重组35型腺病毒介导人骨形成蛋白基因对脂肪源性干细胞的诱导分化

目的在体外运用人骨形成蛋白7（human bone morphogenetic protein 7，hBMP-7）基因重组35型腺病毒（recombinant adenovirus’s containing fibers derived from B—group serotype 35，rAd5／F35）诱导大鼠脂肪源性干细胞（adipose—derived adult stem cell，ADASC）向成骨细胞定向分化，为骨组织工程探索新的细胞来源。方法以pcDNA1．1／氨苄青霉素-hBMP-7质粒为模板扩增hBMP7基因，将回收的PCR产物片段克隆入pDC316载体，获得重组质粒pDC316-hBMP7。骨架质粒pBHG—fiber5／35和穿梭质粒pDC316-hBMP-7共转染293细胞，同源重组产生rAd5／F35-hBMP-7。同样的方法构建rAd5／F35-增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）。在体外分别转染大鼠ADASC并留置空白对照。观察细胞形态和生长情况，ELISA检测转染基因的转录和表达，检测钙结节和骨钙素等成骨细胞表型。结果PCR、酶切鉴定表明rAd5／F35-hBMP-7质粒构建正确。rAd5／F35-EGFP对大鼠ADAsc中转染效率可达90％以上，hBMP7基因存在于转染后的ADASC中并表达相应的蛋白，诱导组钙结节形成，电镜见胞质中有钙质成分，碱性磷酸酶阳性，骨钙素表达增强。结论rAd5／F35介导hBMP7基因可促进ADASC向成骨细胞定向分化。     

核定位信号肽在异种移植动物模型转人α1,2-岩藻糖苷转移酶基因小鼠制备中的作用

目的探讨核定位信号肽（NLS）在转人α1，2-岩藻糖苷转移酶（HT）基因小鼠制备中的作用。方法将受精卵随机分为3组，采用显微注射的方法制备转基因小鼠。实验组：将NLS转基因构件与人HT转基因构件同时导入细胞质；对照Ⅰ组：将人HT转基因构件导入细胞质；对照Ⅱ组：将人HT转基因构件导入细胞核。应用聚合酶链反应（PCR）、Southern杂交及逆转录（RT）-PCR等方法检测人HT基因在G0代小鼠体内的整合与表达，应用流式细胞计数（FCM）检测转基因小鼠外周血单核细胞（PBMCs）表面H抗原与α-Gal抗原的表达。结果实验组与对照Ⅰ组G0代小鼠的出生率33．8%（46／136）及35．4%（23／65）高于对照Ⅱ组10．2％（51／498）（P〈0．01），实验组人HT基因的整合率（30．4%，14／46）高于对照Ⅰ组（0，0／23）与对照Ⅱ组（11．8%，6／51，P〈0．01），实验组人HT基因的表达率（19．6%，9／46）也高于对照Ⅰ组（0，0／23）和对照Ⅱ组（5．9%,3／51，P〈0．01），人HT mRNA在小鼠心、肝、肾和骨骼肌组织中均表达阳性。转基因小鼠PBMCs表面H抗原表达阳性，表达强度为人的85％～190%，同时α-Gal抗原表达显著降低。为正常小鼠的5%～12％。转基因小鼠已经稳定传3代。结论NLS基因与目的基因细胞质共注射是制备转基因小鼠简便实用的新方法。     

异种移植血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠的建立

目的建立用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。方法采用受精卵显微注射技术，将含有人ICAM-2启动子、人CD59基因第1个内含子、人CD59 cDNA、BGH polyA终止信号的外源基因导入小鼠受精卵的原核中。选取注射后仍健康的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中待分娩。聚合酶链反应（PCR）及Southern blot确定外源基因整合阳性转基因小鼠。流式细胞术用于外源基因蛋白质水平表达检测。免疫组织化学方法观察人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏等器官表达分布情况。结果产仔130只，9只外源基因整合阳性。整合率6％（9／130）。6只获得蛋白质水平表达。蛋白质水平表达强度为人CD59在人白细胞表达强度的80％至95％，转基因效率5％（6／130）。免疫组织化学检测显示人CD59在转基因小鼠心脏、肝脏、肾脏组织有较强表达，且表达限于血管内皮细胞。结论成功地建立了用于异种移植研究血管内皮细胞组织特异性表达人CD59转基因小鼠。     

免疫和非免疫因素在角膜移植片慢性失功中的作用

目的利用小鼠角膜移植片慢性失功（CCAD）模型研究免疫和非免疫因素在CCAD发生发展过程中的作用。方法分别以C57BIM6（异系）、CB6F1（F1代）、BALB／c（同系）小鼠为供体,以BALB／c小鼠为受体进行穿透角膜移植,健康BALB／c小鼠为对照组。术后对角膜移植片进行评分;免疫组织化学法检测各组移植片CD4‘T淋巴细胞、F4／80、TGF—G、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、d平滑肌肌动蛋白（d．SMA）表达;手术后1、2、3个月采用反转录PCR法检测各组小鼠角膜移植片中F4／80和TGF—B表达情况。结果异系移植组发现典型的临床免疫排斥反应并有移植片混浊,F1代和同系移植组小鼠移植片未发现临床可见的急性排斥反应而移植片透明度随时间逐渐下降,对照组角膜始终透明。异系移植组移植片基质中见大量CD4^＋T淋巴细胞浸润;F1代移植组和同系移植组偶见CD4^＋T淋巴细胞浸润,对照组未见CD4^＋T淋巴细胞。各组角膜基质内均可见F4／80、TGF—B、bFGF阳性表达,阳性表达量随着各组免疫原性减弱而降低。术后早期各移植组F4／80表达量低,晚期表达量增高,对照组F4／80未见表达;而TGF—B各移植组早期表达量较多,晚期表达量下降,对照组各时间点均为低表达。异系移植组和F1代移植组角膜移植片发生混浊时,基质内可见d-SMA阳性表达,同系移植组呈弱阳性表达,对照组未见阳性表达。结论穿透角膜移植术后抗原依赖的免疫细胞浸润和非抗原依赖的细胞因子异常表达都参与了角膜移植片慢性失功的过程。     

G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1发夹结构通过影响Paxillin的功能抑制成骨细胞迁移

目的探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1（Gprotein coupled receptor kinase interacting protein 1，GIT1）的RNA发夹结构（hairpin）（GIT1-RNAh）对成骨细胞迁移的影响，并分析其机制。方法取培养至第6代的鼠成骨细胞，随机分成两组，分别用包含GIT1-RNAh（实验组）和绿色荧光蛋白（green fluoresence protein，GFP）的RNA发夹结构（GFP—RNAh）的腺病毒（对照组）感染12h后，再将每组分成有、无血小板源性生长因子（platelet drived growth factor，PDGF）刺激的两组。免疫荧光染色方法检测成骨细胞内源性GIT1蛋白表达和Paxillin的位置。Western Blot检测Paxillin的磷酸化。构建包含蓝色荧光蛋白的GIT1-RNAh（CFP—GIT1-RNAh）实验组和GFP—RNAh（CFP—GFP—RNAh）（对照组），免疫荧光双染的方法检测CFP—GIT1-RNAh和CFP—GFP—RNAh对Paxillin位置的特异性作用。用划痕愈合法检测GIT1-RNAh（实验组）和GFP—RNAh（对照组）腺病毒对成骨细胞在PDGF刺激下的迁移能力的影响。结果免疫组织化学观察，实验组和对照组比较，明显抑制成骨细胞内源性的GIT1蛋白表达和扰乱Paxillin的分布。Western Blot观察，和对照组相比，实验组明显抑制了Paxiliin的磷酸化（P〈0．05）。划痕愈合法检测观察，和对照组相比，实验组明显抑制成骨细胞的迁移。结论GIT1-RNAh通过扰乱Paxillin的分布和其磷酸化从而抑制成骨细胞的迁移。     

真核表达载体pcDNA3.1(-)-转化生长因子β3的构建

目的为研究成纤维细胞基因转染的可行性创造条件，从而为转化生长因子（TGF）83转基因治疗创面与病理性瘢痕的研究奠定基础。方法应用基因重组技术和限制性内切酶酶切构建并鉴定pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体，经脂质体Lipofectamlne^TM 2000介导质粒转染NIH3T3细胞后应用逆转录．聚合酶链反应（RT—PCR）检测hTGFβ3 mRNA在真核细胞中的表达。结果重组真核表达载体pcDNA3，1（-）-hTGFβ3经限制性内切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ酶切，电泳后显示1253hp的hTGFβ3目的片段和5．40kb的pcDNA3．1（-）载体片段，测序证实酶切片段与GenBank中登记的TGFβ3全长序列相同，证实pcDNA3．1（-）-hTGFβ3真核表达载体构建成功，经RT-PCR检测了hTGFβ3在转录水平mRNA的表达情况，表明质粒转染NIH3T3细胞后hTGFβ3 mRNA的表达明显增强。结论重组真核表达载体构建正确，并能在NIH3T3成纤维细胞中表达hTGFβ3 mRNA，为其在创面与病理性瘢痕的转基因治疗奠定了基础。     

X-盒结合蛋白1条件性基因敲除小鼠模型的建立

目的建立可进行条件性敲除X-盒结合蛋白1(Xbp1)基因的flox杂合子小鼠。 方法通过ET-clone的方法构建基于cre-loxp系统和FLP-frt系统的条件性基因打靶载体。载体线性化后电转JM8A3 ES细胞,经G418和Ganc筛选获得抗性ES细胞克隆。经长片段PCR鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性ES细胞经克隆扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合鼠,筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配后获得阳性F1代小鼠,并分别进行PCR和测序鉴定。 结果成功构建打靶载体,共获得144个抗性ES细胞,克隆经长片段PCR鉴定,共获得4个正确同源重组的阳性克隆。获得4只阳性F1代小鼠,经测序鉴定正确。Xbp1基因flox杂合子小鼠表型无明显异常。 结论成功构建了条件性敲除Xbp1基因的flox杂合子小鼠,为未来研究器官或组织特异性的Xbp1生物学作用奠定了基础。     

Spyda基因过表达转基因小鼠品系的建立

目的建立Spyda基因过表达转基因小鼠品系用于深入研究Spyda基因的功能。方法利用Gateway技术构建Spyda表达载体,通过DNA显微注射的方式获得Spyda基因过表达的首建鼠。首建鼠与野生型鼠杂交,所得子代中的阳性鼠同窝交配,已传3代以后的阳性小鼠经SYBR Green实时荧光定量PCR方法检测外源基因的起始模板量,通过与杂合子比较来预测小鼠的基因型,再用传统育种方式验证SYBR Green实时荧光定量PCR的结果。结果获得7只首建鼠,通过与野生型鼠杂交获得阳性子代,进行同窝交配,传至第3代,经实时荧光定量PCR方法筛选出4只纯合子的小鼠,经测交验证,其与正常小鼠交配所生的后代均为阳性,证明实时定量PCR的结果是正确的。建立了2个独立的Spyda转基因小鼠纯合子品系。结论建立了稳定遗传的纯合子Spyda基因过表达转基因小鼠品系,可作为工具鼠进一步深入研究Spyda基因的功能。     

肝细胞特异性HuR基因敲除小鼠模型的表型研究

目的 探讨肝细胞特异性敲除HuR基因对小鼠肝脏功能的影响。方法 从美国Jackson实验室引进LoxP标记的人抗原R（human antigen R,HuR）基因小鼠（HuR^fl/fl）和Alb-Cre转基因小鼠。杂交后,经数代选育配种,建立肝细胞特异性HuR基因敲除小鼠（HuR^LKO）模型。PCR技术鉴别小鼠基因型,蛋白免疫印迹和免疫荧光实验检验小鼠肝脏的HuR表达水平,同时HE染色观察肝脏结构变化。高脂喂养HuR^fl/fl/Alb-Cre和HuR^fl/fl两组小鼠,观察小鼠体重、肝重和肝体比变化,提取血清检测肝脏损伤和脂肪代谢相关指标。结果 PCR成功检测筛选子代小鼠基因型,包括HuR^fl/fl/Alb-Cre和HuR^fl/fl小鼠。蛋白免疫印迹实验和免疫荧光实验证明小鼠肝细胞特异性HuR基因敲除成功。HE染色结果提示HuR^LKO小鼠的肝细胞出现变性水肿、局部坏死。高脂喂养实验提示两组小鼠在肝重、肝体比、AST、ALT、HDL-C、血糖上的差异具有统计学意义（P＜0.05）,但在体重、TG、LDL-C的差异没有统计学意义（P＞0.05）。结论 HuR基因是维持小鼠肝细胞功能的必要基因,Cre-LoxP技术可成功构建HuR^LKO小鼠模型,且特异性高,表型明显,为研究HuR在肝脏各项疾病的发生发展中所扮演的角色,提供了一个很好的疾病模型。     

大鼠系膜细胞中碱性调宁蛋白h1和转化生长因子β1的表达及其相互关系

目的 探讨大鼠系膜细胞(MsC)中碱性调宁蛋白(calponin)h1与TGF-β1的表达 及其相互关系。方法制备大鼠抗thy-1系膜增生性肾炎模型(ATG)。应用免疫组织化学ABC 法、Western印迹、RT-PCR等方法分别从蛋白和核酸水平检测calponin h1和TGF-β1在肾炎模型 第1、3、5、7、14、21、28天组织中的表达:采用细胞免疫化学和细胞免疫荧光法检测培养大鼠 MsC中calponin h1的表达;应用Western印迹和RT-PCR的方法观察精氨酸和乙醇分别孵育后 大鼠MsC中calponin h1和TGF-β1的表达变化。结果 与少量表达calponin h1和不表达TGF-β1 的正常组比,肾炎3 d组至14 d组calponin h1表达明显增强,7 d组至28 d组TGF-β1表达显 著增强(P<0.05)。calponin h1表达定位于大鼠MsC胞浆内。精氨酸作用后大鼠MsC TGF-β1表 达增强,calponin h1表达减弱;乙醇作用后大鼠MsC表达calponin h1升高,表达TGF-β1降低。 结论 ATG大鼠MsC中calponin h1表达在肾小球病变早期增强.后期减弱;而TGF-β1表达则 在肾小球病变中晚期显著增强。calponin h1可能具有负反馈调节TGF-β1表达的作用。     

膝关节后交叉韧带断裂治疗临床分析

目的 对35例膝关节后交叉韧带断裂治疗进行临床分析,重点探讨了有关交叉韧带断裂的治疗问题。方法 经明确诊断后,分析采用胫骨附着处撕脱骨折复位固定手术治疗26例、早期髌韧带中1／3移植重建3例、单纯长腿石膏固定6例。结果 本组病例全部进行随访,随访时间13个月－5年,胫骨附着处撕脱骨折复位固定及髋韧带中1／3移植重建29例为优良、单纯长腿石膏固定6例为差。结论 后交叉韧带断裂后应该及时给予手术修复;膝后外侧手术入路,操作简单,暴露充分;少于3个月的陈旧性病例仍适应手术治疗。     

不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效分析

目的：探讨不同方法重建指尖离断静脉回流的疗效。方法：2008年3月-2013年2月收治指尖离断患者80例,38例吻合指侧方静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1或1：2或2：2,平均1：2;22例吻合指腹静脉重建回流,术中吻合动静脉比例1：1;20例未吻合静脉,术中仅吻合1条动脉,行侧切口或甲床放血。观察各组治疗效果。结果：吻合指侧方静脉组手指全部成活,无一例发生回流障碍;吻合指腹静脉组19例发生静脉危象,其中4例手指坏死;未吻合静脉组20例均发生回流障碍,其中6例手指坏死。58例获随访,随访时间6~28个月。吻合指侧方静脉组32例,指尖外形佳、指腹饱满;吻合指腹静脉组14例,指体轻度萎缩,指甲生长不平整;未吻合静脉组12例,指体萎缩明显。吻合指侧方静脉组指甲生长近平整,长度长于其他两组[（14.4±3.2）mm比（12.5±2.3）mm和（12.2±2.2）mm],远侧指间关节活动度大于其他两组[（63±5）°比（48±3）°和（45±7）°],两点分辨觉小于其他两组[（4.6±0.4）mm比（7.1±1.2）mm和（7.3±0.6）mm],感觉级别高于其他两组[S（3.45±0.39）级比S（2.57±0.42）级和S（2.55±0.49）级],差异均具有显著性（P〈0.05）。吻合指腹静脉组和未吻合静脉组在指甲长度、运动和感觉方面差异无统计学意义（P〉0.05）。结论：吻合指侧方静脉能有效解决指尖再植静脉回流问题,可避免回流障碍,成活率高,促进指甲生长,可恢复 DIPJ 活动度及感觉。     

胫骨干骨折的手术治疗对策

目的：明确不同固定器械在胫骨干不同骨折类型固定中的特点，以指导临床应用。方法：68例胫骨干骨折，行加压钢板螺钉、交锁髓内钉、单侧外固定架固定后，作临床疗效分析。结果：加压钢板固定组42例，感染5例，骨不连1例，平均愈合时间3．8个月；交锁髓内钉固定组13例，无感染及骨不连，平均愈合时间5．4个月；单侧外固定架组13例，骨不连1例，踝关节背伸受限3例，平均愈合时间4．5个月。结论：胫骨骨折交锁髓内钉固定并发症少，功能恢复好，适用范围广，但要注意及时进行动力加压。加压钢板及外固定架固定应选择各自的最佳适应证，以达到理想的疗效。