腺病毒介导胸苷激酶基因联合α-IFN治疗肾癌的实验研究

目的:探讨腺病毒介导的单纯疱疹病毒1型胸苷激酶(TK)基因联合α-IFN对肾癌生长的抑制作用.方法:含TK基因的重组腺病毒感染人肾癌细胞株786-0,加用无环鸟苷(GCV) 或联用α-IFN,用噻唑蓝(MTT)方法观察杀伤效应.建立786-0裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射腺病毒及腹腔注射GCV (50 mg/kg),联合α-IFN时行瘤内注射,用药后观察肿瘤生长情况.结果:在对感染腺病毒的786-0细胞的体外杀伤实验中,TK GCV组的细胞存活率为(68.57±1.41)%,α-IFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%,TK GCV α-IFN组细胞存活率为(35.07±1.43)%( P=0.000),两者之间有协同效应.在786-0裸鼠移植瘤模型中,TK GCV联合α-IFN能够显著抑制肿瘤的生长.结论:腺病毒为载体的自杀基因TK加前体药GCV联合α-IFN应用对人肾癌细胞的体内、外治疗效果明显.     

KDR启动子驱动的双自杀基因抑制乳腺癌的体内实验研究

目的 探讨重组腺病毒介导的KDR启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因系统(以下简称Ad-KDRP-CD/TK)对乳腺癌及其血管生长的抑制作用. 方法扩增、纯化重组腺病毒Ad-KDRP-CD/TK,获得的病毒滴度达2.0×1011 pfu/mL.建立荷人乳腺癌的裸鼠动物模型,随机分为4组,每组5只.Ⅰ组:注射重组腺病毒Ad-KDRP-CD/TK与前药5-氟胞嘧啶(5-FC)和更昔洛韦(GCV);Ⅱ组:仅注射前药5-FC、GCV;Ⅲ组:仅注射重组腺病毒Ad-KDRP-CD/TK;Ⅳ组:空白对照,不施加任何处理.观察各治疗组的治疗效果,微血管密度计数(MVD)分析该系统对乳腺癌血管形成的影响,用RT-PCR法检测各组的肿瘤组织内CD/TK融合基因的表达.结果 Ⅰ组裸鼠移植瘤的生长明显受到抑制,Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组肿瘤迅速生长.MVD:Ⅰ组为(2.60±1.14),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组分别为(13.20±2.16)、(16.00± 1.58)、(16.80±1.92).Ⅰ组MVD显著低于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组,差异均有统计学意义(P＜0.01),Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组之间差异无统计学意义(均P＞0.05).RT-PCR检测发现转染Ad-KDRP-CD/TK的肿瘤细胞有融合基因CD/TK的表达.结论 Ad-KDRP-CD/TK联合前药5-FC及GCV在体内可明显抑制裸鼠乳腺癌血管形成和肿瘤生长.     

腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶（CD）和胸苷激酶（TK）融合双自杀基因系统对膀胱癌治疗作用并与单基因系统作比较。方法 利用含有CD-TK双自杀融合基因及绿色荧光蛋白（GFP）基因的复制缺陷腺病毒作载体,PCR检测CD、TK及E1基因。建立C57BL／6同系膀胱癌Mb49皮下移植瘤模型,观察肿瘤注射腺病毒联合丙氧鸟苷（GCV）或／和5-氟胞嘧啶（5-FC）治疗后肿瘤体积及组织学变化。结果 PCR可检测到腺病毒DNA中含CD及TK基因、无E1基因。腺病毒注射联合GCV、5-FC、GCV＋5-FC治疗后,肿瘤体积与对照组相比明显缩小（P=0.00）,腺病毒注射联合GCV＋5-FC有协同作用（P=0．04）,优于腺病毒注射联合GCV以及腺病毒注射5-FC。基因治疗后肿瘤细胞大片坏死．对照组细胞形态无变化。结论 腺病毒介导CD-TK融合双自杀基因联合GCV或／和5-FC能有效治疗膀胱癌,融合双自杀基因CD-TK／（GCV＋5-FC）系统对膀胱癌治疗有协同作用,其效果优于CD-TK／GCV或CD-TK／5-FC系统。     

腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶基因联合α-IFN治疗肾癌的实验观察

目的:探讨腺病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因联合α-IFN对肾癌的治疗作用.方法:含CD基因重组腺病毒感染人肾癌细胞株786-0,用噻唑蓝(MTr)方法观察加用5-氟胞嘧啶(5-Fc)或联用α-IFN后的杀伤效应.建立786-0裸鼠皮下移植瘤模型,瘤内注射腺病毒,腹腔注射5-Fc(500me/kg),联合应用α-IFN时行瘤内注射,观察肿瘤生长情况.结果:在对感染腺病毒的786-0细胞的体外杀伤实验中,CD 5-Fc组的细胞存活率为(67.40±1.27)%,α-IFN组的细胞存活率为(68.65±1.45)%,CD 5-Fc α-IFN组细胞存活率为(34.67±2.38)%,(P=0.000),两者之间有协同效应.在786-0裸鼠移植瘤模型中,CD 5-Fc联合α-IFN能够显著抑制肿瘤的生长.结论:腺病毒为载体的自杀基因CD加前体药5-Fc联合α-IFN可以明显增强抗肾癌效果.     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

[目的]探讨CEA启动子(CEA promoter,Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)与胸苷激酶(thymidine kinase,TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因.[方法]以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组,未转染者为对照组,5-氟胞嘧啶(5-fluorocytosine,5-Fc)组系列质量浓度:10、8、6、4、2、0μg/mL;更昔洛韦(ganciclovir,GCV)组系列质量浓度:5、4、3、2、1、0μg/mL;两药联合应用的系列质量浓度:(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg/mL.光镜观察细胞形态,噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate,GIR)及半数抑制浓度(IC50).病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养,给予5-Fc5μg/mL或/和GCV 10μg/mL,噻唑蓝法测定细胞GIR.[结果]对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低,5-Fc组IC50为2 400 μg/mL,GCV组为3 500μg/mL.实验组随5-Fc与GCV剂量增加,对细胞的杀伤作用明显增加,5-Fc组IC50为5.75μg/mL,GCV组为3.50 μg/mL,两者同时应用相当于5-Fc1.90 μg/mL GCV 0.95 μg/mL,细胞对5-Fc的敏感性提高417.4倍,对GCV的敏感性提高1 000倍.病毒杀伤Lovo细胞具有明显的"旁观者"效应,联合应药组的"旁观者"效应明显高于单独应用组.[结论]双自杀基因细胞毒效应以及"旁观者"效应均高于单一自杀基因.     

胞嘧啶脱氨酶和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因治疗肝门部胆管癌的体内外实验研究

目的:观察逆转录病毒介导的胞嘧啶脱氨酶(E.coli-cytosinedeaminase,CD)基因、单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpessimplexvirus-thymidinekinase,HSV-tk)基因转染肝门部胆管癌的作用。方法:在脂质体lipofectamine的介导下将含有双自杀基因的逆转录病毒载体PWZLneoCDglytk导入包装细胞PA317,收集其病毒上清,转染FRH细胞,用RT-PCR检测双自杀基因的表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-flourocytosine,5-Fc)和(或)无环鸟苷(ganciciovir,GCV)后,用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)法测定转基因组及未转基因组FRH细胞存活率。在0.8cm裸鼠肝门部胆管癌模型转染入双自杀基因后,给予5-Fc500mg/kg体重,GCV100mg/kg体重,1次/d,共10d,观察肿瘤生长情况。结果:双自杀基因在FRH细胞中可稳定表达,联合使用5-Fc和GCV对靶细胞增殖的杀伤作用及旁杀伤效应高于单独使用5-Fc或GCV。在裸鼠实验性肝门部胆管癌,实验组肿瘤的生长明显受到抑制(P<0.05);双自杀基因与单自杀基因的作用有显著差异(P<0.05)。结论:逆转录病毒介导自杀基因可有效地杀死肝门部胆管癌细胞,明显抑制裸鼠肝门部胆管癌生长,双自杀基因共表达较单一自杀基因有更强的抗肿瘤作用。     

融合自杀基因抑骨肉瘤生长的实验研究

目的观察单纯疱疹病毒-胸苷激酶／胞嘧啶脱氨酶融合自杀基因（HSV-TK／CD）对骨肉瘤细胞增殖的影响和对裸鼠骨肉瘤生长的影响。方法将含TK／CD的重组腺病毒载体感染人骨肉瘤细胞系MC-63细胞,测定感染效率后分别给予不同浓度的前体药物和不同感染复数的自杀基因重组腺病毒作用于瘤细胞,测定细胞A值计算瘤细胞增殖抑制率,MTT法测定细胞存活率,并用流式细胞术和Hochest 33342染色法分析其杀伤机制;人骨肉瘤细胞系MG-63细胞于裸鼠成瘤后将其分为6组（每组8只）：PBS对照组（A组）;重组腺病毒（Ad）-Lac-Z／GCV＋5-FC组（B组）;Ad-TK／GCV组（C组）;Ad-CD／5-FC组（D组）;Ad-TK／GCV＋Ad-CD／5-FC组（E组）;Ad-TK-CD／GCV＋5-FC组（F组）。各组经治疗后观察肿瘤的生长状况及组织病理学改变。结果含自杀基因的重组腺病毒成功感染MG-63细胞;不同感染复数和不同前体药物浓度下,融合自杀基因系统对瘤细胞的杀伤作用明显强于单基因作用和双基因相加的作用,且有显著性差异（P〈0．05）;杀伤机制为致细胞坏死和细胞凋亡。裸鼠实验中,B组与A组比较,肿瘤体积与肿瘤坏死程度无明显差异（P〉0．05）;与A、B组相比较,C～F组肿瘤的生长均受到明显抑制（P〈0．05）,且E、F组与C、D比较有显著性差异（P〈0．05）。结论融合自杀基因HSV-TK／CD对骨肉瘤细胞系MG-63细胞和裸鼠骨肉瘤的生长均有明显的抑制作用。     

放射诱导经Egr-1启动子调控的腺病毒介导CDglyTK基因的肿瘤靶向表达

目的：构建由Egr-1基因启动子驱动CDglyTK基因表达的腺病毒载体,通过放射诱导调控CDglyTK基因的肿瘤靶向表达,用于肝癌的基因－放射治疗,方法：利用细菌内高效同源重组法,制备腺病毒载体AdEger-CD/TK.MM45T.Li肝癌细胞感染AdEger-CD/TK后,体外观察γ射线照射诱导CDglyTK基因表达及在前药5－FC、GCV存在的条件下钉对存活率的变化。利用荷瘤小鼠肝癌模型观察不同处理的抑瘤效应。结果：体外实验结果显示,γ射线照射可诱导CDglyTK基因在MM45T.Li肿瘤细胞内的表达,并呈剂量依赖性;显著增强细胞对前药5－FC、GCV的敏感性（P＜0．01）;当5－FC和GCV同时存在时具有明显的协同效应。体内抗肿瘤实验结果提示,与单纯肿瘤局部照射（TLI）、瘤内注射AdEger-CD/TK＋腹腔注射5－FC＋GCVD土产且相比,瘤内注射AdEger-CD/TK＋腹腔注射5－FC＋GCV合并TLI组的抗瘤效果最好（P＜0．01）,并可使30％的肿瘤完全消退,且未见全身毒性反应的增加,结论：利用放射调控CDglyTK基因的肿瘤靶向表达,是一种安全、有效的肿瘤基因治疗新策略。     

重组Ad⁃CRM8⁃survivin⁃EHV4 TK腺病毒的构建及对肝癌移植瘤的抑制作用

目的：构建含有肝癌特异性的HS?CRM8增强子、survivin启动子及EHV4 TK自杀基因的腺病毒,探讨该重组病毒对裸鼠肝癌移植瘤的抑制作用。方法：构建重组Ad?CRM8?survivin?EHV4 TK腺病毒,获取重组腺病毒。构建裸鼠肝癌皮下移植瘤模型,给予重组腺病毒结合更昔洛韦（GCV）治疗,2周后观察肿瘤大小。对肿瘤组织切片使用HE染色,观察瘤内细胞坏死情况。结果：裸鼠肝癌移植瘤经腺病毒治疗后,EHV4 TK和GCV+EHV4 TK组肿瘤体积分别为（108.5 ± 18.3）mm3和（37.6 ± 8.7）mm3。GCV+EHV4 TK组与EHV4 TK相比,裸鼠的肿瘤重量减少,生存率提高。HE染色结果显示,GCV+EHV4 TK组肿瘤内出现大量细胞的坏死,而EHV4 TK组肿瘤内仅有少量细胞的坏死。结论：重组肝脏特异性腺病毒Ad?CRM8?survivin?EHV4 TK结合GCV能够有效地在体内促进肝癌细胞的坏死从而抑制裸鼠移植瘤的生长,对肝癌的治疗有良好的效果。     

CEA启动子启动双自杀基因与单自杀基因对Lovo细胞杀伤作用的比较

【目的】探讨CEA启动子(CEA promoter，Cp)启动的双自杀基因胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase，CD)与胸苷激酶(thymidine kinase，TK)组织特异性对Lovo结肠癌细胞杀伤作用是否优于单一自杀基因。【方法】以带有Cp、CD与TK的重组腺病毒转染的Lovo细胞作为实验组，未转染者为对照组，5-氟胞嘧啶(5-fluomcytosine，5-Fc)组系列质量浓度：10、8、6、4、2、0μg／mL；更昔洛韦(ganciclovir，GCV)组系列质量浓度：5、4、3、2、1、0μg／mL；两药联合应用的系列质量浓度：(10 5)、(8 4)、(6 3)、(4 2)、(2 1)、0μg／mL。光镜观察细胞形态，噻唑蓝法测定细胞生长抑制率(growth inhibition rate，GIR)及半数抑制浓度(IC50）。病毒转染的Lovo细胞与未转染的Lovo细胞按不同比例混合培养，给予5-Fc 5μg／mL或，和GCV10μg／mL，噻唑蓝法测定细胞GIR。【结果】对照组5-Fc与GCV对细胞的生长抑制作用极低，5-Fc组IC50为2400μg／mL，GCV组为3500μg/mL。实验组随5-Fc与GCV剂量增加，对细胞的杀伤作用明显增加，5-Fc组IC50为5．75μg／mL，GCV组为3．50μg／mL两者同时应用相当于5-Fc 1．90μg/mL GGV0．95μg／mL，细胞对5-Fc的敏感性提高417．4倍，对GCV的敏感性提高1000倍。病毒杀伤Lovo细胞具有明显的“旁观者”效应，联合应药组的“旁观者”效应明显高于单独应用组。【结论】双自杀基因细胞毒效应以及“旁观者”效应均高于单一自杀基因。     

融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌的体外实验研究

目的 研究融合自杀基因CDglyTK治疗喉癌。方法 PCR扩增、酶切、连接、转化等构建质粒表达栽体pcDNA3．1（-）CMVCDglyTK，XhoⅠ／HindⅢ酶切鉴定，测序分析CDglyTK基因序列。建立稳定表达CDglyTK基因的Hep-2细胞株，RT—PcR及Western-blotting鉴定CDglyTK基因的表达。MTT法观察5-FC、GCV、5-FC＋GCV对表达CDglyTK基因的Hep-2细胞生长的抑制作用。结果 酶切和基因测序分析证明重组质粒含完整的CD及TK基因，RT—PCR从转染细胞总RNA中扩出707bp的预期片段。West—era-blotting检测到该基因表达的59kDa的蛋白。表达CDglyTK基因的Hep-2细胞在5一FC、GCV、5-FC＋GCV干预下生长受到抑制，5-FC与GCV联合有更强的杀伤效应。结论 CDglyTK融合自杀基因可以成为基因治疗喉癌的有效方法。     

Suicide effect on rat gliomas mediated by recombinant adenovirus thymidine kinase/acyclovir system

OBJECTIVE: To establish the replicated-deficient recombinant adenovirus-mediated thymidine kinase/acyclovir (Adtk/ACV) system and to evaluate its suicide effect on rat C6 brain gliomas in vitro and in vivo. METHODS: The plasmid pAdtk and pJM17 were co-infected into 293 cells (adenovector packaging cells) and the results were identified by polymerase chain reaction (PCR) assay. After the glioma C6 cells were transduced by Adtk at different multiplicity of infection (MOI) and exposed to different concentrations of ACV or gancyclovir (GCV), the cell survival curves were studied, and the cell surface was observed with scanning electronic microscopy (SEM). C6 gliomas in vivo at different inoculation days were injected with Adtk intratumorally and ACV intraperitoneally daily, and the survival duration and histologic changes of the rats were observed. RESULTS: The infectious Adtk virions had a suicide effect which was enhanced with the increase in MOIs of Adtk and ACV doses along with bystander effect. Under scanning electronic microscope, special pathologic changes were observed. ACV had a similar effect as GCV but a higher dose was used. The survival duration in day 3, day 6 and day 8 groups exceeded 90 days, and the rats in day 10 group survived 28.5 +/- 4.6 days, but the survival duration in untreated C6 group and AdLacZ/ACV (adenovirus-mediated LacZ/ACV) treated group were 16.8 +/- 3.1 and 14.0 +/- 2.2 days respectively. CONCLUSION: Adtk/ACV system can effectively kill the rat brain gliomas in vitro and in vivo.     

自杀基因CD、TK的共表达对人肺腺细胞的杀伤作用

目的 观察双自杀基因的共表达与单自杀基因单独表达对癌细胞的杀伤作用。方法 分别构建了以CMV为启动子,含单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV－TK）和／或大肠杆菌嘧啶脱氨酶（Ecoli.CD)单、双自杀基因的真核表达载体。在脂质体介导下将基因导入细胞,经G418筛选出稳定表达的克隆。用PCR、半定量RT－PCR检测各组基因的整合及表达。给予前本药物5－氟胞嘧啶（5－flurocytosine,5-Fc)和／或无环岛苷（Ganciclovir,GCV)后,用MTT法测定各围基因组细胞的存活率。结果 单、双自杀基因均在GLC－82细胞中稳定表达,双基因转染组对细胞增殖的杀伤及旁杀伤效应高于单基因组。结论 TK＋CD／5－Fc GCV的双基因共表达体系较CD／6－Fc或TK／GCV单 基因体系对细胞具有更强的杀伤作用。     

单链抗体导向的慢病毒介导VP22-TK系统对MUC1+人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的作用

目的探讨抗MUC1单链抗体(scFv)导向的慢病毒介导的单纯疱疹病毒结构蛋白VP22和胸苷激酶(TK)融合基因及丙氧鸟苷(GCV)自杀基因系统对MUC1+人卵巢上皮癌的特异靶向性生长抑制作用.方法将慢病毒包装质粒、包膜质粒、转移载体质粒采用磷酸钙沉淀法共转染包装细胞293T,收集病毒上清,并建立MUC1+人卵巢上皮癌(3AO)细胞株腹腔移植瘤模型.单药组分为scFv-VP22-TK+生理盐水(NS)组、VP22-TK+NS组、NS+NS组,分别用慢病毒scFv-VP22-TK、VP22-TK或NS 1 ml腹腔注射,继予NS腹腔注射;联合用药组分为scFv-VP22-TK+GCV组、VP22-TK+GCV组、NS+GCV组分别应用慢病毒scFv-VP22-TK、VP22-TK及NS腹腔注射,24 h后给予GCV腹腔注射治疗.每组裸小鼠均为5只.观察各组裸鼠的生存时间及慢病毒的毒性作用.结果平均生存时间scFv-VP22-TK+NS组、VP22-TK+NS组、NS+NS组、NS+GCV组、VP22-TK+GCV组、scFv-VP22-TK+GCV组分别为18.4 d±2.9 d、18.8 d±1.5 d,17.6 d±1.1 d,18.5 d±1.6 d,24 d±5 d和46 d±22 d, 6组比较,差异有显著意义(χ2=24.82,P=0.002);并且scFv-VP22-TK+GCV组较VP22-TK+GCV组裸鼠平均生存时间明显延长(χ2=7.43,P=0.006).结论抗MUC1 scFv靶向的慢病毒介导的VP22-TK/GCV系统对MUC1+人卵巢上皮癌具有高效靶向杀伤作用.     

腺病毒介导的双自杀基因系统对乳腺癌细胞的杀伤作用

目的 探讨腺病毒介导胞嘧啶脱氨酶(CD)和胸苷激酶(TK)融合双自杀基因系统对乳腺癌治疗作用.方法 用重组VEGFP-CD/TK-GFP基因的腺病毒体外感染表达VEGF的乳腺癌MCF-7细胞和对照组不表达VEGF的乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察其感染效率,以RT-PCR检测受感染细胞CD/TK的表达,然后给子前药环氧鸟苷(GCV)和/或5-氟胞嘧啶(5-FC),用MTT法观察该体系对细胞生长增殖的影响;用流式细胞术观察细胞周期变化.建立MCF-7裸鼠皮下移植瘤模型,采用瘤内注射腺病毒载体联合腹腔内注射前药GCV和/或5-FC治疗后,观察肿瘤生长情况.结果 腺病毒对两种细胞的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增.RT-PCR检测发现转染Ad-VEGFP-CD/TK的MCF-7细胞有目的 基凶的表达,而乳腺上皮细胞无表达.MTT法检测显示表达VEGF的MCF-7细胞对前药具有较高的敏感性,而不表达VEGF的乳腺上皮细胞对前药不敏感,CD/TK融合基因对MCF-7的疗效优丁任一单自杀基因(P＜0.01).在感染复数为100时,用流式细胞仪分析细胞周期显示治疗组细胞G0-G1期比率增多,S期细胞减少.在MCF-7裸鼠移植瘤模型中.该双自杀基因系统能够显著抑制肿瘤的牛长.其疗效优于任一单自杀基因(P<0.01).结论 腺病毒介导VEGF启动子驱动的CD/TK融合双自杀基因联合GCV和5-FC能有效治疗乳腺癌,其效果优于单自杀基因系统.     

Killing effect of coexpressing cytosine deaminase and thymidine kinase on rat vascular smooth muscle cells

Background Vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation following arterial injury plays a critical role in a variety of vascular proliferative disorders, such as atherosclerosis and restenosis after balloon angioplasty. Herpes simplex virus-thymidine kinase (HSV-TK)/ganciclovir (GCV) and E.coli cytosine deaminase (CD)/5-fluorocytosine (5-Fc) suicide gene systems have been successfully employed in cardiovascular gene therapy, respectively. We reasoned that coexpression of both HSV-TK with CD suicide genes would lead to increased cell killing. To test this imagine, the adenoviral vectors expressing TK and/or CD genes were developed and tested on vascular smooth muscle cells. Methods Adenoviral vectors, including Ad-EF1α-CD-cytomegolovirus (CMV)-TK coexpressing both CD and TK double suicide genes, Ad-EF1α-CD and Ad-CMV-TK expressing CD and TK respectively, and control vector Ad-CMV-LacZ, were constructed and prepared with homologous recombination in RecA+E.coli cells. Integration and expression of CD and/or TK gene were identified by PCR and Western blot. Primary cultured VSMCs were infected at a multiplicity of infection (MOI) of 20 with exposure to their matching prodrugs 5-Fc and GCV. Cell mortality was measured by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) assays. Flow cytometry analysis was used to detect cell death. Apoptotic cells were analyzed using Hoechst 33342 fluorescence dye as a DNA probe. Genomic DNA cleavage of apoptotic VSMCs was tested by agarose gel electrophoresis. Results Recombinant adenovirus expressing CD and/or TK suicide genes were successfully constructed. Both single and double suicide genes could be integrated into adenoviral genome and expressed. Cytotoxic effects of Ad-EF1α-CD-CMV-TK double suicide genes combined with 5-Fc and GCV were higher than those of Ad-CMV-TK and Ad-EF1α-CD single gene groups. The rate of cell survival was only (9±3)% in the Ad-EF1α-CD-CMV-TK group, but (37±3)% in the Ad-CMV-TK and (46±4)% in the Ad-EF1α-CD groups (P&lt;0.05). Flow cytometry analysis indicated that the killing mechanisms of the groups were different. Necrosis and apoptosis were involved in the mechanism of the double gene group. Based on the DNA stainability with Hoechst 33342, the apoptotic rates of VSMCs in the Ad-EF1α-CD-CMV-TK ［(11.0±2.1)%］ and Ad-CMV-TK ［(12.0±2.2)%］ groups were higher than those in Ad-CMV-LacZ ［(1.2±0.11)%］ and Ad-EF1α-CD ［(5.0±1.8)%］ groups (P&lt;0.05, respctively). DNA smear could be observed in both Ad-CMV-TK and Ad-EF1α-CD-CMV-TK groups after administration of prodrugs. Conclusions The killing effect on rat VSMCs mediated by adenoviral CD/TK double suicide genes is superior to that of single suicide gene. The killing mechanism of recombinant adenovirus coexpressing CD/TK double suicide genes is mainly through cytotoxic effect and apoptosis.     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD／TK融合基因（AdKDR—CDglyTK）对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞，用腺病毒重组体AdEasy-KDR—CDglyTK和AdEasy—CMV—CDglyTK感染之，观察其感染效率并以RT—PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达．然后给予不同浓度的前药5一FC及GCV处理，观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果两种重组体对各细胞株的感染率相似，其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT—PCR检测发现：除感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞外．感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株，其表现出对前药不同的敏感性：感染AdCMV—CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR—CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性．且其敏感性差异无显著性意义（P〉0．1）；相比之下，感染AdKDR—CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感（P〈0．001）。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效（P〈0．001）。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养，观察到该体系明显的旁观者效应。结论KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

双自杀基因重组腺病毒对胃癌细胞及血管内皮细胞的体外特异性杀伤作用

目的 研究腺病毒介导的KDR启动子驱动CD/TK融合基因(AdKDR-CDglyTK)对胃癌细胞及血管内皮细胞的选择性杀伤作用。方法 选择表达KDR的MGC803细胞、ECV304细胞和不表达KDR的LS174T细胞,用腺病毒重组体AdEasy-KDR-CDglyTK和AdEasy-CMV-CDglyTK感染之,观察其感染效率并以RT-PCR方法检测转基因细胞CDglyTK的表达,然后给予不同浓度的前药5-FC及GCV处理,观察该体系对不同细胞株的杀伤效应。结果 两种重组体对各细胞株的感染率相似,其感染率随腺病毒滴度的增高而递增。RT-PCR检测发现:除感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞外,感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞及感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞均有目的基因CDglyTK的表达。以感染复数为100的两种腺病毒分别感染各细胞株,其表现出对前药不同的敏感性:感染AdCMV-CDglyTK的所有细胞株和感染AdKDR-CDglyTK的MGC803细胞、ECV304细胞对前药具有较高的敏感性,且其敏感性差异无显著性意义(P>0.1);相比之下,感染AdKDR-CDglyTK的LS174T细胞对前药不敏感(P<0.001)。双自杀基因的疗效优于任一单自杀基因的疗效(P<0.001)。将感染腺病毒的细胞与未感染细胞以不同比例混合培养,观察到该体系明显的旁观者效应。结论 KDR基因启动子可调控双自杀基因系统选择性杀伤表达KDR胃癌细胞及血管内皮细胞。     

鞘内注射依那西普对完全弗氏佐剂致痛大鼠痛阈的影响

目的探讨鞘内注射依那西普（etanercept）对完全弗氏佐剂（complete Freund’s adjuvant,CFA）所致大鼠炎性疼痛的影响,进一步探讨TNF-α在炎性痛中的作用。方法SD大鼠48只,随机分为8组（n=6）。A组为腹腔注射生理盐水（NS）;B组为腹腔注射依那西普;C组为腹腔注射NS,足底注射CFA;D组为腹腔注射依那西普,足底注射CFA;E组为鞘内注射NS;F组为鞘内注射依那西普;G组为鞘内注射NS,足底注射CFA;H组为鞘内注射依那西普,足底注射CFA。测量各时间点大鼠左足50％缩足阈值。结果腹腔注射和鞘内注射etanercept均升高CFA致痛大鼠的痛闽（P〈0．05）,两者间无统计学差异（P〉0．05）。结论鞘内注射依那西普升高CFA致痛大鼠的痛阈,提示TNF—α在CFA所致炎性疼痛的外周致敏和中枢致敏中均起作用。