VEGF-C基因靶向RNA干扰重组表达载体的构建和表达

目的:利用质粒pSilencer3.1-H_1构建针对人血管内皮生长因子-C(VEGF-c)基因的表达载体,测序鉴定并观察在胃癌细胞中的表达.方法:根据质粒pSilencer3.1-H_1要求设计两对小干扰RNA靶序列,退火形成互补的双链,通过与线性化的pSilencer3.0-H_1相应位点连接、转化大肠杆菌,扩增、纯化得到所需质粒,酶切电泳及测序鉴定后转染胃癌细胞株SGC-7901,Western blot检测转染前后VEGF-C基因的蛋白表达.结果:经酶切和测序鉴定,针对VEGF-C基因的siRNA表达载体构建成功.转染胃癌细胞株SGC-7901后,Western blot检测显示VEGF-C基因蛋白表达明显降低,pSilencer3.1-VEGF-C1组抑制效果明显,其抑制率为81.2%,与阴性对照组相比差异具有显著性(P<0.05).结论:成功构建了针对人VEGF-C基因的siRNA表达载体和稳定转染的胃癌细胞株SGC-7901.     

RNA干扰对喉鳞癌Hep-2细胞增殖及VEGF-C mRNA表达的影响

目的观察载体介导的RNA干扰（RNAi）技术对人喉鳞癌Hep-2细胞增殖及其血管内皮生长因子C（VEGF-C）mRNA表达的影响。方法选择针对人特异性VEGF-C的小RNAi（siRNA）靶序列mRNA,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的寡核苷酸（同时随机组合出一条对照序列）,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSuper-neo载体中构建重组体。脂质体法转染重组体至喉鳞癌Hep-2细胞,经G418筛选获得阳性克隆。用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测其VEGF-C mRNA。结果转染VEGF-C靶向siRNA载体的Hep-2细胞生长减慢,S期细胞显著减少,VEGF-C表达水平明显下降。结论VEGF-C靶向RNAi重组体可显著抑制Hep-2细胞增殖及其VEGF-C mRNA的表达。     

siRNA抑制人舌癌细胞VEGF表达对MMP-9蛋白表达的影响

目的 利用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)抑制人舌癌Tca8113细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达,观察其对培养细胞和移植瘤基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)蛋白表达的影响.方法 以稳定转染携带VEGF-siRNA真核表达载体的人舌癌Tca8113细胞(VEGF-siRNA1、VEGF-siRNA2)为实验组,以转染空载体人舌癌Tca8113细胞及未转染的人舌癌Tca8113细胞为实验对照组和空白对照组,将各组细胞分别接种于裸鼠皮下,用免疫细胞/组织化学法分别测定各组培养细胞和移植瘤VEGF及MMP-9的蛋白表达.结果 在培养细胞和移植瘤中,与实验对照组和空白对照组相比,VEGF-siRNA1组和VEGF-siRNA2组VEGF染色平均灰度值高,差异有统计学意义(P＜0.05);各组培养细胞中均未见MMP-9表达;各组移植瘤MMP-9染色平均灰度值之间的差异无统计学意义(P＞0.05). 结论 以siRNA干扰沉默人舌癌Tca8113细胞VEGF基因,可明显抑制细胞及移植瘤内VEGF蛋白表达,但是对MMP-9蛋白的表达无明显影响.     

食管癌组织中VEGF-C、D和KDR、Flt-4 mRNA的表达及其与淋巴结转移的关系

目的 探讨VEGF-C、D及其受体KDR、Fit-4 mRNA在食管癌组织中的表达及其与淋巴结转移的关系.方法采用半定量RT-PCR方法检测53例食管癌组织、14例正常食管黏膜组织中VEGF-C、D及KDR、Fit-4mRNA的表达情况,并分析其与淋巴结转移之间的关系.结果 53例食管癌组织中,VEGF-C的表达率为81.1%,VEGF-D为77.4%,KDR为66.0%,Fit-4为60.2%.有淋巴结转移者VEGF-C、D、KDR mRNA和Flt-4mRNA的阳性表达率明显高于无淋巴结转移者(P<0.01,P<0.05).结论食管癌组织中VEGF-C、D和KDR、Flt-4mRNA的表达与食管癌的淋巴结转移显著相关,是促进食管癌经淋巴结转移的重要因素.     

CD147基因沉默对甲状腺乳头状癌细胞中VEGF-C表达的影响

目的观察CD147基因沉默对甲状腺乳头状癌细胞株K1中血管内皮生长因子C（VEGF-C）表达的影响,筛选有效的小干扰RNA（siRNA）序列。方法设计合成3对不同的CD147 siRNA,分别转染人K1为实验组（S1、S2、S3组）,同时设不加干预者为正常组,siRNA阴性对照进行干预为阴性对照组。RT-PCR、ELISA法分别测定各组CD147 mRNA及其蛋白。筛选能有效沉默CD147 mRNA及其蛋白的siRNA序列。RT-PCR、Western blot法分别测定CD147表达沉默后K1细胞中的VEGF-C mRNA及其蛋白。结果 S1组CD147 mRNA及其蛋白表达量与正常组、阴性对照组相比,P均〉0.05。S2、S3组与正常组、阴性对照组相比,P均〈0.05。S2、S3组的siRNA序列可有效沉默CD147的表达而S1组不能。S2、S3组CD147 mRNA的表达抑制率分别为67.8%和72.5%;CD147蛋白表达抑制率为31.7%和35.4%。S2、S3组K1细胞中VEGF-C mRNA表达抑制率分别为66.4%和56.6%;其蛋白表达抑制率分别为51.9%和41.6%。结论筛选出了能有效沉默CD147基因表达的siRNA序列。CD147基因沉默后可降低K1细胞中VEGF-C的表达,可能影响肿瘤细胞的淋巴结转移能力。     

靶向Midkine基因的siRNA真核表达载体的构建及鉴定

目的 构建靶向midkine基因的siRNA 的表达载体,为研究midkine在肿瘤中作用提供一个新的方向.方法 根据基因库中midkine cDNA 序列设计和合成针对人midkine 基因的siRNA 寡核苷酸,定向克隆入质粒载体PGCsiU6,对该重组表达载体进行酶切鉴定及DNA 测序.结果 酶切鉴定、DNA 测序证实表达质粒构建成功,无碱基突变.结论 成功构建了靶向midkine 基因表达的siRNA 干扰质粒载体PGCsiU6/midkine,为进一步运用RNA干扰技术进行midkine 基因功能研究奠定了基础.     

靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体构建及体外抑制作用

目的: 构建靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体并在体外检测其对VEGF基因表达的抑制作用.方法: 设计合成靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA cDNA序列并与pSUPER载体连接, 构建VEGF siRNA表达载体, 经酶切鉴定和测序确认后, 脂质体2000介导VEGF siRNA转染HepG2细胞. RT-PCR及Western blot检测VEGFsiRNA表达载体转染的HepG2细胞中VEGF基因表达.结果: 通过双酶切鉴定和测序分析, 成功构建了靶向HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体. RT-PCR和Western blot法检测转染VEGFsiRNA表达载体的HepG2细胞VEGF mRNA及VEGF165表达下调, 其抑制率分别为65%和74%. 实验组中的HepG2中VEGF mRNA表达较阴性对照组、空载体组表达量显著下降(0.304±0.062 vs 0.896±0.061, 0.884±0.074,P<0.05).结论: 成功构建了靶向肝癌HepG2细胞VEGF基因的siRNA表达载体, 且该载体在体外能有效抑制HepG2细胞VEGF基因表达.     

VEGF-C、D及VEGFR-3在食管癌中的表达及临床价值

采用免疫组化SP法检测57例食管癌组织及癌旁正常组织中血管内皮生长因子(VEGF)-C、D及其受体(VEGFR-3)的表达,分析VEGF-C、D及VEGFR-3的相关性及其与食管癌临床病理的关系.结果:VEGF-C、D及VEGFR-3在食管癌组织中的表达较癌旁组织明显增高,VEGFR-3 的表达与VEGF-C、D的表达呈正相关,食管癌组织中VEGF-C、D及VEGFR-3的表达与其淋巴结转移和远处转移显著相关.认为VEGF-C、D可能通过与VEGFR-3的结合诱导食管癌组织中的淋巴管生成,促进了肿瘤细胞的淋巴转移.     

白藜芦醇对人食管癌细胞Eca-109增殖的影响及其机制探讨

目的观察白藜芦醇（Res）对人食管癌细胞Eca-109增殖的影响,并探讨其机制。方法将Eca-109细胞分别与0、10、20、40μmol/L的Res共同培养,采用MTT法测定Res对Eca-109细胞的生长抑制率,采用RT-PCR法检测Eca-109中的VEGF mRNA。结果随着Res浓度增加、作用时间延长,Eca-109细胞生长抑制率增加（P均〈0.05）,VEGF mRNA表达量降低（P均〈0.05）。结论Res可抑制Eca-109细胞增殖,其作用可能与抑制VEGF表达有关。     

cripto-1基因siRNA对乳腺癌细胞侵袭力的影响

目的观察cripto-1基因小于扰RNA（siRNA）对乳腺癌细胞侵袭力的影响。方法将人乳腺癌MDA—MIM68细胞分为4组,A组不处理,B组转染空载脂质体,C组转染错配siRNA,D组转染分别转染含3．125、6．25、12．5nmol／Lcfipto-1基因siRNA的脂质体。分别于处理24．48、72h收集各组细胞。采用实时定量RT—PCR法和Western blot法检测MDA—MB468的cripto-1 mRNA和蛋白,采用软琼脂集落培养试验和Boyden小室检测MDA—MB468的锚着不依赖性增殖和侵袭能力。结果与A、B、C组比较,D组MDA—MB468的cripto-1 mRNA、cripto-1蛋白、集落形成数量、穿膜细胞数均呈浓度依赖性减少（P均〈0．005）。结论cripto-1基因siRNA可抑制乳腺癌细胞侵袭。     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的 探讨表达载体介导小干扰RNA(siRNA)对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3(STAT3)表达的抑制作用.方法 设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列,将其连入pRNAT-U6.1/Neo质粒中,构建STAT3 siRNA表达载体.表达载体进行PCR及测序鉴定,并分别转染SW1990细胞,实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变.结果 PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功,分别转染SW1990细胞后,STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降(P＜0.05),其中,第二种STAT3 siRNA作用明显,可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63%和60%.结论 本研究构建的STAT3 siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达,为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础.     

伊班膦酸钠对食管鳞癌EC9706细胞增殖及VEGF表达的作用

目的了解双膦酸盐(BPs)对人食管癌EC9706细胞株增殖的影响,探讨伊班膦酸钠对VEGF表达的作用。方法倒置显微镜观察细胞形态变化,进行细胞形态学观察;采用MTT法检测伊班膦酸钠对EC9706细胞增殖的抑制作用;采用免疫细胞化学检测伊班膦酸钠对EC9706细胞VEGF表达的影响。结果随着伊班膦酸钠药物浓度的增加和作用时间的延长,实验组细胞密度下降,细胞碎片增多,核染色质和胞浆皱缩,胞膜和核膜增厚,折光性差,细胞贴壁能力下降。实验组不同浓度的伊班膦酸钠对食管癌EC9706细胞均有抑制作用,且与药物浓度和作用时间呈正相关,与对照组相比,差异均有统计学意义(P0.05)。对照组及10、20、40μg/ml浓度VEGF蛋白的表达率分别为43.81±3.61、30.92±3.30、21.57±3.17、9.05±1.38,各实验组与对照组比较、各实验组组间比较,差异均有统计学意义(P0.05)。结论伊班膦酸钠对食管癌EC9706细胞有增殖抑制作用,并且具有时间及剂量依赖性。伊班膦酸钠可以从蛋白水平抑制食管癌EC9706细胞VEGF的表达。     

应用表达载体介导siRNA抑制胰腺癌STAT3基因表达的研究

目的探讨表达载体介导小干扰RNA（siRNA）对人胰腺癌细胞系SW1990转录激活因子-3（STAT3）表达的抑制作用。方法设计合成3种可编码后形成小发夹结构针对STAT3基因的siRNA的DNA序列，将其连入pRNAT—U6．1／Neo质粒中，构建STAT3siRNA表达载体。表达载体进行PCR及测序鉴定，并分别转染SW1990细胞，实时定量PCR和Western blot观察SW1990细胞转染后STAT3 mRNA和蛋白表达的改变。结果PCR和DNA测序证实携带3种STAT3 siRNA表达载体构建成功，分别转染SW1990细胞后，STAT3基因的mRNA和蛋白表达量与空质粒转染相比均明显下降（P〈0．05），其中，第二种STAT3 siRNA作用明显，可使mRNA和蛋白表达水平分别下降63％和60％。结论本研究构建的STAT3．siRNA表达载体可有效抑制SW1990细胞STAT3的mRNA和蛋白表达，为下一步以STAT3为靶点的胰腺癌基因治疗实验研究奠定了基础．     

人参皂甙对食管癌细胞VEGF表达的影响

目的 探讨人参皂甙(Rg3)抑制人食管癌鳞癌细胞血管生成的机制.方法 将75 μmol/L的二氧化钴单独或联合30、60 μg/ml的Rg3作用于食管癌EC9706细胞24 h和48 h,分别收取细胞培养上清液,用 ELISA法检测其中血管内皮生长因子(VEGF)水平,以含10%胎牛血清RPMI1640培养基做空白对照.结果 与空白组对比,二氯化钴作用24、48 h后,VEGF表达明显升高;二氯化钴与Rg3联合作用后VEGF表达明显下降,并与Rg3的剂量和作用时间密切相关.结论 Rg3可抑制二氯化钴诱导的EC9706细胞血管生成;其可能机制是抑制VEGF表达.     

Construction of pETNF-P16 plasmid and its expression properties in EC9706 cell line induced by X-ray irradiation

AIM: Recombined plasmid pETNF-P16 was constructed to investigate its expression properties in esophageal squamous carcinoma cell line EC9706 induced by X-ray irradiation and the feasibility of gene-radiotherapy for esophageal carcinoma. METHODS: Recombined plasmid pETNF-P16 was constructed and transfected into EC9706 cells with lipofectamine. ELISA,Western blot, and immunocytochemistry were performedto determine the expression properties of pETNF-P16 in EC9706 after transfection induced by X-ray irradiation. RESULTS: Eukaryotic expression vector pETNF-P16 was successfully constructed and transfected into EC9706 cells. TNFα expressions were significantly increased in the transfected cells after different doses of X-ray irradiation than in those after 0Gy irradiation (1 192.330-2 026.518 pg/mL,P&lt;0.05-0.01), and the TNFα expressions and P16 were significantly higher 6-48 h after 2 Gy X-ray irradiation (358.963-585.571 pg/mL, P&lt;0.05-0.001). No P16 expression was detected in normal EC9706 cells. However, there was strong expression in the transfected and irradiation groups. CONCLUSION: X-ray irradiation induction could significantly enhance TNFα and P16 expression in EC9706 cells transfected with pETNF-P16 plasmid. These results may provide important experimental data and therapeutic potential for gene-radiotherapy of esophageal carcinoma.     

PAI siRNA表达载体的构建及鉴定

目的 构建和鉴定针对PAI 的发卡样小干扰RNA（siRNA）真核表达载体PAI siRNA.方法 人工合成一对互补并编码相应短发夹状PAI siRNA 的寡核苷酸链, 将其插入到pSilencerTM 2.1-U6 neo 载体中,经测序鉴定所构建的重组载体是否正确;采用电转染法将构建的重组载体导入人肝癌细胞HpG2中, 采用逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 、West ern印迹法分别检测转染细胞PAI mRNA 和蛋白的表达.结果 经测序证明PAI siRNA 序列正确;转染PAI siRNA 载体后,HpG2细胞PAI mRNA 和蛋白表达均较对照组明显下降（P ＜0.01）.结论 测序结果表明发卡样PAI siRNA 真核表达载体构建成功,转染Hp G2细胞后获得稳定表达,并可特异性封闭PAI的表达, 为进一步研究PAI siRNA 载体提供了实验基础.     

FasL基因siRNA真核表达载体的构建及意义

目的构建针对细胞凋亡基因FasL的小干扰RNA（siRNA）表达载体,探讨载体介导的RNA干扰技术用于肺间质纤维化基因治疗的可行性。方法依据siRNA靶序列的设计原则,以FasL mRNA为靶基因,合成两对编码短发卡结构的两条DNA序列,经退火合成DNA双链,再克隆至siRNA表达载体pSilencer2．0中,转化后进行PCR鉴定和DNA序列测定。将构建的载体用脂质体介导转染入人肺腺癌A549细胞株,采用实时荧光定量PCR法检测细胞FasL mRNA水平变化。结果成功构建发卡样FasL siRNA真核表达载体;其转染人肺腺癌A549细胞后,细胞FasL mRNA的表达水平显著下降。结论FasL siRNA真核表达载体能显著抑制人肺腺癌A549细胞FasL mRNA的表达;本研究为肺间质纤维化的基因治疗奠定了基础。     

G250基因siRNA表达载体的构建与鉴定

目的 构建肾癌相关抗原G250小分子干扰RNA(siRNA)表达载体,通过抑制G250基因的表达,探索肾癌基因治疗的新途径.方法 根据基因库上的肾癌相关抗原G250 mRNA序列,设计并合成两端含有酶切位点的75个碱基的寡核苷酸链.寡核苷酸链退火后用T4DNA连接酶连接至线性化的质粒pRNAT-U6.1/Neo中,构建成重组质粒(命名为pshRNA-0250a,pshRNA-G250b),进行酶切及序列鉴定.结果 pshRNA-G250表达载体克隆构建成功,插入片段测序结果与合成的siRNA序列一致.结论 成功构建pshRNA-G250表达载体,为进一步的研究及探索.肾癌基因治疗奠定了基础.     

HPA反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞中HPA蛋白表达的影响

目的　探讨乙酰肝素酶 (HPA)反义寡核苷酸 (ASODN)对人食管癌 EC970 6细胞中 HPA蛋白表达的影响。方法　将食管癌 EC970 6细胞体外分组贴壁培养 ,实验组分别用设计合成的 10、2 0、30 μm ol/ L 三种浓度的 4条封闭肝素酶不同基因位点的 ASODN(ASODN- t1 、ASODN- t2 、ASODN- t3、ASODN- t4 )。对照 组为 1条无关寡核苷酸 (N - ODN)转染 EC970 6细胞 ,对照 组为无转染。采用免疫组化 (SP)法检测各组 EC970 6细胞中HPA蛋白表达情况。结果　实验组中 3种浓度的 4条 HPA- t2 效应最强。不同浓度的 4条 HPA ASODN对EC970 6细胞中 HPA蛋白表达的影响无统计学意义 (P >0 .0 5 ) ,但均低于对照 组及对照 组 (无转染 )(P<0 .0 5 )。结论　HPA ASODN可抑制食管癌 EC970 6细胞中 HPA蛋白表达。