链球菌G蛋白的特性及应用前景

链球菌G蛋白（Streptococcal Protein G,SPG）是一种能与抗体IgG的Fc片段结合的蛋白质。它可与人IgG4种亚类.以及许多哺乳动物的单克隆、多克隆IgG有较强的结合力,具有与SPA显著不同的特性和更强的IgG亲和力,更广的结合谱,在免疫学上具有广泛的应用价值。本文对SPG的特性及应用前景进行简述。     

人源抗乙型肝炎病毒基因工程全抗体的研制

目的 研制人源化抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的IgG全抗体。方法 采用噬菌体抗体库技术,从乙肝疫苗免疫后健康人外周血淋巴细胞中提取抗体基因建立抗体库,用纯化的HBsAg筛选Fab抗体;再将获得的抗体轻、重链构建到杆状病毒表达载体pAc-κ-Fc中,转染SF9细胞表达IgG全抗体并进行纯化。免疫荧光检测抗体的表达,竞争抑制ELISA检测其与抗原的结合活性及特异性。结果 获得了一株抗乙肝表面抗原的Fab抗体;在转染后的SF9培养上清中收获到了IgG抗体,竞争ELISA证实该抗体针对HBV表面抗原的特异性抗体。结论 本实验得到了一株人源抗HBsAg的IgG抗体,并进行了纯化。     

肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的 构建肺炎链球菌SpxA蛋白的原核表达系统,制备其多克隆抗体.方法 设计引物,利用PCR技术扩增肺炎链球菌D39菌株的spxA基因,并插入表达载体pET-28a(+)内,测序鉴定.重组质粒转化至大肠埃希菌BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达含6个组氨酸标签的SpxA重组蛋白,经Ni-NTA亲和层析柱纯化后,以其为抗原免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体.用ELISA及Western印迹方法分别检测多克隆抗体的效价及特异性.结果 从大肠埃希菌中诱导出高表达的SpxA重组蛋白,纯化后免疫小鼠获得抗血清,ELISA测定其效价可达1:2 560 000以上,Western印迹结果显示其能特异性地作用于肺炎链球菌SpxA.结论 成功构建了pET-28a(+)-spxA原核表达质粒,获得了高纯度的目的 蛋白和高滴度、高特异性的多克隆抗体.     

应用Protein G纯化细胞培养上清中的大鼠单抗

用ｍｉｎｉＰｅｒｍ系统旋转连续培养大鼠杂交瘤细胞株,获得大量含抗鼠ＩＬ－４（ＩｇＧ１）和ＩＬ－５（ＩｇＧ１和ＩｇＧ２ａ）抗体的培养上清;经ＰＭ１０膜超滤,５０％饱和硫酸铵沉淀及链球菌Ｃ蛋白－琼脂糖亲和层析纯化ＩｇＧ单抗。结果每升杂交瘤细胞２上清得到大鼠,ＩｇＧ２２－３６ｍｇ;１次可纯化抗体２０ｍｇ;经过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及ＥＬＩＳＡ鉴定,所得到的抗体纯度高,活性保持良好。     

链球菌蛋白G应用于ELISA的实验研究

对酶标记链球菌蛋白Ｇ（ＳＰＧ）在ＥＬＩＳＡ的应用条件进行了研究并与ＳＰＡ作了系统比较。ＳＰＧ与ＩｇＧ结合受温度影响，３７℃结合活性高于室温和４℃；反应时间定为２ｈ反应溶液ｐＨ值升高，ＳＰＧ的结合力亦增强。在同等条件下与酶标记ＳＰＡ进行比较，结果表明ＳＰＧ对小鼠单克隆抗体、羊抗人、兔抗ＩＦＮ－γ和驴抗兔Ｉｇｇ以及牛、大鼠和人ＩｇＧ的结合力均明显高于ＳＰＡ。ＳＰＧ用于大鼠血清抗ＩＦＮ－γ抗体的检测，其阳性率和抗体滴度均大大高于ＳＰＡ。因此，ＳＰＧ作为一种广谱的、高亲和力的ＩｇＧ结合物，是应用于ＥＬＩＳＡ的理想的替代二抗。     

金属螯合亲和层析法纯化人源抗TNF-α重链可变区蛋白

近年采用基因工程技术进行抗体基因的筛选、改造,获得了大量有用的抗体基因,但如何使之适当地表达和分泌,并获得有效的纯化已成为一个急待解决的问题。就目前研究的进展来看,抗体的表达和分泌不只局限于淋巴细胞和骨髓瘤细 胞,在酵母、哺乳动物的非淋巴细胞和大肠杆菌乃至植物细胞中,都能获得抗体的功能性表达、分泌和组装[1-5]。大肠杆菌具有经济、简便和容易操作等特点,将其表达的抗体片段进行有效地纯化,是得到有实用价值制品的重要环节。本文使用表达质粒pQE30,对已获得的人源抗TNFα抗体基因片段进行了高效表达,并用Ni-NTA金属螯合法对表达的抗体片段进行了纯化。     

人MAdCAM-1胞外区基因在原核系统的表达及重组蛋白纯化

目的：制备高纯度的重组人MAdCAM-1蛋白。方法 采用PCR技术从pUC21/hMadCAM-1质粒上,选择性扩增编码成熟MAdCAM-1胞外区两个Ig域的基因片段。将其克隆至pQE30载中,转化大肠杆菌后,以IPTG诱导表达,产物经Ni-NTA亲和层析纯化。结果：诱导表达出相对分子质量（Mt)约29000的融合蛋白。薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的50％左右。经亲和层析纯化得到高纯度的蛋白产品。结论 获得了重组人MAdCAM-1胞外区蛋白,为后续功能研究及其单抗研制奠定了基础。     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0873的表达纯化及保守性分析

目的 通过构建原核表达载体,获得纯化的肺炎链球菌S.pn重组假想蛋白SPD0873,并制备多克隆抗体,进一步分析其在常见S.pn菌株中的保守性.方法 分离培养D39型肺炎链球菌,获取其基因组DNA.利用PCR方法扩增去除信号肽的spd0873序列,采用基因体外重组法将spd0873序列克隆到原核表达载体pET-32(a)内,测序鉴定.将重组质粒转化到E.coli Rossetta(DE3)中,经IPTG诱导大量表达融合6个组氨酸标签的SPD0873重组蛋白,经Ni-NTA树脂纯化后,获得的重组蛋白用SDS-PAGE和Western 印迹鉴定;将鉴定后纯化的蛋白免疫BALB/C小鼠制备多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western 印迹方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在5种常见肺炎链球菌分离株的保守性.结果 克隆的spd0873序列与GenBank中的数据相符,并实现了SPD0873蛋白高水平的可溶表达.纯化蛋白免疫BALB/C小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western 印迹验证SPD0873蛋白在5株常见肺炎链球菌菌株中均有表达.结论 成功制备了高滴度、高特异性的SPD0873蛋白多克隆抗体,同时,检测到SPD0873蛋白在5种常见的肺炎链球菌菌株中非常保守,为研究该蛋白的生物学功能及肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础.     

A蛋白亲和层析法纯化动物血清抗体的效果比较

比较ＨｉｔｒａｐＰｒｏｔｅｉｎ－ＡＳｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析系统,对不同动物血清或抗血清的纯化效率,提供抗体纯化提供依据。结果显示该方法简便快速,纯化的抗体纯度高,并能较好地保持免疫学活性。层析柱反复使用４０多次,纯化效率不变。但Ｐｒｏｔｅｉｎ－Ａ对不同动物血清的ＩｇＧ吸附能力不同。提示,应根据动物品种,选择合适的纯化方法。     

肺炎链球菌假想蛋白SPD0414的表达纯化及保守性分析

目的:获得纯化的肺炎链球菌(S.pn)重组假想蛋白SPD0414,并分析其在常见S.pn菌株中的保守性。方法:利用PCR方法扩增SPD0414蛋白胞外区核酸序列,将其克隆到原核表达载体ppSUMO内,转化到E.coliBL21(DE3)中,经IPTG诱导表达后Ni-NTA树脂纯化重组蛋白。用SDS-PAGE和Western blot鉴定蛋白特异性及纯度。通过纯化蛋白免疫BALB/c小鼠制备其多克隆抗体,并用间接ELISA检测多克隆抗体的效价,Western blot方法分析多克隆抗体的特异性,同时,鉴定该蛋白在6种常见肺炎链球菌分离株的保守性。结果:克隆的SPD0414序列与Gene Bank中的数据相符,并实现了重组SPD0414蛋白高水平的可溶表达纯化蛋白免疫BALB/c小鼠获得高滴度、高特异性的的多克隆抗体,Western blot验证SPD0414蛋白在6株常见肺炎链球菌菌株中均有表达。结论:成功制备了高滴度、高特异性的SPD0414多克隆抗体,证实了SPD0414在肺炎链球菌不同菌株间保守性较高,为肺炎链球菌多肽联合疫苗的研制奠定了基础。     

人源化抗人纤维蛋白单链抗体—链亲和素融合蛋白？…

目的 探索人源化抗人纤维蛋白单链抗体－链亲和素融合蛋白的表达和功能。方法 构建人源化抗人纤维蛋白单链抗体（ＳｃＦｖ－８Ｅ５）基因与链亲和素基因的重组表达载体，制备融合蛋白，ＥＬＩＳＡ观察其稳定性、与人及不同动物纤维蛋白的反应。结果 人源化融合蛋白可特异性识别人、大鼠、豚鼠纤维蛋白，同时有生物素的结合位点，且稳定性好，可耐受至少两周４℃保存，数次反复冻融或一定时间的３７℃孵育。结论 此人源化融合蛋白     

新和层析纯化精子膜抗原的方法及精子抗体的检测

采用超声波粉碎、NP－40提取与两种互补式免疫亲和层析柱相结合的新提纯方案。结果获得了高纯度精子膜抗原,对经两种市售试剂盒检测的阳性标本36份、阴性标本24份进行检测,结果一致,正常人血清标本A值≤0．08。初步临床应用显示不孕症患者中,血清阳性率23．52％,精浆阳性率7．57％,与郑州华美公司试剂盒的阳性符合率达100％。     

抗人纤维蛋白单链抗体的人源化

目的：人源化抗人纤维蛋白单莲抗体,降低人抗鼠抗体反应。方法：从人免疫球蛋白基因数据库中挑选到与鼠源抗人纤维蛋白单链抗体ｓｃＦｖ－８Ｅ５重链（ＶＨ－８Ｅ５）同源性最高的序列,作为人源化改造的框架,其中植入ｓｃＦｖ－８Ｅ５的互补决定区。人工合成其ＤＮＡ连接酶连接成完整的人源化ＶＨ－８Ｅ５和ＶＬ－８Ｅ５,构建表达载体,转化ＪＭ１０９后用ＩＰＴＧ诱导表达,ＥＬＩＳＡ测定其抗原结合活性。结果：表达产物分子量     

人源化单链抗体与白细胞介素2融合蛋白靶向治疗肿瘤的实验研究

目的评价人源化抗Her2/neu单链抗体及人白细胞介素2(hIL-2)双功能融合蛋白H520C9scFv-hIL-2治疗Her2/neu阳性肿瘤的效果。方法将构建的表达载体转染293细胞,G418筛选阳性克隆建立稳定表达细胞系。免疫印迹法(Western blotting)、酶联免疫吸附试验(ELISA)及[3H]脱氧胸苷(3H-TdR)渗入法检测融合蛋白浓度和生物学活性。建立荷瘤小鼠肿瘤模型,静脉给药,观测肿瘤体积变化判断治疗效果。结果细胞培养上清中融合蛋白浓度达(1.2±0.23)mmol/L,5μl上清即可在46000处见到清晰蛋白条带。纯化后的融合蛋白两个功能单位活性良好,在荷瘤小鼠肿瘤模型治疗实验中显示了明确的治疗效果。结论哺乳动物细胞可高效表达生物活性良好的融合蛋白H520C9scFv-hIL-2,该蛋白在体内实验中有明显的抑瘤作用,显示了较好的应用前景。     

基因工程抗体研究进展

王琰,男,５４岁,教授,解放军海军总医院中心实验科主任,北京医科大学临床肿瘤学院及基础医学院免疫学系兼职教授,第三军医大学兼职教授,主要从事抗体工程研究。抗体是机体内最复杂的分子,以其特有的基因结构和重组形成了巨大的多样性,可结合任何一种抗原,不仅为...     

兔抗人硒蛋白P抗体的制备与鉴定

目的 :以原核表达的人硒蛋白P片段 (HSelP)制备其兔多克隆抗体并进行鉴定。方法 :在E .coli中诱导表达HSelP片段 ,经DEAEfastflow和Ni NTA Agarose柱层析纯化后 ,以其为免疫原制备兔抗HSelP抗体 ,并以Westernblot鉴定抗体的特异性。结果 :成功地表达并纯化了HSelP ,制备的兔抗HSelP抗体可有效地检测天然的SelP。结论 :以原核表达并纯化的HSelP为免疫原 ,成功地制备了兔抗该蛋白的抗体 ,Westernblot鉴定特异性良好。为进一步研究硒蛋白P的功能、分布及建立较简便的检测方法打下了基础     

兔抗人ERA多克隆抗体的纯化

目的纯化兔抗人ERA的多克隆抗体。方法在大肠杆菌中,表达重组MBP-hEra融合蛋白。表达产物先继以直链淀粉树脂亲和柱和Superose12凝胶柱过滤纯化。将纯化的MBP-hEra偶联于NHS-activatedSepharoseTM上,制备亲和层析柱,纯化兔抗人ERA多克隆抗体。结果①表达、纯化的MBP-hEra,相对分子质量(Mr)为78×103,其纯度为95％。②从抗血清中纯化获得可与MBP-hEra特异性结合的兔抗hEra多克隆抗体。结论获得了特异性较好的纯化兔抗hEra多克隆抗体。     

抗bFGF人源性抗体的瞬时表达、纯化及鉴定

目的:将一株人源性中和性抗bFGF单链抗体基因转入真核表达载体,进行真核瞬时表达,通过细胞试验进一步验证其中和活性。方法:将1AscFv抗体基因克隆到真核表达载体pIgG中(编码全长人源性IgG1类抗体),T4连接酶连接后,转化大肠杆菌DH5α,挑取4个克隆,经测序其中有一株含有正确的scFv序列,命名为pIgG-1A2,将pIgG-1A2转染真核细胞HEK293T进行瞬时表达,表达产物经蛋白G纯化后,SDS-PAGE检测纯化抗体的纯度;ELISA和Western blot检测抗体的特异性;MTT法检测纯化抗体对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)和人神经胶质瘤细胞株U87MG增殖的影响。结果:经酶切鉴定和测序发现pIgG-1A2含有正确的抗体轻重链基因,经293T细胞瞬时表达,表达产物经蛋白G亲和层析柱纯化后经SDS-PAGE鉴定,获得纯度为95%的电泳纯抗体,产量可以达到每升细胞培养上清10mg,交叉反应显示表达的抗体特异性针对bFGF,体外实验证实1A2能够抑制bFGF诱导的人脐静脉血管内皮细胞的增殖,同时还能抑制神经胶质瘤细胞株U87MG的增殖。结论:通过真核细胞成功地表达了抗bFGF人源性抗体,纯化后获得了高纯度的抗体,对HUVEC和神经胶质瘤细胞株U87MG具有抑制作用,为抗bFGF人源性抗体抗肿瘤研究奠定基础。     

人源抗体研制及应用进展

单克隆抗体(mAb)技术问世已25年,但由于人mAb制备的困难和鼠mAb的异源性,使mAb在人体内治疗方面的应用进展缓慢.近来由于人源化mAb研制的进展及突破,治疗用抗体的开发呈现了强烈的上升势头,在生物高技术领域中成为一个热点.目前mAb市场正以20%速度递增,预计2002年达11亿美元,占重组药物的9%.10年后市场上的治疗性mAb将从现在的几个增加到100个以上,预计销售额超过500亿美元.我国人源治疗性抗体的研制开发尚处于起步阶段,应当有所加强.