.采用Lewis大鼠建立单侧后肢缺血模型.建模后3 d,将模型鼠随机分为3组:(1)对照组(n=6),将0.8 mL D-Hank's液注入对照组大鼠缺血侧后肢;(2)MNC组(n=6),将8×10~6个骨髓MNC植入MNC组大鼠缺血侧后肢;(3)EPC组(n=6),将体外培养的8 × 10~6个EPC植入EPC组大鼠缺血侧后肢.细胞移植后3周行大鼠后肢动脉造影,检测缺血侧后肢侧支血管数;切取缺血侧后肢腓肠肌,分别行CD31和α-SMA免疫组化染色,计算毛细血管密度和小动脉密度.结果 MNC组毛细血管密度与EPC组差异无统计学意义[(31.67 ± 7.87)个/HP vs.(32.83±5.38)个/HP,P＞0.05].而均高于对照组(19.67 ± 4.80个/HP)(P＜0.05);MNC组侧支血管数与EPC组差异无统计学意义[(4.17±0.75)个vs.(4.50 4±1.38)个,P＞0.05],但均高于对照组[(2.50 ± 1.5)个](P＜0.05);MNC组小动脉密度与EPC组差异无统计学意义[(4.83 ± 1.47)个vs.(5.50 ± 2.35)个,P＞0.05],亦均高于对照组[(2.17±0.98)个](P＜0.05).结论 在骨髓干细胞移植治疗肢体缺血性疾病中,非内皮祖细胞在血流重建中所起的作用与EPC相似.     

BMSCs移植对大鼠脊髓损伤后VEGF基因和血管生成的影响

目的研究BMSCs移植对大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后运动功能恢复、VEGF基因表达和血管生成的影响,探讨BMSCs治疗SCI的机制。方法取5只4周龄Wistar雄性大鼠骨髓,分离培养BMSCs,取第3～4代细胞进行实验。取Wistar雌性成年大鼠87只,体重220～250 g,随机分为假手术组(A组,21只)、DMEM注射组(B组,33只)和BMSCs移植组(C组,33只)。A组仅咬除T8～10棘突和椎板;B、C组参照Nystrom方法制备T8～10 SCI模型,伤后30 min C组注射BMSCs(共3.0×105个),B组注射等量DMEM。于术后3、7、14、28 d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分法评价大鼠后肢运动功能;术后3、7、14、28 d应用Ⅷ因子免疫组织化学染色行微血管计数观测血管生成情况;术后1、3、5 d应用RT-PCR法检测损伤脊髓组织内VEGF mRNA的表达。结果术后各时间点B、C组大鼠后肢功能随时间延长均有不同程度恢复,各时间点BBB评分与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。术后28 d,C组BBB评分显著高于B组(P<0.05),其余时间点B、C组比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后3 d,B、C组损伤周围区脊髓灰质腹侧角内微血管数目明显少于A组(P<0.05);术后7、14、28 d与A组比较差异无统计学意义(P>0.05)。C组术后3、7 d脊髓灰质腹侧角内微血管数目与B组比较差异无统计学意义(P>0.05);但术后14、28 d显著高于B组(P<0.05)。各组术后各时间点损伤周围区脊髓白质内的微血管数目比较差异均无统计学意义(P>0.05)。RT-PCR检测示,A组大鼠脊髓组织内VEGF mRNA表达水平较低。B、C组与A组相比,于术后1 d开始VEGF mRNA表达增加,3 d时表达达峰值,5 d时表达下降但仍高于A组,各时间点与A组比较差异均有统计学意义(P<0.05);C组各时间点均高于B组(P<0.05)。结论 BMSCs可能通过上调VEGF基因表达和增加脊髓内新生血管而促进大鼠SCI后运动功能恢复。     

骨髓间充质干细胞联合血管内皮生长因子基因治疗肢体缺血的实验研究

目的 观察骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cell,BMSC)联合血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因治疗对家兔肢体缺血模型的疗效.方法 切除新西兰兔右后肢全长股浅动脉并结扎股深动脉以建立兔后肢缺血模型,随机分为空质粒对照组(EP组)、骨髓间充质干细胞组(BMSC组)、VEGF基因治疗组(VEGF组)及联合治疗组(BV组),每组各8只.分别于治疗后28 d及30 d进行动脉造影及VEGF免疫组化染色.结果 EP组、BMSC组及VEGF组的新生血管计数组间比较差异无统计学意义(P＞0.05).BV组的新生血管计数较其余3组明显增加,差异有统计学意义(F=35.47,P＜O.01).BMSC组及VEGF组的VEGF免疫组化染色呈阳性表达,与EP组比较差异有统计学意义(F=764.32,P＜0.01).BV组的VEGF免疫组化染色呈强阳性表达,与其余3组比较差异有统计学意义(F =764.32,P＜0.01).结论 BMSC联合VEGF基因治疗兔肢体缺血可使VEGF获得稳定而有效的表达,从而改善肢体缺血.     

同种异体骨髓基质细胞移植治疗大鼠肢体缺血的实验研究

目的探讨同种异体骨髓基质细胞(MSCs)移植对SD大鼠缺血肢体治疗机制和规律,为MSCs移植治疗肢体缺血提供理论基础。方法体外全骨髓培养法培养雄性SD大鼠MSCs至三代。60只SD大鼠经结扎腹主动脉及双侧腹壁阴部动脉造成双下肢缺血模型,随机分为对照组(n=30)及移植组(n=30),造模后3天度过反应期后移植组右下肢腓肠肌及股二头肌内分5点注射移植含1×106个MSCs细胞悬液0.5ml,对照组同法注射生理盐水0.5ml。按移植后1周、2周、4周、6周、8周时两组再随机分为5个亚组(n=6),分别取动物麻醉后穿刺双侧髂静脉血行血氧分压测定,处死动物取左前肢,左后、右后肢骨骼肌标本4%多聚甲醛固定,制切片。行Y染色体性别决定区(SRY)原位杂交,血管内皮生长因子(VEGF)-mRNA原位杂交、HE染色,计数VEGF-mRNA阳性细胞数和毛细血管数。对照组仅作右后肢的相关检测。结果 SRY:移植组右后肢、左后肢、骨骼肌间间隙内有阳性细胞构成血管样结构,有的在血管周围,未见到呈阳性的骨骼肌细胞。左前肢的骨骼肌周围筋膜内偶尔可见到阳性细胞。对照组无阳性细胞发现。VEGF-mRNA原位杂交:对照组和移植组右后肢、左后肢VEGF-mRNA呈进行性升高(P0.001),而左前肢则无明显升高(P=0.694)。在第1周时对照组与移植组相比无统计学差异(P=0.079),随后移植组明显高于对照组(P0.001)。静脉血氧分压:对照组及移植组髂静脉血氧分压呈进行性升高(P0.001),移植组右后肢髂静脉氧分压较左后肢及对照组明显高(P0.05)。毛细血管计数:对照组及移植组右后肢、左后肢的毛细血管计数呈进行性增高(P0.05),而左前肢则无统计学意义(P=0.055),移植组中右后肢毛细血管计数明显高于左后肢及对照组(P0.05)。HE染色:未见明显组织细胞核异常分裂改变。结论移植的MSCs可以在同种异体动物体内长期生存、分化,促进缺血肢体的VEGF-mRNA的表达和毛细血管的成长。     

纳米血管内皮生长因子在治疗下肢缺血促进血管再生成中的作用

目的　利用家兔后肢缺血模型 ,观察纳米材料聚乳酸聚乙醇酸共聚物 (poly dl lactic co glycolicacid ,PLGA) ,包载血管内皮生长因子 (VEGF16 5 )基因 ,经局部肌肉注射后 ,外源基因在局部缺血组织中的转染及强度 ,以及缺血部位的血管新生状况。　方法　制备VEGF16 5 真核表达质粒 ,制备包载VEGF16 5 基因的纳米粒子 ,并检测其理化性质和体外释放曲线。建立家兔后肢缺血模型 2 4只 ,其中4只为对照组 ,只行股动脉及其分支结扎切断术 ;2只为空白纳米粒子组 ,局部缺血肌肉注射空白纳米粒子 ;10只应用裸质粒VEGF16 5 转染 ,8只采用纳米技术包载VEGF16 5 转染。直接缺血部位肌肉内多点注射 ,进行局部定位基因转染。术后 14d行血管造影 ,了解缺血部位侧枝形成情况。处死兔子 ,取股二头肌 ,内收大肌 ,做病理切片 ,免疫组化染色 ,观察VEGF16 5 的表达 ,测定毛细血管密度。应用逆转录 聚合酶链反应了解VEGF16 5 在骨骼肌中的表达 ,并对不同的转染技术进行半定量分析。　结果　转基因治疗 14d后 ,转染VEGF基因组血管造影可见明显新生血管和侧枝循环形成 ,免疫组化染色可见VEGF16 5 蛋白表达水平增高 ,缺血肌肉血管数增多 ,纳米VEGF16 5 治疗组与裸质粒VEGF16 5 治疗组的毛细血管密度明显高于对照组 ,有显著性差异 (P     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。