RT-PCR半定量检测外周血单个核细胞中fgl2凝血酶原酶基因的表达

目的：探讨逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)半定量检测fgl2凝血酶原酶在正常人外周血单个核细胞(PBMNC)中的表达及其规律。方法：根据genbank中fgl2凝血酶原酶基因序列设计一对引物，以β—actin的表达为内参照，采用RT—PCR方法半定量检测体外培养体系中不同时点的PBMNC中fgl2凝血酶原酶mRNA的表达及变化规律。结果：fgl2凝血酶原酶mRNA的表达水平在新鲜分离的PBMNC中表达最高，随着培养时间的延长而逐渐降低，至72h几乎不能检测出。结论：RT—PCR方法半定量检测PBMNC中fgl2凝血酶原酶mRNA灵敏度高；PBMNC中的fg12凝血酶原酶在体外培养体系中不能持续表达。     

软肝冲剂对肝硬化患者外周血单核细胞TGF-β1IFN-γ和IL-8 mRNA表达的影响

目的：观察软肝冲剂治疗前后肝硬化（LC）患者外周血单核细胞（PBMC）中转化生长因子（TGF-β1）、干扰素-γ（IFN-γ）和白介素18（IL-18）的mRNA表达及分泌水平的变化。探讨软肝冲剂对肝硬化治疗的作用机制。方法：RT—PCR检测20例正常对照组和25例肝硬化患者软肝冲剂治疗前、治疗2、4、6月后PBMC中TGF-β1、IFN-γ和IL-8的mRNA表达水平;ELISA法检测PHA体外诱生PBMC培养上清中TGF-β1、IFN-γ和IL-18分泌水平。结果：肝硬化患者PBMC中的TGF-β1 mRNA表达水平及TGF-β1分泌水平显著高于对照组（P〈O．01）。而IFN-β1和IL-18的mRNA表达水平及IFN-γ和IL-18分泌水平显著低于对照组（P〈0．01）。经软肝冲剂治疗后,TGF-β1 mRNA表达水平及分泌水平逐渐下降,6个月后与治疗前相比有显著差异（P〈0．01）,但仍高于对照组;IFN-γ和IL-18的mRNA表达水平及IFN-γ和IL-18分泌水平逐渐上升,6个月后与治疗前相比有显著差异（P〈0．01）,但仍低于对照组。结论：软肝冲剂能通过下调PBMC中TGF-β1 mRNA和上调IFN-γ和IL-8 mRNA表达,对肝硬化有较好的疗效。     

携带IFN-5α基因的HBV DNA质粒构建及其表达

目的构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒，并在真核细胞中表达。方法在pBR322-B-HBV质粒(含adr Ⅰ型HBV DNA)中插入人工合成片段破坏其HBV—X基因区，再与IFN-5α片段连接，最后克隆入真核表达载体pcCNA3，获得携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒pcDNA3-KN-F1F2-IFN-5α。同时构建两组对照质粒，即连接完整HBV DNA的真核表达质粒和连接X基因缺陷的HBV DNA真核表达质粒，将上述3种质粒以脂质体法同时转染HepG2细胞，G418筛选出稳定表达系统后选用荧光定量PCR法、ELISA法、RT-PCR法检测3种包装病毒。的复制表达以及IFN-5α的表达水平。结果获得目的真核表达质粒pcDNA3-KN—F1F2-IFN-5α；目的质粒转染HepG2细胞后其包装病毒的复制表达水平均较两个对照组降低；插入的IFN-5α片段可以在mRNA以及蛋白质水平表达。结论成功构建携带人IFN-5α基因的X基因缺陷的HBVDNA真核表达质粒，并能在HepG2真核细胞中表达。     

广西麻鸭乙型肝炎感染病毒动物模型的实验研究

目的探讨广西麻鸭作为乙型肝炎病毒感染动物模型的可能性。方法应用广西1 d龄雏麻鸭经腹腔感染鸭乙型肝炎病毒(DHBV),13 d后采用实时荧光定量PCR法检测麻鸭血清DHBV含量,筛选出DHBV强阳性鸭。结果共检测148份麻鸭血清标本,其中DHBV阳性标本136份,阳性率为91.9%。结论广西麻鸭可作为乙型肝炎病毒感染动物模型。实时荧光定量PCR法检测DHBV敏感性较高,重复性好,可用于DHBV检测。     

豚鼠TNF、IFN-γ、IL-1荧光定量PCR检测方法的建立

目的建立测定豚鼠肺脏中TNF、IFN-γ、IL-1的荧光定量PCR方法。方法根据已有序列设计TNF、IFN-γ、IL-1基因检测引物,建立荧光定量PCR检测方法。结果用建立的荧光定量PCR检测豚鼠TNF、IFN-γ、IL-1基因的溶解曲线峰值单一,扩增水平稳定。结论成功建立了检测豚鼠TNF、IFN-γ、IL-1基因的荧光定量PCR方法,为豚鼠先天免疫方面研究提供技术支持。     

新疆妇女宫颈脱落细胞HPV16E6基因的PCR及荧光定量PCR检测

目的:了解新疆妇女人乳头瘤病毒16型(13PV16)的感染状况。方法:用PCR及荧光定量PCR(FQ—PCR)方法检测妇科门诊普通患宫颈脱落细胞及分泌物中人乳头瘤病毒16型E6基因(HPV16E6),以普通门诊患宫颈脱落细胞及分泌物DNA作为样本,以人乳头瘤病毒(HPV16E6)作为扩增的靶基因,同时以人β—actin基因片段作为细胞内参照,借助于两对引物,两个特异的荧光探针,用荧光定量PCR(FQ—PCR)方法对这两个片段进行扩增,得到单位细胞HPV16E6的相对含量;同时进行定性PCR检测。结果:宫颈脱落细胞标本159例中,β—actin阳性154例;HPV16E6阳性共12例,阳性率为7．8％。PCR与FQ—PCR结果基本一致,但FQ—PCR更敏感。结论:建立的FQ—PCR检测宫颈脱落细胞内：HPV16E6基因的方法,能反映单位细胞内病毒的复制情况,可用于性传播感染(STI)及宫颈癌的筛查。     

猪囊尾蚴病重组DNA疫苗pcDNA 3.1-TSO45-4B在小鼠体内的表达及诱导的细胞免疫效应

目的观察基于六钩蚴期的猪囊尾蚴病基因疫苗pcDNA3、1-TSO45—4B在小鼠体内的表达及诱导的小鼠细胞免疫应答。方法将真核重组表达质粒pcDNA3．1-TSO45—4B肌注小鼠，RT—PCR方法扩增出目的条带；ELISA方法检测小鼠血清细胞因子IL-2、IL-4及IFN-γ含量。结果RT—PCR产物为单一条带，大小为456bp，与TSO45—4B大小一致。免疫小鼠第2周细胞因子含量达到较高水平，第4周达到最高水平，第8周开始下降。结论基于猪囊尾蚴保护性抗原TSO45—4B的DNA疫苗能在小鼠体内表达并有效诱导细胞免疫效应。     

TLR9参与巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉的作用研究

目的探讨TI．R9在巨噬细胞吞噬马尔尼菲青霉中所起的作用。方法半定量RT—PCR检测马尔尼菲青霉及其基因组DNA对RAW264．7细胞TLR9基因转录的影响；CFU检测TLR9对RAW264．7细胞吞噬马尔尼菲青霉能力的影响。结果马尔尼菲青霉菌丝相和酵母相、基因组DNA及人工合成CpG—ODN均可使RAW264．7细胞TLR9基因转录上调，且其上调作用均可被氯喹阻断。TLR9可增强RAW264．7细胞对马尔尼菲青霉分生孢子的吞噬能力但不能增强其对酵母细胞的吞噬能力。结论表明巨噬细胞TLR9参与对马尔尼菲青霉分生孢子的吞噬过程。     

外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响

目的研究外源Smad7基因对原代肝星状细胞（HSC）活性和基因表达调控的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离SD大鼠原代HSC，并予转化生长因子口。（TGFβ1）刺激，同时分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP感染原代HSC，RT—PCR法检测TGFβ1、Smad3 mRNA、Smad7 mRNA在HSC中的表达，免疫细胞化学法检测HSC中a一平滑肌肌动蛋白（a—SMA）和Smad7表达。结果RT—PCR显示，与TGFβ1对照组比较，AdSmad7组Smad7 mRNA表达显著上调（P〈0．05），但TGFβ1、和Smad3 mRNA表达差异无统计学意义。免疫细胞化学染色显示，与其他各组比较，AdSmad7组HSC胞质中Smad7表达最高，α—SMA表达则明显降低（P〈0．01）。结论重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7可在HSC中高效表达；外源Smad7基因可阻断TGFβ1，对HSC的活化作用，但对Smad3和TGFβ1，mRNA表达无明显影响。     

干扰素γ促进胰岛β细胞中白细胞介素18和白细胞介素1β转换酶的表达

目的：探讨白细胞介素18（IL－18）和IL－1β转换酶（caspase-1 )在胰岛β细胞的表达状况及其调控机制。方法：大鼠胰岛素瘤（RIN）细胞，FACS纯化的大鼠胰岛β细胞，大鼠离体胰岛和干扰素调节因子1（IRF－1）基因敲除小鼠的离体胰岛与细胞因子孵育后，用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）方法检测IL－18和caspase-1 mRNA的表达，用Western blot方法检测IL－18蛋白的表达。结果：（1）干扰素γ（IFN-γ）可增强IL－18mRNA在RIN细胞，纯化大鼠β细胞和大离体胰岛中的表达，该效应在IRF－1基因敲除小鼠胰岛中未见明显变化，（2）IFN-γ显著增强caspase-1mRNA在RIN细胞和大鼠离体胰岛中的表达，该效应在IRF－1基因敲除小鼠胰岛中完全消失；（3）在RIN细胞的培养上清液和细胞裂解物中未能检测到IL－18蛋白。结论：IFN-γ上调IL－18和caspase-1在胰岛β细胞中的表达，IL－18的表达不受转录因子IRF－1的影响，caspse-1的表达呈IRF－1依赖性。     

携带IFN—β基因的丙型肝炎病毒微型基因组构建及抑制病毒复制的效应

目的构建丙型肝炎病毒（HCV）反应性干扰素（IFN）-β的微型基因组及其抑制效应的初步评价。方法提取poly I：C刺激的淋巴细胞总RNA,RT-PCR扩增IFN-β基因,克隆入前期构建的HCV微型基因组pT7-5U△131-315rI3Urz;PCR并鉴定插入方向,将反向插入的质粒命名为pT7-5U△131-315rIFNI3Urz。将微型基因组5U△131-315rIFNI3URz克隆入pcDNA3.1载体,获得pCMV-5U△131-315rIFNI3URz。将体外转录的5U△131-315rIFNI3URz RNA转染Huh7.5BB7细胞,48 h后检测IFN-β的表达。将pCMV-5U△131-315rIFNI3URz转染Huh7.5 JFH-1细胞系,荧光实时定量PCR法测定细胞中HCV RNA。结果成功建立了Huh7.5JFH-1细胞系;含有IFN-β的微型基因组在复制子细胞和HCV感染细胞中可以特异表达IFN-β;携带IFN-β的HCV微型基因组可以降低细胞中病毒的RNA拷贝水平,具有一定的剂量依赖效应。结论反向插入IFN-β基因的HCV微型基因组进入HCV感染细胞内表达IFN-β并靶向抑制病毒的复制,为抗HCV感染研究提供了一个新的方法和思路。     

白藜芦醇对JurcatT细胞分化为Th1/Th2细胞作用的影响及机制

目的探讨白藜芦醇调节Jurkat T细胞分泌为Th1/Th2型细胞作用的影响。方法将不同浓度的白藜芦醇作用于受植物血凝素（PHA）刺激的Jurkat T细胞,于不同时间点分别用ELISA法检测Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-10;RT-PCR法检测T-bet和GATA-3 mRNA表达。结果白藜芦醇作用后IFN-γ、IL-10及T-bet mRNA、GATA-3 mRNA的表达均明显降低,具有浓度和时间依赖性。结论白藜芦醇对受PHA刺激的JurcatT细胞由Th0向Th1、Th2细胞分化起抑制作用。     

HBV感染对IFN-γ表达的影响

目的探讨HBV感染对干扰素-γ(IFN-γ)表达的影响。方法选择HBeAg阳性的慢性乙型肝炎(CHB)患者30例、HBeAg阴性的CHB患者30例、慢性HBV携带者30例、健康对照者30例,采用巢式PCR检测各组血中HBV DNA水平,Real Time RT-PCR检测外周血单个核细胞(PBMC)中IFN-γmRNA的表达水平。结果 90例慢性HBV感染者PBMC中IFN-γmRNA水平较正常对照组明显下降(P<0.01),其中慢性HBV携带组IFN-γmRNA水平最低,其次为HBeAg阳性组;慢性HBV感染者血清HBV-DNA与PBMC中IFN-γmRNA水平呈负相关(P<0.05)。结论慢性HBV感染者IFN-γ表达水平下降可能与HBV感染有关,HBV感染可引起细胞免疫功能紊乱,可能是HBV感染慢性化的主要原因之一。     

雌激素受体β过表达对大肠癌细胞增殖凋亡的影响

目的观察雌激素受体β（ERβ）过表达对大肠癌细胞增殖和凋亡的影响,并探讨其机制。方法以脂质体介导的ERβ基因转染SW480细胞,G418筛选阳性克隆（SW480-C1-ERβ）。RT—PCR及WesternBlot鉴定ERβ的过表达。以正常SW480细胞和转染了空质粒的SW480细胞（SW480-pEGFP—C1）作为对照,在无雌激素或有雌激素作用的条件下,采用MTT法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量RT—PCR方法检测凋亡相关基因survivin和Bax表达。结果SW480和SW480-pEGFP—C1细胞中ERβ mRNA和蛋白表达较低,而稳定转染的SW480-C1-ERβ细胞中ERβmRNA和蛋白表达明显增加。在有或无雌激素作用的条件下均可发现,与SW480细胞或SW480-pEGFP—C1细胞比较,SW480-C1-ERβ细胞增殖速度减慢,凋亡率明显增高,survivin表达减低,Bax表达增高;在SW480-C1-ERβ细胞中,有雌激素作用者较无雌激素作用者以上变化更明显。结论ERβ过表达可以同时以配体非依赖性和配体依赖性的方式抑制细胞增殖和增加细胞凋亡,可能与调控凋亡相关基因survivin和Bax表达有关。     

DNA甲基化与组蛋白去乙酰化对人类白细胞抗原-B27基因表达调控的研究

目的 研究DNA甲基化酶抑制剂和组蛋白去乙酰化酶抑制剂对人类白细胞抗原(HLA)-B27基因表达的调控作用.方法 构建表达Hela-B27启动子的Hela稳定转染细胞株,使用荧光素酶检测DNA甲基化酶抑制剂(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACI)[丁酸钠(NaB),曲古霉素(TSA).丙戊酸(VPA)和Hydralazine]对HLA-B27启动子活性的影响,及其各种被抗炎症细胞因子抗体[抗肿瘤坏死因子(TNF)-α,抗干扰素(IFN)-β,抗IFN-γ,Infiximab]对其调节作用.然后使用5-Aza-CdR和HDACI培养表达HLA-B27基因组DNA的CCL6稳定细胞株,使用实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测HLA-B27 mRNA表达水平.结果 NaB和VPA可使HLA-B27启动子活性明显增高(24.0+1.7)倍和(17.4±2.2)倍(P＜0.05),且VPA和TNF-α,IFN-α,IFN-β,IFN-γ和佛波酯(PMA)对HLA-B27启动子活性有协同诱导作用.实时定量PCR结果显示NaB,TSA,VPA和5-Aza-CdR均可使HLA-B27 mRNA水平明显增加.结论 DNA甲基化与组蛋白去乙酰化可明显上调HLA-B27基因表达水平.     

外周血单个核细胞干扰素刺激基因表达水平与慢性乙型肝炎HBV复制的关系

目的研究外周血单个核细胞干扰素刺激基因(STING)表达水平与慢性乙型肝炎病毒(HBV)复制的关系。方法纳入2016年12月至2018年12月于我院收治的68例慢性乙型肝炎患者为观察组,另选取同期我院收治的54例健康体检者为正常对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR),检测以上对象STING mRNA及干扰素基因α-干扰素(IFN-α)mRNA、β-干扰素(IFN-β)mRNA相对表达量并进行比较。分析慢性乙型肝炎患者不同乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)载量与STING及上述干扰素基因相对表达量的关系,并观察患者STING mRNA与HBV DNA载量及上述干扰素基因相对表达量的相关性。结果观察组STING mRNA、IFN-αmRNA、IFN-βmRNA相对表达量显著高于正常对照组(P0.05)。慢性乙型肝炎患者HBV DNA载量10~6组、10~5组、10~4组STING mRNA相对表达量均显著高于HBV DNA载量≤10~4组(P0.05)。慢性乙型肝炎患者STING mRNA相对表达量与HBV DNA载量呈弱相关性(r=0.340,P=0.000),与IFN-αmRNA、IFN-βmRNA相对表达量均呈正相关(r=0.517、0.511,P=0.000、0.000)。结论慢性乙型肝炎患者机体内STING表达升高,具有干扰HBV转录复制作用,临床上应引起足够重视。     

宫内感染HBV免疫失败儿童Th1和Th2型细胞因子mRNA转录研究

目的 探讨Th1型和Th2型细胞因子mRNA转录变化对宫内感染乙型肝炎病毒(HBV)后免疫失败的影响。方法 采用半定量逆转录—聚合酶链反应(RT—PCR)对29例宫内感染免疫失败儿童、9例宫内感染免疫有效儿童及25例正常免疫儿童外周血单个核细胞在丝裂原(植物血凝素和细菌脂多糖)、酵母重组乙型肝炎表面抗原(HBsAg)及无刺激物时的γ—干扰素(IFN—γ)、白细胞介素—4(IL—4)mRNA表达水平进行检测。结果 IFN—γ mRNA自发表达在免疫失败组增高(95％可信限免疫失败组1665—3089，对照组763—1609，P＝0．008)。与自发表达比较，在HBsAg刺激时，对照组、有效组和免疫失败组均表现为转录增加，但免疫失败组增加值显著低于对照组(小剂量HBsAg刺激增加值95％可信限对照组899—1703，免疫失败组170—854，P＝0．004)。IL—4 mRNA自发转录和丝裂原刺激时转录水平在3组间差异无显著性，大剂量HBsAg刺激时对照组表现为转录增加(增加值95％可信限213—861，P＝0．011)，而免疫失败组无显著增加。丝裂原刺激时IFN—γ mRNA转录水平和大剂量HBsAg刺激时IFN—γ mRNA／IL—4mRNA与血清丙氨酸转氨酶水平正相关。结论 宫内感染HBV免疫失败儿童存在Th1型和Th2型细胞因子的特异性反应低下，Thl型细胞因子非特异性反应增强与肝细胞损伤有关。     

雷公藤多甙对NOD小鼠1型糖尿病免疫治疗的机理

目的观察雷公藤多甙（TWP）对雌性非肥胖型糖尿病小鼠（NOD小鼠）1型糖尿病免疫预防作用并初步讨论其机理。方法采用NOD小鼠环磷酰胺加速发病,给TWP后观察糖尿病发病率、半定量RT—PCR分析胰腺组织干扰素γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（INF—α）、白介素-10（IL-10）mRNA的表达。结果TWP组实验结束时糖尿病发病率（43．33％）低于对照组（71．43％）（P〈0．05）;胰腺组织IFN-γ、TNF—α mRNA的表达降低（P〈0．01）,IL-10 mRNA的表达无明显改变。结论TWP可预防NOD鼠糖尿病的发生,其机制可能与下调胰腺组织Th1细胞因子表达有关。     

HIV-1感染对T淋巴细胞p16INK4A基因甲基化及其表达的影响

目的；p16^INK4A基因在与AIDS相关的疾病中的表达缺陷，DNA甲基化可使基因转录下调。本研究观察人类免疫缺陷病毒I型（HIV－1）感染对T淋巴细胞的p16^INK4A基因的表达影响及其途径。方法：建立感染有野生型和突变体HIV－1病毒的T淋巴细胞Hut78细胞系，以RT－PCR、定量PCR和Western blotting检测细胞感染后不同时间的DNA甲基化酶（DNMT）1、3a和3b的mRNA（提高40％以上）和蛋白质水平；并由甲基化特异PCR（MSP）了解p16^INK4A基因甲基化改变，及通过RT－PCR研究该基因的mRNA表达情况。结果：无论野生型抑或突变体HIV－1感染，都能使Hut78细胞中DNMT1表达增强，DNMT3a和DNMT3b无明显变化。HIV－1感染可引起p16^INK4A基因启动子区甲基化水平提高和基因转录水平下调。结论；HIV－1感染可使p16^INK4A甲基化水平升高和表达降低，且与该病毒有无复制无关。     

乳凝集素调节EEI-10细胞IL-2,IL-4及IFN-γ的分泌表达

目的:探讨乳凝集素调节肠相关淋巴组织淋巴细胞分泌表达细胞因子的作用.方法:应用基因重组技术从MCF-7乳腺癌细胞中提取总RNA,通过逆转录PCR方法得到目的基因(乳凝集素)片段,利用酶切,连接等技术,将目的基因构建至PET28载体内,转化入DH5a细胞后,鉴定阳性质粒;将含有目的基因的阳性质粒转化入表达细胞BL-21,IPTG诱导表达目的蛋白乳凝集素,应用特异性镍鏊合的亲和层析柱得到纯化的目的蛋白.利用H3-Tdr法明确乳凝集素剂量与人类肠上皮内淋巴细胞株EEI-10细胞增殖之间的关系.给予适当剂量乳凝集素作用于EEI-10细胞后,利用ELISA方法检测EEI-10分泌IL-2,IL-4及IFN-γ浓度,应用RT-PCR方法检测IL-2,IL-4及IFN-γmRNA表达.结果:酶切阳性的质粒经测序证实与基因文库一致.所得纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE电泳和特异性抗体鉴定,明确为目的蛋白乳凝集素.利用H3-Tdr法检测乳凝集素剂量与细胞增殖之间的关系,结果显示乳凝集素作用剂量为250mg/L时淋巴细胞增殖显著.给予乳凝集素处理后细胞培养上清中IL-2(P=0.0394)和IFN-γ(P=0.0082)的含量高于未处理细胞组,而IL-4没有显著的增高;同时处理后IL-2mRNA表达量升高,IL-4mRNA表达量无显著性改变,IFN-γmRNA表达量明显增高并高于PHA刺激组.结论:乳凝集素具有上调EEI-10细胞分泌和表达IL-2和IFN-γ的作用.