汉坦病毒S基因0.7 kb片段真核载体的构建、表达及基因免疫

目的 在本室前期工作的基础上,进一步进行汉坦病毒S基因0．7kb片段的真核表达及基因免疫的研究。方法 构建汉坦病毒76－118株S基因5'端700bp片段的真核表达载体pcDNA3.1-S0.7,脂质体转染COS－7细胞,免疫荧光检测表达结果;用该质粒免疫BALB／c小鼠,并用免疫荧光法及ELISA法检测免疫的体液免疫应答效果。结果 免疫荧光检测结果表明,目的基因在COS－7细胞中获得瞬时表达;用pcDNA3.1-S0.7基因免疫小鼠可引起抗汉坦病毒核蛋白（NP）特异性的抗体应答。结论 汉坦病毒S基因0．7kb片段可刺激机体产生特异的抗汉坦病毒体液免疫应答。为进一步进行细胞免疫反应的检测及基因疫苗的研究提供实验基础。     

T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中的基因及蛋白表达

目的:检测T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗的基因表达.方法:大剂量提取质粒,将BALB/c鼠随机分为pcDNA3.1组、pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组和全硫代CpG组共5组(每组6只),双侧股四头肌内注射疫苗免疫,于第0、2、4周各免疫1次,共3次.接种疫苗后5 d,用RT-PCR法检测重组质粒mRNA表达.接种疫苗后7 d应用免疫组化检测重组质粒蛋白表达.结果:pcDNA3.1/TCR Vβ8组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+ IL-2组、pcDNA3.1/TCR Vβ8+CpG+脂质体组小鼠骨骼肌中均显示mRNA和蛋白表达,而pcDNA3.1组和全硫代CpG组未见mRNA和蛋白表达.结论:T淋巴瘤TCR β链独特型DNA疫苗在小鼠骨骼肌中有效地表达了基因产物.     

Aβ1-15多价DNA疫苗的构建及其对体液免疫的效果

[目的]构建Aβ1-15多价DNA疫苗,研究其诱导体液免疫的效果.[方法]基因合成和PCR技术扩增以多个甘氨酸连接的Aβ1-15二价基因片段;在N端引物延伸加上IgG κ轻链信号肽序列;GSGGSGlinker再串连两段Aβ1-15二价基因片段,克隆入pcDNA3.1表达载体,构建pcDNA3.1-s4×Aβ15真核表达质粒;质粒转染COS-7细胞,Western blot检测4×Aβ15的表达;质粒肌肉注射接种BALB/c鼠,共6次,18周加强免疫,ELISA法检测抗体效价以及抗体分型;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗血清与转基因鼠Tg2576脑切片中老年斑的特异结合.[结果]测序证实所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15载体序列正确,在COS-7细胞中表达分子质量约8 ku的分泌型4×Aβ15蛋白.pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗于第2次加强免疫后产生Aβ抗体,随加强免疫次数增多,抗体滴度增加,在19周,抗体平均滴度为1:6 400,抗体以IgG1型为主,且可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑免疫结合并被Aβ42肽抗原的中和.[结论]所构建的pcDNA3.1-s4×Aβ15疫苗可在小鼠体内产生高效价的Aβ抗体,为下一步免疫老年性痴呆转基因动物的研究提供条件.     

汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗的免疫效应

目的探讨汉坦病毒H8205株G1-人源IL-2融合基因疫苗（pcDNA3．1／HisB-IL-2-G1）的免疫效应。方法将pcDNA3.1／HisB-IL-2-G1融合基因疫苗通过肌肉注射途径免疫BALB／c小鼠，每隔3周免疫1次，共免疫3次；酶联免疫法（ELISA）检测抗汉坦病毒（HTNV）抗体；空斑减少中和试验检测免疫血清中和抗体效价；淋巴细胞增殖试验（MTT法）检测免疫小鼠的细胞免疫反应；动物保护试验以BALB／c小鼠为感染动物模型，在第3次免疫后2周，腹腔内注射100TCID50（半数感染量）HTNV，然后以免疫荧光法观察鼠肾切片，评价其保护力。结果pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗免疫后可刺激机体产生特异性抗体和中和抗体，中和效价为1：20～1：80。MTT法结果表明，免疫小鼠的脾淋巴细胞有特异性增殖反应。动物试验表明pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗能保护小鼠免受HTNV感染。结论pcDNA3．1／HisB—IL—2—G1融合基因疫苗可诱导特异性体液免疫应答和较强的细胞免疫应答。     

汉坦病毒包膜糖蛋白基因核酸免疫的初步研究

目的将克隆有汉坦病毒包膜糖蛋白基因M片段及G1、G2基因的重组质粒免疫动物，了解上述目的基因在核酸疫苗中的应用价值。方法大量制备已构建好的pcDNA3．1-M、pcDNA3．1-G1、pcDNA3．1-G2重组质粒DNA及对照空质粒pcDNA3．1。然后用这四组质粒DNA通过肌肉注射的方法免疫6～8周龄的BALB／c小鼠（每组5只），每4周免疫一次，共免疫3次，每次免疫前及最后一次免疫后2周断尾取血，用免疫荧光的方法检测基因免疫的体液免疫应答效果。结果重组质粒pcDNA3．1-G1免疫小鼠有4只血清抗汉坦病毒抗体为阳性，重组质粒pcDNA3．1-G2以及重组质粒pcDNA3．1-M免疫小鼠各有1只血清抗汉坦病毒抗体为阳性。结论汉坦病毒糖蛋白基因核酸免疫动物后可刺激机体产生特异性的体液免疫应答。     

人乳头瘤病毒16型E6E7基因协同共激活分子B7-1基因免疫诱导的特异性免疫反应

目的利用突变修饰后的中国山东地方株人乳头瘤病毒16型(humanpapillomavirustype16,HPV16)E6E7融合基因(fmE6E7),研究治疗HPV16感染相关疾病的DNA疫苗,并进一步探索利用共激活分子B7-1基因,研究更加活化细胞免疫的加强疫苗。方法将用PCR法扩增获得fmE6E7基因插入真核表达质粒pVR1012中获得pVR1012-fmE6E7,瞬时转染Cos-7细胞,免疫荧光组织化学法检测证实其表达后,在C57BL/6小鼠肌肉内进行pVR1012-fmE6E7单独免疫,或与小鼠共激活分子B7-1基因真核表达质粒(pcDNA3.1-B7-1)联合免疫。51Cr释放法分析免疫小鼠的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)活性,间接ELISA法检测小鼠血清中E7特异性抗体。用5×105个C3细胞皮下接种C57BL/6小鼠,分析小鼠体内诱发的特异性抗瘤免疫水平。结果修饰后的E6E7基因免疫可诱导机体产生特异的抗体反应和CTL反应,小鼠B7-1基因与fmE6E7联合免疫可显著提高特异性CTL活性,并可保护33%(2/6)的小鼠免受C3肿瘤细胞的攻击,而单独fmE6E7基因免疫则不能抑制C3瘤细胞的生长,联合B7-1基因免疫对诱发的抗体水平无加强作用。结论中国山东地方株E6E7融合基因可用于DNA疫苗的构建,B7-1基因协同免疫可提高疫苗的细胞免疫水平,利用B7-1基因作为HPV16DNA疫苗的协同因子具有重要价值。     

Aβ42重组多价DNA疫苗的构建及诱导Aβ抗体的产生

目的: 构建β-淀粉样蛋白(Aβ42)的多价重组DNA疫苗,确定是否诱导较高滴度Aβ抗体的产生.方法: PCR法从Tg2576转基因鼠基因组DNA中扩增人Aβ42基因片段;在Aβ42基因的5′端引物延伸连接IgG к轻链信号肽序列;利用GSGGSG linker基因串连两段Aβ42基因片段;将产物克隆入pcDNA3.1表达载体,分别构建pcDNA3.1-Aβ42,一价分泌型pcDNA3.1-sAβ42,二价分泌型pcDNA3.1-s2×Aβ42载体;转染COS-7细胞,免疫印迹检测Aβ42的表达;im接种BALB/c鼠,ELISA法测定抗体效价;免疫组织化学和Aβ42肽抗原的中和实验检测抗体与Tg2576鼠脑切片中的老年斑的结合.结果: 测序证实所构建的pcDNA3.1-Aβ42,pcDNA3.1-sAβ42,pcDNA3.1-s2×Aβ42载体插入序列正确;Western Blotting证实在COS-7细胞中表达相应的蛋白.经6轮,22 wk加强免疫后,pcDNA3.1-Aβ42疫苗不能产生Aβ抗体、pcDNA3.1-sAβ42接种后产生较低的Aβ抗体(<1:1000),pcDNA3.1-s2×Aβ42第1次加强免疫后即产生抗体,抗体滴度随接种次数增多而升高,22 wk时抗体平均滴度达1:5000以上,可以与转基因鼠Tg2576脑切片中的老年斑结合,并能被Aβ42肽抗原特异性中和.结论: 二价分泌型pcDNA3.1-s2×Aβ42疫苗,可在动物体内产生高效价的特异Aβ抗体.     

抗猪带绦虫六钩蚴兔血清的制备及重组质粒pcDNA3.1/TSO45-4B在小鼠骨骼肌的表达

目的:制备抗六钩蚴全虫可溶性抗原的兔血清,观察本室制备的猪带绦虫六钩蚴期特异性抗原基因TSO45-4B的重组核酸疫苗pcDNA3.1/TSO45-4B经肌肉接种后在宿主体内的表达.方法:用次氯酸钠法孵化六钩蚴,Dot-B1ot、ELISA检测兔血清中特异性抗体及滴度;以pcDNA3.1/TS045-4B进行体内转染,继之免疫组化法观察其在鼠体骨骼肌的表达.结果:抗六钩蚴兔血清多克隆抗体制备成功,抗体效价为1:20 100;免疫组化染色后在重组质粒注射部位肌肉组织的肌纤维内显示阳性的棕黄色分泌颗粒.结论:重组质粒在小鼠骨骼肌内成功地表达为猪囊尾蚴病多基因DNA疫苗的研制提供了体内表达的依据之一.     

嗜肺军团菌pilE基因体外表达及其免疫原性研究

目的 构建嗜肺军团菌Ⅳ型菌毛pilE基因的真核表达重组质粒pcDNA3.1-pilE,研究其真核细胞中的表达及其免疫原性.方法 以嗜肺军团菌1型DNA为模板,PCR扩增获得嗜肺军团菌pilE基因,将其定向插入载体pcDNA3.1( ),构建真核表达重组质粒pcDNA3.1.-pilE.经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-pilE转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western-blot分别鉴定pcDNA3.1-pilE的瞬时和稳定表达产物.将pcDNA3.1-pilE作为DNA疫苗免疫BALB/c小鼠,检测免疫小鼠体内抗原特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖活性、IFN-γ产生水平、CTL杀伤活性等指标,评价疫苗的免疫原性.结果 扩增出了429 bp的PilE基因,在细胞膜与细胞内观察到较强的绿色荧光,在相对分子质量15000处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA3.1-pilE在细胞内表达PilE蛋白.pcDNA3.1-pilE免疫组的免疫原性均高于对照组pcDNA3.1( )组(P＜0.01).结论 成功构建了嗜肺军团菌pilE基因的真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中得到了表达,免疫小鼠后诱导了特异的体液免疫应答和细胞免疫应答.     

不同载体及靶基因对乙型肝炎病毒DNA疫苗免疫效果的影响

目的　探讨不同DNA载体及靶基因对DNA疫苗免疫效果的影响.方法　用已构建的不同载体HBVS基因疫苗(pCR3.1-S,pcDNA3-S)和HBVC基因疫苗(pCR3.1-C)分别给BALB/c小鼠多点肌肉注射,2wk后追加免疫1次,用ELISA法及MTT法分别检测小鼠血清抗-HBs及HBc及脾细胞对HBsAg或HBcAg的特异性增殖反应.结果　免疫接种2wk后小鼠血清抗-HBc抗体均明显高于对照组,载体pCR3.1的表达效力稍高于pcDNA3,但同一基因不同载体间无显著差异.不同靶基因血清抗体滴度及脾细胞对HBsAg或HBcAg的刺激指数均明显高于对照组,刺激指数pCR3.1-C组明显高于…     

含CpG基序的寡核苷酸对乙型肝炎病毒基因疫苗的细胞免疫效应的影响

目的探讨人工合成的CpG ODN作为佐剂对乙肝病毒基因疫苗诱导小鼠产生细胞免疫应答的影响.方法构建编码乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗,人工合成含CpG基序(motif)的硫代磷酸寡核苷酸(CpG ODN)作为佐剂,观察其对HBV基因疫苗接种Balb/c小鼠诱导产生淋巴细胞增殖和淋巴细胞杀伤等细胞免疫应答的影响.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的淋巴细胞增殖及杀伤效应(P＜0.05);应用CpGODN组与未应用组相比较,免疫小鼠产生更强的HBV特异性细胞免疫应答(P＜0.05).结论CpG ODN作为佐剂,对HBV基因疫苗诱导Balb/c小鼠产生细胞免疫应答具有促进作用.     

Enhancing DNA vaccine potency against hantavirus by co-administration of interleukin-12 expression vector as a genetic adjuvant

Background The heavy incidence and mortality of hemorrhagic fever with renal syndrome, as well as no specific drugs in curing the disease, clearly indicate the need for development of the more effective hantavirus vaccine. Refining the DNA vaccination strategy to elicit more clinically efficacious immune responses is now under intensive investigation. In the present study, we examined the effects of using an interleukin-12 expression plasmid as a genetic adjuvant to enhance the immune responses induced by a DNA vaccine based on the S gene encoding nucleocapsid protein against hantavirus.Methods BALB/c mice were immunized three times by intramuscular inoculations of DNA vaccine encoding of hantanvirus nucleocapsid protein alone or in combination with a plasmid expressing murine interleukin-12 (pcIL-12). Booster immunizations were employed 2 times at 2-week interval. To evaluate the humoral and cellular immune responses, antigen-specific lymphocyte proliferation and antibody production were assayed by MTT method and ELISA respectively. The level of interleukin-4 and interferon-γ in the splenic lymphocytic cultured supernatant were detected with ELISA kit at day 5, 10, 17, 35 and 42 after primary immunization.Results Antigen-specific IgG antibodies was increased markedly at day 17 in the experiment groups and reached a plateau after day 35. As pcIL-12 co-injected, a significant inhibition of antigen-specific IgG levels was displayed over the period and the antibody mean titre was decreased to only about 1 : 50 at day 42 after primary immunization, significantly lower than the group immunized with pcDNA3.1 S alone, in which the mean titre was about 1 : 70. Interferon-γ was increased remarkably by the co-injection of pcIL-12 compared with the injection of pcDNA3. 1 S alone. However, the production of interleukin-4 was inhibited by pcIL-12 coinjection. Furthermore, pcIL-12 co-injection efficiently enhanced antigen-specific lymphocyte proliferation.Conclusion Humoral and cytokine responses elicited by pcDNA3.1 S inoculation can be modulated by coinoculation with pcIL-12 and efficiently induced Thl-dominant immune responses.     

基因转染Sp2/0细胞作为检测乙肝病毒基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的研究

目的研究乙型肝炎病毒(HBV)S基因转染的Sp2/0细胞作为检测HBV基因疫苗细胞免疫效应的靶细胞的可行性.方法以脂质体介导基因转染,含G418的培养基筛选,获得HBV基因S转染的Sp2/0细胞;构建编码HBV抗原蛋白S的重组真核表达质粒pCR3.1-S作为HBV基因疫苗;采用51Cr 4 h释放法体外检测HBV基因疫苗免疫接种小鼠的淋巴细胞杀伤功能.结果与空载体对照组相比较,HBV基因疫苗诱发Balb/c小鼠产生较好的HBV特异的细胞免疫应答(P＜0.05).结论以Sp2/0基因转染细胞作为靶细胞检测免疫BALB/c小鼠的淋巴细胞杀伤功能是可行的.     

弓形虫P30-P22复合DNA疫苗免疫小鼠诱导的体液免疫应答

目的通过肌内注射弓形虫DNA疫苗PCDNA3．1-P30-P22直接免疫小鼠，观察其诱导的体液免疫应答及保护性作用。方法大量制备重组真核表达质粒PCDNA3．1-P30-P22，肌内注射免疫小鼠，ELISA法测定其抗体滴度的变化，用弓形虫作致死性攻击感染。结果实验组抗体水平明显高于对照组，二者存在显著性差异(P＜0．05)；攻击感染后实验组小鼠存活时间明显延长(P＜0．05)。结论重组真核表达质粒PCDNA3．1-P30-P22肌注BALB/C系小鼠可诱导一定的体液免疫应答，对攻击感染具有一定的保护性。     

地方株HPV16L1基因诱发的小鼠体液免疫反应

目的检测pcDNA-L1的表达,评价地方株HPV16L1基因疫苗诱导的体液免疫反应.方法采用PCR技术从宫颈癌组织中获得L1基因,以pGEM-T Easy为克隆载体构建重组质粒pGEM-T-L1,进行限制性核酸内切酶及核苷酸序列分析,再将L1基因亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,构建地方株HPV16L1基因疫苗,转染COS-7细胞,通过IFA试验验证L1蛋白的表达.用pcDNA-L1肌肉内注射方法分别于第1天、第15天和第43天免疫6周龄BABL/c小鼠,在特定时间段采血分离血清,IFA分析基因免疫在小鼠体内诱导的免疫应答,设pcDNA载体对照.结果pcDNA-L1能够在COS-7细胞中暂态表达,免疫小鼠后能检测出特异的抗体,用IFA方法在第一次免疫后的第30、60和180天均可检测到抗体;原载体免疫后未检出特异抗体.结论本实验构建的地方株HPV16L1基因疫苗可诱导产生特异性的体液免疫反应.     

丙型肝炎病毒多CTL表位DNA疫苗免疫学特性的初步研究

目的:探讨丙型肝炎病毒(HCV)疫苗研制并为抗HCV感染提供实验依据。方法:从HCV J株基因组中,选取小鼠(H-2d)CTL表位基因序列,以pcDNA3.1(+)质粒为载体,构建相应的真核表达质粒,经肌肉免疫后,取受免疫小鼠血清和脾细胞,用ELISA及MTT法检测小鼠血清中IL-2和IFN水平及小鼠脾细胞的增殖活性。结果:实验组小鼠血清中IL-2及IFN水平明显高于对照组[IL-2:(208±8.88)比(106±6.06);IFN:(179.5±2.52)比(90.5±2.52),P<0.05];实验组淋巴细胞增殖指数明显高于对照组(1.56比1.13,P<0.05)。结论:本实验构建的pcDNA3.1(+)/HCV CTL真核表达质粒,经肌肉免疫后可以使受免疫小鼠细胞免疫应答水平提高,淋巴细胞增殖活性增高。     

IL-12对乙肝病毒全S基因疫苗免疫效应的影响

目的：探讨IL-12对乙型肝炎病毒全S基因疫苗的免疫效果的影响。 方法：BABL/c小鼠分为对照组、HBV全S基因表达质粒单独免疫组（pcDNA3-PS）及pcDNA3-PS联合IL-12表达质粒免疫组（pcDNA3-PS＋IL-12）,免疫后6周测血清抗HBs,T细胞增殖反应实验及IL-2和IFN-γ水平。 结果：pcDNA3-PS＋IL-12组抗HBs滴度、刺激指数（SI）、细胞因子水平均较pcDNA3-PS增高,差异有显著性;两免疫组抗HBs滴度、SI和细胞因子水平均较对照组增高,差异有显著性。 结论：HBV全S基因疫苗可刺激小鼠产生特异性免疫,IL-12对HBV全S基因疫苗具有免疫佐剂效果。