淫羊藿甙对MC3T3-E1细胞Smad1,5作用的实验研究

目的 检测淫羊藿甙(icariin,ICA)对MC3T3-EI中Smad1,5 mRNA及蛋白的影响.方法 DMEM高糖、胎牛血清培养下的MC3T3-E1细胞按ICA刺激浓度0、10、40及80 ng/ml分为四组,各组接种于6孔板中,接种细胞数目约为3×105个/孔,分别于给药后24、48及72 h,用半定量RT-PCR技术测定Smad1,5 mRNA的量,以Western blot评价Smad1,5蛋白的量.并于给药72h后用免疫组织化学定位Smad1,5蛋白的表达.采用SPSS 13.0软件进行统计学分析.结果 RT-PCR显示ICA刺激24 h后,0、10、40、80 ng/ml各组Smad1.5 mRNA量的表达无统计学差异;刺激48 h后,0 ng/ml组Smad1mRNA表达量检出极少,Smad5 mRNA未检出;至72 h时,0 ng/ml组二者均未检出,而10、40、80 ng/ml各组在刺激48、72 h时,Smad1,5 mRNA保持较高水平,各组Smad1,5 mRNA的表达量较0 ng/ml组具有统计学意义.Westem blot蛋白印迹显示10、40、80 ng/ml各组的Smad1蛋白表达于不同时间点较0ng/ml组明显增加,0 ng/ml组仅于刺激72 h后少量检出.Smad5蛋白表达除0 ng/ml组外,于10、40、80ng/ml各组在不同时间点均有检出,较0 ng/ml组具有统计学意义.免疫组织化学显示10、40、80 ng/ml组,于胞质及核内Smad1,5蛋白的表达较0 ng/m组均增多.结论 淫羊藿甙可能通过上调Smad1,5mRNA及蛋白的表达来促进成骨细胞分化.     

淫羊藿甙促进成骨细胞增殖与分化的作用及其机制

 目的 探讨淫羊藿甙对骨形态发生蛋白细胞信号通路Smad1、Smad5和Smad4表达的调节作用及促进成骨细胞增殖与分化的机制。方法 在体外分别用含淫羊藿甙0、10^-9、10^-8 和10^-7 mol/L的条件培养液干预MC3T3-E1细胞。给药后第1天、2天和3天,分别应用四甲基噻唑蓝法绘制细胞生长曲线并计算细胞群体倍增时间,用速率分光光度法测定碱性磷酸酶含量,用RT-PCR和Western blot技术检测Smad1、Smad5、Smad4及骨钙素、Runx2、骨形态发生蛋白-2、骨保护素mRNA的表达,于细胞生长的第21天观察钙结节数量。结果 淫羊藿甙含量为10-8 mol/L时,MC3T3-E1细胞增殖能力最强,碱性磷酸酶活性和钙结节数量明显增加;淫羊藿甙作用细胞第1天、2天和3天时,10-8 mol/L组细胞Smad1、Smad5和Smad4 mRNA的表达量始终保持较高水平,第3天时10^-9 mol/L和10^-7 mol/L组表达明显减少;第2天时,10^-8 mol/L组细胞Runx2、骨形态发生蛋白-2、骨保护素mRNA和骨钙素、Smad1、Smad5和Smad4蛋白表达明显增加。结论 淫羊藿甙通过直接刺激 MC3T3-E1细胞的骨形态发生蛋白-2、Runx2、Smad1、Smad5和Smad4的表达,且以表达水平同步增高的方式促进其成骨性分化。     

葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞生物学作用的比较研究

目的 对比葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞增殖和分化的影响。方法 将小鼠骨髓基质干细胞定向诱导分化为成骨细胞，取第3、4代细胞，以rhBMP-2为阳性对照，MTT法观察葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞的增殖作用，碱性磷酸酶（ALP）比活性测定及钙结节计数观察葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞分化的影响。结果 20μg／ml的淫羊藿甙可显著促进成骨细胞的增殖；20μg／ml淫羊藿甙及50μg／ml葛根素均能提高成骨细胞的碱性磷酸酶活性，并使矿化结节的形成明显增多。结论 淫羊藿甙不仅能促进成骨细胞的分化，还能增强其增殖能力，而葛根素主要是通过刺激分化来增强成骨细胞的活力。     

MAPK信号通路在淫羊藿甙促进成骨细胞Cbfa1蛋白表达中的作用

目的 观察淫羊藿甙对体外培养大鼠成骨细胞丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路的影响以及MAPK信号通路在淫羊藿甙促成骨细胞核心结合因子α1(core binding factor-1,Cbfa1)蛋白表达中的作用,以探讨淫羊藿甙对成骨细胞作用的信号传导机制.方法 用酶消化法分离24 h内新生SD大鼠颅盖骨成骨细胞,进行原代培养.在培养液中加入淫羊藿甙(10 ng/mL),作用于成骨细胞5 min、10 min、30 min、60 min,抽提总蛋白,用Western blot法检测细胞中ERK、p-ERK、P38和p-P38蛋白的表达.用雌二醇(10-8 mol/L)作用于成骨细胞5 min、10 min、30 min,同上法检测细胞中ERK、p-ERK、P38和p-P38蛋白的表达.用淫羊藿甙(10 ng/mL)、雌二醇(10-8 mol/L)和u0126或SB203580单独或共同干预成骨细胞24 h,抽提核蛋白,用Western blot法检测Cbfa1蛋白的表达.结果 ①淫羊藿甙作用于成骨细胞,30 min时可促进ERK蛋白的磷酸化,并可持续至60 min,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05);淫羊藿甙作用于成骨细胞,5 min时即可促进P38蛋白的磷酸化,在30 min时达高峰,并可持续至60 min,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05).②雌二醇作用于成骨细胞,在30 min时可促进ERK蛋白的磷酸化,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05);雌二醇作用于成骨细胞,在10 min时可促进P38蛋白的磷酸化,并可持续至30 min,和空白组比较,差异有显著性(P<0.05).③淫羊藿甙和雌二醇均能促进成骨细胞中Cbfa1蛋白的表达,和空白组相比,差异有显著性(P<0.05).u0126和SB203580可以抑制淫羊藿甙和雌二醇促进Cbfa1蛋白表达的作用.结论 ①淫羊藿甙和雌二醇均可以激活成骨细胞中ERK/MAPK和P38/MAPK信号通路;②淫羊藿甙和雌二醇均能促进成骨细胞中核转录因子Cbfa1的表达,并且ERK/MAPK和P38/MAPK信号通路参与了此过程.     

牵拉应力下成骨细胞(MC3T3-E1)的增殖与matrilin-2 mRNA的表达

目的观察三维培养的克隆鼠颅骨成骨细胞(MC3T3-E1)在特定的周期性牵拉应力刺激下,其增殖能力、碱性磷酸酶(ALP)活性及matrilin-2mRNA表达的变化。方法以明胶海绵(2cm×2cm×0.25cm)作为MC3T3-E1的三维培养支架,每块明胶海绵种植细胞悬液100μl,细胞数目为1.25×105个。明胶海绵拉伸度为5%、频率60r/min、15min/h,牵拉后2、4、6、8、10d分别从牵拉组和对照组中各取3个样本,行细胞计数、细胞及培养液的ALP活性测定、细胞的matrilin-2mRNA测定。结果第2天牵拉组的细胞数目即多于对照组(P<0.05),细胞倍增时间从71h提前至55h。除第2天外,牵拉组细胞的ALP活性低于对照组(P<0.05),两组培养液中ALP活性均处于低水平,无显著差别。第4天牵拉组matrilin-2mRNA的表达水平高于对照组(P<0.01),之后保持高水平表达。结论周期性牵拉应力促进三维培养的MC3T3-E1的增殖,抑制细胞的ALP活性,促进matrilin-2mRNA的表达,细胞的分化能力增强。     

蓇密钙片与马鹿角多肽对成骨细胞增殖分化的研究

目的观察蓇密钙片及马鹿角多肽对鼠胚成骨细胞MC3T3-E1的增殖分化作用及细胞内OPG、RANKL mRNA的表达。方法采用MEM(10%FBS)培养液培养细胞,细胞计数法描绘成骨细胞生长曲线;MTT法检测蓇密钙片(0、50、100、500、1000μg/ml)、马鹿角多肽(0、5、50、500μg/ml)和钙尔奇D对照组对鼠胚成骨细胞MC3T3-E1增殖的作用;蓇密钙片(0、50、100、500、1000μg/ml)、马鹿角多肽(0、5、50、500μg/ml)和钙尔奇D对照组干预鼠胚成骨细胞MC3T3-E1 72 h后,比色法检测细胞内碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的含量,RT-PCR法检测骨保护蛋白(osteoprotegerin,OPG)、核因子КB激活受体配体(receptor activator of NK-КB ligand,RANKL)mRNA的表达。结果蓇密钙片及马鹿角多肽作用于MC3T3-E1成骨细胞72 h后,可促进其增殖,OD值增加(P0.05),增加ALP的含量,促进OPG mRNA表达,同时抑制RANKL mRNA表达。结论蓇密钙片及马鹿角多肽促进MC3T3-E1成骨细胞增殖分化,可能与促进成骨细胞OPG mRNA表达、抑制RANKL mRNA表达有关,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

牵拉应力对三维培养的成骨样细胞的生物学效应

目的研究三维培养的克隆的鼠颅骨成骨样细胞(colonalmurinecalvarialosteoblast-likecellline,MC3T3-E1)在特定的周期性牵拉应力刺激下的增殖能力、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)活性及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)mRNA表达的变化,探讨牵拉应力对成骨细胞的生物学效应。方法以明胶海绵(2.00cm×2.00cm×0.25cm)作为MC3T3-E1的三维培养支架,每块明胶海绵种植细胞悬液100μl,细胞数目为1.25×105个。明胶海绵拉伸度为5%,频率60cycles/min,15min/h,牵拉后2、4、6、8、10d分别从牵拉组和对照组中各取3个样本,行细胞计数、细胞及培养液的ALP活性测定、细胞的OPNmRNA测定。结果牵拉后第2d牵拉组的细胞数目即多于对照组(P<0.05),细胞倍增时间从71h提前至55h。除第2d外,牵拉组细胞的ALP活性低于对照组(P<0.05),两组培养液中ALP活性均处于低水平,差异无统计学意义。各时相牵拉组OPNmRNA的表达整体水平高于对照组,对照组第4dOPNmRNA的表达接近牵拉组,其余各时相均低于牵拉组(P<0.05)。结论周期性牵拉应力促进三维培养的MC3T3-E1细胞增殖,抑制细胞的ALP活性,促进OPN的合成,增强细胞的分化能力。     

痩素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1增殖及OPG/RANKL mRNA表达的影响

目的初步探讨瘦素对小鼠成骨细胞MC3T3-E1细胞增殖及骨保护蛋白、核因子κB激活受体配体mRNA表达的影响。方法以小鼠成骨细胞MC3T3-E1为体外实验模型,用MTT法检测瘦素作用MC3T3-E1细胞后的增殖情况,RT-PCR方法检测OPG、RANKL mRNA表达。结果瘦素（10、20、40、80和160ng.mL-1）作用于MC3T3-E1细胞24h后,可促进其增殖,OD值显著增加（P〈0.01）,增加骨保护蛋白mRNA表达,同时降低核因子κB激活受体配体mRNA表达,且呈浓度依赖性。结论瘦素促进MC3T3-E1细胞增殖,同时通过调节骨保护蛋白mRNA和核因子κB激活受体配体mRNA的表达,从而促进骨形成,抑制骨吸收。     

淫羊藿苷对钛颗粒作用下成骨细胞增殖和分化的影响

[目的]研究淫羊藿苷(icariin,ICA)对钛(titanium,TI)颗粒作用下成骨细胞增殖和分化的影响。[方法]多次酶消化法体外分离新生大鼠颅骨成骨细胞,进行原代培养。双重荧光染色激光共聚焦显微镜下观察成骨细胞吞噬钛颗粒后的组织形态学改变。CCK-8法检测0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/ml钛颗粒对成骨细胞增殖能力的影响,并筛选出半数致死浓度。在此浓度作用下分别加入10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10mol/L的淫羊藿苷进行干预,观察淫羊藿苷对钛颗粒作用下成骨细胞增殖能力的影响,找出最佳药物浓度。以最佳药物浓度干预钛颗粒作用下的成骨细胞,于第3、7、14 d ELISA法检测各组细胞碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性,观察药物对成骨细胞分化功能的影响。[结果]激光共聚焦显微镜下可见吞噬了钛颗粒的成骨细胞皱缩变形,微丝(F-actin)排列紊乱。不同浓度的钛颗粒均可抑制成骨细胞增殖,呈浓度依赖性,与对照组相比有显著差异(P<0.05),0.5mg/ml为钛颗粒的半数致死浓度。10-10-10-6mol/L的淫羊藿苷均能促进钛颗粒作用下的成骨细胞增殖(P<0.05),与钛颗粒组相比具有显著差异(P<0.05),10-9mol/L为淫羊藿苷的最佳作用浓度。在此浓度下的淫羊藿苷可以显著抑制钛颗粒引起的成骨细胞ALP活性下降(P<0.05)。[结论]淫羊藿苷可以在体外逆转钛颗粒对成骨细胞增殖和分化的抑制作用,有望成为防治人工关节无菌性松动的有效药物。     

淫羊藿甙抗大鼠雄激素部分缺乏的实验研究

目的探讨淫羊藿甙对雄激素部分缺乏大鼠的保护作用。方法以环磷酰胺造成生殖系统受损、雄激素部分缺乏大鼠模型,灌胃淫羊藿甙(1CA)和皮下注射丙酸睾酮(T)7d后,检测血清T、LH、FSH含量和血清BGP、StrACP含量；以HE染色和TUNEL检测,光镜下观察睾丸组织、阴茎海绵体平滑肌细胞变化情况。结果(1)血清T水平：T组(34.96±11.42)ng/ml和ICA组(10.94±2.04)ng/ml明显高于空白(C)组(3.0141±0.4131)ng/ml和模型(M)组(0.79 0.45)ng/ml,且T组高于ICA组,C组高于M组(P＜0.05)；(2)血清BGP水平：T组(4.50±1.70)ng/ml和ICA组(3.44±0.51)ng/ml明显高于C组(1.82±0.50)ng/ml和M组(1.22±0.50)ng/ml(P＜0.05)；(3)血清StrACP活力水平：T组(25.73±7.57)U/L和ICA组(19.99±8.63)U/L明显低于C组(51.32±14.16)U/L和M组(64.89±12.57)U/L,且C组低于M组(P＜0.05)；(4)阴茎海绵体平滑肌细胞的凋亡率：T组(22.65±5.17)%和ICA组(34.26±3.45)%明显低于M组(48.28±6.74)%,(P＜0.05)。结论淫羊藿甙具有抗雄激素部分缺乏的作用,可用于PADAM的治疗。     

PIK3R3在胆囊癌组织中的表达及临床意义

目的 检测胆囊癌患者癌组织及癌旁组织中磷脂酰肌醇3激酶调节亚基3（PIK3R3）的表达,分析其临床意义。方法 回顾性分析上海交通大学医学院附属新华医院2014年1月至2016年12月共50例胆囊癌患者的临床资料;采用门诊及电话的方式对患者进行随访,随访时间截止至2018 年12 月。利用免疫组织化学染色法检测50 例胆囊癌患者癌组织及其癌旁组织中PIK3R3蛋白的表达情况,并用统计学方法分析其与患者临床特征及预后的关系。结果 免疫组化分析表明,PIK3R3 蛋白表达主要位于胆囊癌细胞的细胞质中,胆囊癌组织中PIK3R3蛋白表达阳性率较癌旁组织中明显升高（74.0% vs 28.0%,χ2=7.923,P＜0.05）。而且PIK3R3 蛋白表达阳性率在患者的肿瘤TNM分期和分化程度上差异有统计学意义（χ2=7.033,6.821,P＜0.05）,而在性别、年龄、是否患有胆囊结石、淋巴结转移方面,则无明显统计学差异（P＞0.05）。PIK3R3蛋白高表达者相较于低表达者预后更差（中位生存时间10 个月 vs 19 个月,P＜0.05）;经Cox多因素回归分析发现,PIK3R3表达阳性可作为胆囊癌预后危险因素之一（HR 5.766,95%CI 1.843～18.033,P＜0.05）。结论 PIK3R3在胆囊癌组织中表达升高,且主要表达在细胞质中。PIK3R3表达与胆囊癌发展指标如TNM分期、肿瘤分化程度有关。在患者预后方面,PIK3R3 蛋白高表达的患者具有较差的预后。PIK3R3蛋白的表达可以作为胆囊癌患者预后的指标之一。     

3H-thymidine, 3H-uridine and 3H-leucine uptake in erythroblasts of patients with chronic renal failure

The in vitro incorporation of 3H-thymidine, 3H-uridine and 3H-leucine, reflecting the synthetic capacity for DNA, RNA and protein, respectively, was detected by radioautography in the erythroid precursors of 10 patients with chronic renal failure. The results were compared with the uptake of the isotopes in the erythroid precursors of healthy subjects. The pattern of incorporation for all three isotopes in the patients' cells was similar to that of control cells, but significantly lower. The possible causes of this difference are discussed.     

Characterization of γδ T cell subsets in organ transplantation

γδ T cells are innate‐type lymphocytes that preferentially act as regulators of local effector immune responses. Recent reports found an altered distribution of the two main subpopulations of blood γδ T cells (Vδ1 and Vδ2) in operationally tolerant liver transplant recipients. Based on this, γδ T cells subset quantification was proposed as a biomarker of immunologic risk in liver transplantation. The specific characteristics of γδ T cell subsets in transplantation remain however unknown. We have investigated here the phenotype, repertoire and functional properties of γδ T cell subsets in a large population of allograft recipients. Our results indicate that alterations in the γδ T cell compartment are not restricted to tolerant liver recipients. In fact, most immunosuppressed liver and kidney recipients also display an enlarged peripheral blood γδ T cell pool mainly resulting from an expansion of Vδ1 T cells exhibiting an oligoclonal repertoire and different phenotypic and cytokine production traits than Vδ2 T cells. We propose that persistent viral infections are likely to contribute to these alterations. Our data provide novel insight in the biology of γδ T cells and a rationale for exploring these lymphocytes in more depth into the pathogenesis of viral infections in transplantation.     

补体C3、C3c和C3d在IgA肾病肾组织中的表达

IgA肾病中补体C3激活导致肾小球损伤,但C3c和C3d对其影响还不清楚。本研究对C3、C3c和C3d分子特点进行分析,探讨它们在IgA肾病发病机制中的作用。     

BNIP3与LC3B在椎间盘退行性变过程中的作用

目的研究BCL2/腺病毒E1B19k Da相互作用蛋白3(BNIP3)基因及微管相关蛋白轻链3B(LC3B)基因在退变椎间盘中的表达情况,探讨其与椎间盘退行性变分级之间的相关性。方法收集2016年4月—2016年7月因腰椎椎间盘突出症于本院接受手术治疗的21例患者的退变腰椎椎间盘标本25个,依据Pfirrmann分级分成5组,分别采用实时荧光定量PCR技术和蛋白质印迹法检测BNIP3、LC3B的m RNA和蛋白表达量,用实时荧光定量PCR技术检测Bcl-2、Bax、Caspase-3的mRNA表达量,并分析BNIP3表达量、LC3B表达量、细胞自噬、细胞凋亡与Pfirrmann分级之间的关系。结果退变椎间盘组织中BNIP3、LC3B在mRNA和蛋白水平的表达均随椎间盘退行性变程度加重而减少。Bcl-2 m RNA的表达随椎间盘退行性变程度加重而减少,Bax与Casepase-3 mRNA的表达随椎间盘退行性变程度加重而增多。结论随着椎间盘退行性变程度的加重,BNIP3与LC3B的表达减少,组织内细胞凋亡水平升高,细胞自噬对组织的保护作用逐渐下降。提示BNIP3与LC3B在腰椎椎间盘退行性变过程中具有重要的调节作用,可能是细胞自噬和凋亡之间的桥梁蛋白。     

Expression of p63 and 14-3-3σ in normal and hyperdifferentiated mucosa of the upper aerodigestive tract

Objective: Our goal was to analyze p63 and 14-3-3σ expression in normal and hyperdifferentiated head and neck mucosa. Study Design: Compare the in vivo expression of p63 and 14-3-3σ by immunohistochemistry in normal mucosa and oral lichen planus, a benign mucosal lesion marked by hyperdifferentiation and apoptosis. Results and Conclusion: p63 is underexpressed and 14-3-3σ is overexpressed in lichen planus on immunohistochemical analysis. Significance: The findings support the hypothesis that p63 plays an antidifferentiation role, whereas 14-3-3σ plays a prodifferentiation role in the upper aerodigestive tract epithelium. Lichen planus is a valuable model for the study of p63, 14-3-3σ, and mucosal differentiation. p63 and 14-3-3σ may be molecular markers for oral lichen planus. (Otolaryngol Head Neck Surg 2002;126:598-601.)