实时荧光定量PCR检测PML-RARα融合基因的临床应用研究

目的 利用PML-RARα融合基因作为标志物,应用实时荧光定量PCR技术,监测急性早幼粒细胞白血病(APL)微小残留病(minimal residual disease,MRD)患者体内病毒的状态,探讨预测APL复发风险的方法.方法 利用本实验室建立的定量检测APL患者PML-RARα融合基因的方法,对25例处于初诊、完全缓解(complete remission,CR)、复发等不同阶段的APL患者进行了PML-RARα融合基因的定量检测,并对其中6例患者的MRD状态进行了动态监测.结果 应用荧光定量PCR技术分析患者初诊、CR和复发状态的PML-RARα基因对数值(lg)水平,结果 显示有统计学意义(x2=6.847,P＜0.05);随访期患者的PML-RARα对数值(lg)水平变化较大:初诊时较高(-0.61±0.79),CR时下降(-1.31±0.62),复发时又出现上升(-0.57±0.44),提示若该患者在CR时的对数值呈现上升趋势,患者复发的机率大.结论 应用实时荧光定量(RQ)-PCR技术定量检测PML-RARα融合基因,对监测APL患者MRD状态具有临床适用性,随访期的MRD动态追踪监测具有预后价值.     

高三尖杉酯碱联合全反式维甲酸治疗急性早幼粒细胞白血病的临床研究

目的 观察高三尖杉酯碱(HHT)联合全反式维甲酸(ATRA)治疗初诊急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的疗效及诱导治疗期间的不良事件发生情况,并与柔红霉素(DNR)联合ATRA治疗方案进行对比分析.方法 对2004年10月至2010年10月收治的115例APL患者的资料进行总结分析,其中HHT组54例、DNR组61例,对比分析两组患者的完全缓解(CR)率、总生存(0S)及无事件生存(EFS)情况.结果 115例APL患者CR率100％,达CR的中位时间32(22～43)d,109例进入巩固治疗的患者PML-RARα融合基因全部转为阴性,中位生存期未达(0.23～77.34个月),中位EFS期未达(0.23 ～ 77.34个月).3年OS率93％,5年OS率93％;3年EFS率85％,5年EFS率75％.诱导治疗后HHT组和DNR组PML-RARα融合基因转阴率分别为31.3％和15.5％;巩固治疗1个疗程后两组PML-RARα融合基因转阴率分别为68.6％和77.6％;DNR组有4例患者在巩固治疗＞1个疗程后转为阴性,但两组分子生物学复发率差异无统计学意义(9.8％和8.6％,P＞0.05).生存分析显示:HHT组与DNR组的OS、EFS相似(P值分别为0.206、0.506).两组5年OS率分别为87％和98％;5年EFS率分别为80％和71％.HHT组与DNR组的低/中危患者、高危患者OS、EFS亦相似(P值均＞0.05).诱导治疗期间HHT组合并2级以上发热患者比例显著低于DNR组,而肝、肾、心功能损伤及血液学不良反应发生率两组相似.结论 HHT和DNR为基础的方案治疗初诊APL疗效相似,同时在诱导治疗期间两者的耐受性无明显差异.     

急性早幼粒细胞白血病FLT3-ITD突变分析

目的:研究FLT3-ITD突变对于急性早幼粒细胞白血病(APL)远期疗效的影响。方法:回顾性分析2002年1月至2010年12月本中心初诊170例APL患者的临床和预后特点。结果:170例初诊APL患者中,24例存在FLT3-ITD突变,阳性率14.1%,其中3例合并FLT3-TKD突变。FLT3-ITD+组患者发病时白细胞计数显著高于阴性组,高危组FLT3-ITD突变发生率最高。FLT3-ITD+组与阴性组的诱导死亡率分别为12.5%和2.9%(P=0.031),其诱导完全缓解(CR)率分别为83.3%和97.1%(P=0.004)。FLT3-ITD+组5年总生存率(OS)为87.5±6.8%,阴性组为90.6±2.6%(P=0.740),5年无病生存率(DFS)两组分别为82.8±9.1%和83.6±3.4%(P=0.928)。结论:FLT3-ITD突变与APL高白细胞数相关。伴FLT3-ITD突变APL诱导治疗死亡率高,CR率低,但FLT3-ITD突变对于APL长期DFS及OS无显著影响。     

FLT3基因突变与急性早幼粒细胞白血病的关系及临床意义

目的 研究FLT3基因内部串联重复(ITD)突变及第二酪氨酸激酶结构域(TKD)点突变在急性早幼粒细胞白血病(APL)患者中的发生情况及其临床意义.方法 采集160例初治APL患者骨髓并分离单个核细胞,采用基因组DNA-PCR方法检测所有患者FLT3基因外显子14、15中ITD突变,阳性标本进一步计算ITD等位基因比例(ITD-AR).采用基因组DNA-PCR结合限制性内切酶酶切方法检测FLT3基因外显子20中TKD点突变.结果 160例初治APL患者中,30例(18.75%)FLT3-ITD突变阳性,17例(10.62%)FLT3-TKD点突变阳性,2例同时存在两种突变.FLT3-ITD+组及FLT3-TKD+组患者初诊时白细胞计数(WBC)均显著高于野生型FLT3(FLT3-wt)组,S型PML-RARα融合基因在两种突变组中所占比例亦均高于FLT3-wt组(P<0.05).FLT3-ITD+组息者中维甲酸综合征(RAS)、DIC发生率分别为41.7%、65.4%,高于FLT3-wt患者(P<0.05),而完全缓解(CR)率较FLT3-wt患者低(69.2%对90.3%,P<0.05);FLT3-TKD+患者RAS、DIC发生率及CR率同FLT3-wt患者相比差异均无统计学意义(P值均>0.05).中位随访时间为26个月,FLT3-ITD+患者总体生存(OS)期显著短于FLT3-wt患者(P<0.05)、无病生存(DFS)期与FLT3-wt患者相比差异无统计学意义(P>0.05);而FLT3-TKD+患者与FLT3-wt患者相比,OS、DFS期差异均无统计学意义(P值均>0.05).30例FLT3-ITD+患者ITD-AR中位值1.0(0.11～6.55),ITD-AR值大于1.0与小于1.0的患者相比,在初诊WBC、RAS、DIC发生率及CR率等方面差异均无统计学意义(P值均>0.05).结论 FLT3基因突变(包括FLT3-ITD及FLT3-TKD突变)是APL患者中常见的突变,两种突变类型都同患者初诊时高WBC及S型PML-RARα融合基因相关.FLTB-ITD突变较FLT3-TKD点突变发生率高,提示预后不良,而FL33-TKD点突变对预后的影响不明显.     

急性髓系白血病患者131例免疫表型与预后的相关性分析

目的 探讨急性髓系白血病(AML)免疫表型与预后的相关性.方法 采用多色流式细胞术对131例AML患者进行检测,分析其免疫表型与患者年龄、初诊时WBC、PLT和Hb的关系,及其对完全缓解率(CR)的影响.结果 AML患者中髓系抗原表达阳性率最高的是CD13、CD33和髓过氧化物酶(MPO),急性早幼粒细胞白血病(M3)亚型中CD34和HLA-DR表达率较低,淋巴细胞抗原CD19和CD7表达最常见,阳性率分别为15.4%和14.6%.CD7阳性组患者的年龄明显高于阴性组患者年龄(t=-2.27,P＜0.05),CD14阳性组患者的初诊WBC计数明显高于阴性组(Z=-2.284,P＜0.05).131例AML患者的总CR率为56.5%,CD34阳性组(82例)的CR率为45.1%,CD34阴性组(49例)的CR率为75.6%,两组间差异有统计学意义(x2=11.524,P＜0.05).CD34和HLA-DR双阳性组(74例)的CR率为41.9%,单阳性组(38例)CR率为78.9%,双阴性组(19例)CR率为68.4%,3组问差异有统计学意义(Z=-3.492,P＜0.01).CD7、CD19、CD13、CD33、CD38、CD15、CD64、CD14及MPO等抗原表达阳性组和阴性组间CR率的差异无统计学意义(P均＞0.05).多因素回归分析显示,患者年龄大于60岁、初诊时WBC大于50×109/L、PLT大于30×109/L、Hb小于60 g/L以及CD34阳性是低CR率的独立风险因素.结论 AML患者年龄,初诊时WBC、PLT和Hb计数以及CD34表达与CR率有关,免疫表型的检测对于判断AML预后有一定价值,有助于指导临床治疗和判断预后.     

骨髓单个核细胞Coombs试验(+)血细胞减少症患者Th17细胞数量及功能研究

目的 研究骨髓单个核细胞(BMMNC)-Coombs试验(+)血细胞减少症(又称免疫相关性血细胞减少症,IRP)患者骨髓Th17细胞数量及功能,探讨Th17细胞在IRP发病中的作用.方法 选取初诊IRP患者43例、血常规恢复正常IRP患者34例及正常对照13名.采用流式细胞术(FCM)检测骨髓白细胞介素(IL)-23受体(IL-23R)+CD4+/CD4+细胞比例;酶联免疫吸附(ELISA)法测定骨髓上清液IL-6、IL-23和IL-17水平;RT-PCR技术检测BMMNC视黄酸相关孤核受体γt(RORγt)及信号转导转录激活子3(STAT3)mRNA的相对表达水平.结果 IRP初诊组IL-23R+CD4+/CD4+细胞比例[(3.6±3.1)%]明显高于恢复组[(2.0±1.0)%]和正常对照组[(1.9±1.4)%](P值均＜0.05);初诊组骨髓上清液IL-6、IL-23和IL-17水平[分别为(26.21±14.55)、(2.23±0.99)和(2.54±1.33)μg/L]明显高于恢复组[分别为(9.08±6.36)、(0.91±0.76)和(1.28±0.18)μg/L]和正常对照组[分别为(14.63±7.66)、(1.19±0.98)和(1.50±0.28)μg/L](P值均＜0.05);初诊组RORγtmRNA、STAT3mRNA表达水平(0.25±0.08、1.10±0.16)明显高于恢复组(0.12±0.08、0.97±0.12)和正常对照组(0.07±0.05、0.95±0.13)(P值均＜0.05).IRP组IL-23R+CD4+/CD4+细胞比例与CD5+CD19+/CD19+细胞比例呈正相关(P＜0.05);IRP组骨髓液IL-17水平与骨髓CD5+CD19+/CD19+细胞比例、自身抗体数量呈正相关(r分别为0.494、0.377,P值均＜0.05);IRP组RORγt mRNA表达水平与骨髓CD5+CD19+/CD19+细胞比例及自身抗体数量呈正相关(r分别为0.741、0.541,P值均＜0.05);IL-23R+CD4+/CD4+细胞比例与骨髓上清液IL-17水平及STAT3 mRNA表达水平呈正相关(r分别为0.438、0.448,P值均＜0.05).结论 Th17细胞在IRP患者中数量增加,功能活跃;Th17细胞有望成为该类疾病干预治疗的新靶点.     

组蛋白去甲基化酶赖氨酸特异性去甲基化酶1在急性白血病的表达及其临床意义

本研究探讨组蛋白去甲基化酶赖氨酸特异性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1,LSD1)在急性白血病的表达及其临床意义。采用Western blot方法半定量检测LSD1在HL-60和SHI-1白血病细胞株、不同病情(初诊、完全缓解、复发)急性白血病(acute leukemia,AL)患者及非恶性血液病对照者骨髓单个核细胞的表达水平。随访收集AL患者的临床资料,分析LSD1表达与临床预后的关系。结果表明,HL-60细胞和SHI-1细胞LSD1均呈阳性高表达,LSD1相对含量(LSD1/β-actin灰度比)分别为4.647±3.840和1.628±0.185(n=4);72例AL患者LSD1表达程度差异较大,阳性率为56.9%(41/72),LSD1相对含量平均为1.053±1.976;17例非恶性血液病对照组LSD1阳性率为0%,LSD1相对含量为0.004±0.012。LSD1阳性率在急性髓系白血病(AML)或急性淋巴细胞白血病(ALL)患者初诊组(90.4%,77.8%)与难治/复发组(100%,100%)均高于完全缓解(CR)组(4.7%,0%)(p=0.000);LSD1相对含量在AML与ALL患者初诊组之间(1.177±1.646,1.275±1.845)、难治/复发组之间(2.050±2.470,4.107±3.676)或CR组之间(0.029±0.033,0.019±0.024)差异无统计学意义(p>0.05);AL患者LSD1阳性率在初诊组(84.6%)与难治/复发组(100%)均高于CR组(3.8%),LSD1相对含量在初诊组(1.274±1.760)、难治/复发组(3.359±3.319)及CR组(0.027±0.031)均高于对照组(p<0.01),其中难治/复发组高于初诊组与CR组(p<0.01),初诊组高于CR组(p<0.01)。结论:LSD1过高表达与AL难治/复发有关,其表达水平能反映AL患者的病情,可成为对AL预后有提示作用的生物学标志。     

慢性鼻窦炎患者鼻黏膜组织GATA结合蛋白-3表达及与炎性因子水平的关系

目的探讨转录因子GATA结合蛋白-3(GATA binding protein-3,GATA-3)在慢性鼻窦炎患者鼻黏膜中的表达及与白细胞介素(interleukin,IL)-5、IL-6、IL-8的关系。方法慢性鼻窦炎患者41例为观察组,同期行鼻内镜修补手术脑脊液鼻漏患者23例为对照组,采用免疫组织化学法检测2组鼻黏膜组织GATA-3蛋白阳性表达,实时荧光定量PCR法检测鼻黏膜组织GATA-3mRNA相对表达量,ELISA法检测血清IL-5、IL-6、IL-8水平;Pearson相关法分析2组鼻黏膜组织GATA-3蛋白阳性表达与血清IL-5、IL-6、IL-8的相关性。结果观察组鼻黏膜组织GATA-3蛋白阳性表达率(87.80%)、GATA-3mRNA相对表达量(0.60±0.12)及血清IL-5[(78.28±44.22)ng/L]、IL-6[(42.51±5.42)ng/L]、IL-8[(77.15±43.63)ng/L]水平均高于对照组[26.09%、0.13±0.11、(35.73±32.18)ng/L、(18.32±2.51)ng/L、(28.24±31.27)ng/L](P0.05);观察组和对照组鼻黏膜组织GATA-3蛋白阳性表达与血清IL-5(r=0.761,P=0.002;r=0.814,P=0.001)呈正相关,与IL-6(r=0.021,P=0.518;r=0.019,P=0.594)、IL-8(r=0.061,P=0.411;r=0.072,P=0.395)无线性相关。结论慢性鼻窦炎患者鼻黏膜组织GATA-3表达上调,且与血清IL-5水平呈正相关,二者共同促进病情进展。     

机采血小板储存过程中5种miRNA前体的表达变化

目的分析机采血小板储存过程中表达量有明显升高的5个miRNA前体(pre-miRNA)表达谱,为研究机采血小板中miRNA的成熟及调节机制提供参考。方法分别提取不同储存时间(1、3、5 d)各2 m L机采血小板总RNA,以5S rRNA为内参照,采用实时荧光定量(qRT-PCR)法分别检测5个miRNA前体pre-miR-16、-96、-150、-155和-316的表达水平。结果以新鲜机采血小板0 d pre-miRNA表达水平为基准,pre-miR-16的相对表达量在1、3、5 d分别为0.98±0.08、0.96±0.11、0.92±0.14;pre-miR-96的相对表达量在1、3、5 d分别为0.97±0.08、0.98±0.09、0.94±0.12;pre-miR-150的相对表达量在1、3、5 d分别为0.95±0.09、0.91±0.06、0.93±0.15;pre-miR-155的相对表达量在1、3、5 d分别为0.97±0.12、0.95±0.08、0.95±0.10;pre-miR-326的相对表达量在1、3、5 d分别为0.98±0.08、0.96±0.12、0.86±0.18。相对于新鲜血小板,上述5种pre-miRNA在储存过程中表达量无明显改变(P0.05)。结论机采血小板储存过程中表达量明显升高的5个miRNA的pre-miRNA表达相对稳定,并未伴随miRNA表达改变而改变。     

急性早幼粒细胞白血病PML-RARα融合基因实时定量RT-PCR标化法和常规法计算的比较

目的 改进实时定量RT-PCR的检测计算方法,提高定量RT-PCR在急性早幼粒细胞白血病(APL)微量残留病变监测的临床应用价值.方法 采用实时定量RT-PCR和常规定性RT-PCR检测31例APL患者在治疗前后融合基因PML-RARα的表达水平,对两种计算方法进行比较:常规按照患者治疗前后自身比较计算(常规法)和治疗前标准化基线水平计算(标化法).结果31例患者采用两种定量计算方法结果近似,标化法计算结果示患者在治疗缓解、巩固治疗和维持治疗期间融合基因PML-RARα转录本对数下降值分别为(2.0±1.9)、(4.9±1.4)和(5.7±0.1),常规法计算结果为(1.9±1.9)、(4.8±1.3)和(5.7±0.4).在维持治疗阶段标化法定量RT-PCR的结果显示患者个体差异更小.按照标化法计算结果,次要分子生物反应(对数值≥3)和主要分子生物反应(对数值≥5)标准仍然适用.结论 采用标化法计算实时定量RT-PCR结果能较好的对APL患者的微量残留病变进行监测,一定程度上降低了患者个体差异对检测结果的影响,同时适用于治疗前标本缺如的患者.     

伴rob(13;21)t(15;17)(q22;q21)急性早幼粒细胞白血病一例报告并文献复习

目的 报道1例初发伴有rob(13;21) t(15;17)(q22;q21)的急性早幼粒细胞白血病(APL)并探讨其临床和实验室特点.方法 在常规核型分析和骨髓细胞形态学的基础上,应用双色双融合荧光原位杂交(DCDF-FISH)和RT-PCR技术进一步检测该患者的细胞遗传学异常和分子生物学异常.并结合文献分析此类伴少见变异易位APL患者的临床特点.结果 患者的临床表现和骨髓细胞形态学检查均符合APL.初诊时免疫表型分析髓系标志呈阳性,R显带染色体分析显示患者核型为45,XX,rob(13;21)t(15; 17) (q22;q21) [6]/45,XX,rob(13;21)[14],FISH结果显示68.9％的细胞为典型的t(15;17)模式,RT-PCR结果显示PML-RARα融合基因水平为25.8％.经诱导化疗、巩固治疗后,达到完全缓解,核型为45,XX,rob(13;21) [20],FISH检测PML-RARα融合基因阳性细胞率为2.5％,PML-RARα融合基因水平为0.003％.结论 伴特征性的rob(13;21)t(15;17)(q22;q21)的APL十分罕见,患者临床表现和实验室检查基本符合APL的临床特点;该染色体异常对APL患者的预后判断价值仍需进一步的观察.     

miR-181a在急性淋巴细胞白血病患儿中的表达及其功能研究

目的 检测microRNA-181a(miR-181a)在急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿中的表达水平,并研究其在ALL细胞株CCRF-CEM细胞及耐药株CEM-C1细胞中的功能.方法 采用实时荧光定量PCR方法检测ALL患儿骨髓样本、ALL细胞株CCRF-CEM细胞及其耐药株CEM-C1细胞中miR-181a的表达水平.采用电穿孔转染的方法抑制耐药株CEM-C1细胞并上调非耐药株CCRF-CEM细胞中miR-181a的表达,予不同浓度梯度(终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100、1 000 ng/ml)喜树碱处理后,采用CCK-8法观察各浓度梯度喜树碱处理后细胞的存活情况,绘制细胞增殖抑制曲线并计算半数抑制浓度(IC50).结果 初诊-复发组患儿初诊及复发骨髓样本miR-181a相对表达水平(4.84±2.71及6.53±2.20)均高于对照组(1.41±0.53)(P=0.017、0.001),初诊-完全缓解组患儿初诊骨髓样本miR-181a水平(7.58±2.50)较对照组明显升高(P=0.000),而完全缓解后miR-181a水平下降至1.35±0.35,与对照组比较差异无统计学意义(P=0.863).CEM-C1细胞miR-181a相对表达水平(-4.39±0.08)较CCRF-CEM细胞(-2.32±0.03)明显升高(P=0.000).转染miR-181a抑制剂CEM-C1细胞较转染阴性对照组增殖抑制率明显升高(P＜0.05),IC50分别为30.61、2 255.00 ng/ml,耐药指数(RI) =73.67.miR-181a过表达CCRF-CEM细胞较阴性对照组增殖抑制率明显降低(P＜0.05),IC50分别为126.60、1.34 ng/ml,RI=94.26.结论 ALL患儿骨髓及CEM-C1细胞中miR-181a异常高表达,抑制CEM-C1细胞中miR-181a的表达可明显增加CEM-C1细胞的药物敏感性,在CCRF-CEM细胞中上凋miR-181a的表达能明显增加CCRF-CEM细胞的耐药性.     

右美托咪啶对重症脓毒症患者炎性因子和凋亡因子及自噬相关蛋白的影响

目的探讨右美托咪啶对重症脓毒症患者肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素(interleukin, IL)-1β、IL-6,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、自噬蛋白5(autophagy protein 5, Atg5),自噬基因Beclin-1、caspase-3、caspase-8、核因子-κB(nuclear factor-kappa B, NF-κB)表达的影响。方法重症脓毒症患者176例,随机分为脓毒症组和右美托咪啶组各88例,同期住院非脓毒症患者88例为对照组。右美托咪啶组在进入ICU 10 min内给予负荷剂量右美托咪啶1μg/kg,之后0.2～2.5μg/(kg·h)静脉泵注;脓毒症组未应用镇静剂或止痛剂;对照组不应用任何药物。入ICU后24 h采集静脉血,采用实时荧光定量PCR法检测3组TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA相对表达量;采用Western blot法检测LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin-1蛋白表达;采用ELISA法检测caspase-3、caspase-8及NF-κB水平。结果脓毒症组、右美托咪啶组、对照组TNF-αmRNA相对表达量(2.57±0.13、1.12±0.09、0.84±0.06)、IL-1βmRNA相对表达量(3.78±0.26、1.53±0.15、1.25±0.17)和IL-6 mRNA相对表达量(4.38±0.37、2.05±0.26、1.86±0.22)依次降低(P0.05);脓毒症组、右美托咪啶组、对照组LC3-Ⅱ蛋白相对表达量(0.37±0.05、0.96±0.13、1.13±0.18)、Atg5蛋白相对表达量(1.08±0.12、3.09±0.33、3.46±0.37)和Beclin-1蛋白相对表达量(0.87±0.11、2.03±0.25、2.58±0.26)依次增高(P0.05);脓毒症组、右美托咪啶组、对照组caspase-3(3.24±0.25、1.56±0.17、1.13±0.11)、caspase-8(3.08±0.32、1.26±0.12、0.95±0.13)和NF-κB(2.37±0.25、1.14±0.11、0.64±0.12)水平依次降低(P0.05)。结论右美托咪啶可抑制重症脓毒症患者血清炎性因子表达,增加自噬因子表达,降低凋亡因子和NF-κB表达,可能有益于重症脓毒症的治疗。     

急性髓系白血病患者骨髓中WT1的表达及其对预后的影响

目的:探讨急性髓系白血病(AML)患者骨髓中WT1的表达及其与疗效和预后的相关性。方法:采用实时荧光定量PCR检测75例初诊AML患者(非APL)治疗各阶段骨髓WT1的拷贝数和内参因子(GADPH)的拷贝数,以NQ比值=WT1基因拷贝数/内参基因拷贝数计算WT1的表达水平,并对临床特征、诱导化疗后完全缓解(CR)率、2年总生存率(OS)及无事件生存率(EFS)进行了分析。结果:治疗前WT1的表达水平与年龄、性别、基因突变、FAB分型及预后分组等无明显相关性。治疗前WT1高表达患者的CR率为65.4%(17/26),低表达患者的CR率为93.9%(46/49),两组比较差异有统计学意义(χ~2=8.25,P=0.004);两组患者2年总生存与无事件生存率的差异均有统计学意义(P0.05),高表达组OS及EFS率均低于低表达组;诱导化疗后约1个月、3个月及6个月时,WT1水平较初治时下降1个数量级以上的患者组,其两年总生存明显升高(P0.05)。结论:骨髓WT1的表达水平可作为AML患者(非APL)疗效及预后评估的有效指标。     

儿童急性髓系白血病细胞遗传学改变与预后分析

目的 探讨儿童急性髓系白血病(AML)细胞遗传学改变与预后的关系.方法 根据细胞遗传学表现将128例初诊AML患儿分为4组:伴t(15;17)改变患儿为急性早幼粒细胞白血病(APL)组;伴t(8;21)/inv(16)(p13;q22)改变患儿为A组;正常核型及无其他组细胞遗传学改变患儿为B组;伴t(9;22)(q34;q11)或-7或复杂核型细胞遗传学改变患儿为C组.对各组患儿进行预后分析.结果 128例AML患儿4年无事件生存率为(55.9±4.7)%,4年总生存率为(69.3±4.5)%;非APL患儿4年无事件生存率及总生存率分别为(49.9±5.2)%、(57.1±6.0)%.APL组、A组、B组及C组患儿的4年无事件生存率分别为(72.2±1.1)%、(66.3 4-7.7)%、(38.5±9.1)%、(20.1±12.3)%,差异均有统计学意义(P值均为0.000);4年总生存率分别为(92.6±5.1)%、(69.4±7.9)%、(55.6±8.6)%、(30.0±12.3)%,差异均具有统计学意义(P值均为0.000).结论 细胞遗传学改变可作为儿童AML的独立预后因素,用于判断预后及疾病危险度分组,对AML患儿进行个体化治疗.     

实时荧光定量PCR法检测MTX对映体耐药A549细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达

目的 建立实时荧光定量PCR检测肿瘤细胞中FPGS mRNA表达的方法,研究MTX对映体[L-(+)-MTX和D-(-)-MTX]耐药细胞株中FPGS的基因表达差异,并用于观察白血病患者MTX治疗耐药前后FPGS mRNA表达水平的变化.方法 用SYBR Green Ⅰ为荧光染料,以β-actin作参照,建立检测FPGS mRNA的实时荧光定量PCR方法.根据Ct值、标准曲线相关系数、斜率、重复性曲线、熔解曲线、扩增效率曲线等进行方法学评价.并用该方法检测MTX对映体耐药细胞株及应用MTX耐药的14例白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA的表达.结果 建立的标准曲线Ct值与模板浓度有良好的线性关系,FPGS和β-actin标准曲线相关系数分别为0.996 8和0.998 7,斜率分别为-3.595和-3.740,批内CV为1.27%～2.95%,批间CV为3.82%;熔解曲线均呈单个特异峰,扩增效率相似(斜率为0.021 7);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞中FPGS mRNA相对含量分别为(3.51±0.66)和(0.16±0.01),A549亲本细胞(S)中FPGS mRNA相对含量为(1.00±0.31),差异有统计学意义(F=64.45,P＜0.01);L-(+)-MTX耐药细胞和D-(-)-MTX耐药细胞间FPGS mRNA相对含量差异有统计学意义(q=9.29,P＜0.01).白血病患者应用MTX治疗耐药后,FPGS mRNA表达水平为(0.35±0.04),用药前为(1.00±0.44),差异有统计学意义(t=8.83,P＜0.01).结论 建立的实时荧光定量PCR检测FPGS mRNA的方法重复性好、特异度高,可用于FPGSmRNA含量分析.MTX诱导耐药后细胞株及白血病患者骨髓细胞中FPGS mRNA表达发生了变化,MTX 2种对映体形式在细胞耐药机制中可能发挥了不同的作用.     

半定量逆转录-PCR检测骨髓eIF4E相对表达水平在急性髓细胞白血病疗效监测中的意义

目的 通过比较初治、完全缓解(CR)、未缓解及复发的急性髓细胞白血病(AML)患者骨髓eIF4E相对表达水平,探讨其在AML疗效监测中的意义.方法 选择2012年8月至2014年5月,四川省人民医院血液科收治的152例初治AML患者为研究对象,纳入研究组.对研究组AML患者按照法国、美国和英国协作组(FAB)进行分型,M1型为18例,M2型为60例,M3型为28例,M4型为20例,M5型为24例,M6型为2例,分别纳入相应亚组.选择本科同期收治的20例非血液肿瘤疾病患者纳入对照组,其中,免疫性血小板减少症患者为14例,血液系统良性疾病导致的缺铁性贫血为6例.本研究遵循的程序符合四川省人民医院人体试验委员会制定的伦理学标准,得到该委员会批准,并征得受试对象的知情同意.收集研究组AML患者治疗前、后与复发前、后及对照组患者骨髓标本,采用半定量逆转录-PCR法检测骨髓eIF4E表达相对水平.以β-actin为内标物,采用PDQuest软件分析eIF4E/β-actin的比值,计算骨髓eIF4E相对表达水平.对研究组AML患者骨髓标本均采用半定量逆转录-PCR进行融合基因及突变基因检测.采用R语言软件对研究组与对照组、研究组各亚型之间化疗缓解前、后和复发前、后骨髓eIF4E相对表达水平及骨髓eIF4E与FLT3/ITD基因表达的相关性进行统计学分析.结果 研究组患者中,因各种原因未接受治疗者为21例.接受诱导化疗的131例患者中,获得CR的患者为95例(72.5％).对获得CR的患者平均随访18个月后,34例(35.8％)复发.研究组与对照组患者骨髓标本的eIF4E相对表达水平分别为0.81±0.27与0.04±0.01,二者比较,差异有统计学意义(W=3 040,P＜0.05).研究组各亚型AML患者中,M4和M5型患者的骨髓eIF4E相对表达水平较其他亚型高,但各亚型患者的骨髓eIF4E相对表达水平比较,差异无统计学意义(W=13,P＞0.05).研究组经诱导治疗后获得CR的95例患者中,化疗缓解前骨髓eIF4E相对表达水平为0.87±0.25,化疗缓解后骨髓eIF4E相对表达水平降低至0.28±0.17.化疗缓解前、后骨髓eIF4E相对表达水平比较,差异仍有统计学意义(W=4 408,P＜0.05).但缓解后骨髓eIF4E相对表达水平仍高于对照组,且二者比较,差异有统计学意义(W=1 898.5,P＜0.05).获得CR各亚型AML患者的骨髓eIF4E相对表达水平比较,差异均无统计学意义(W=34,P＞0.05).研究组34例复发AML患者中,复发前、后骨髓eIF4E相对表达水平分别为0.30±0.10和0.86±0.27,二者比较,差异有统计学意义(W=1 249,P＜0.05).eIF4E与FLT3/ITD基因突变无相关性(x2=0.017,P＞0.05).结论 eIF4E在AML的发病中起着重要作用.骨髓eIF4E相对表达水平在诱导治疗获得CR后明显下降,复发时升高.半定量逆转录-PCR检测骨髓eIF4E相对表达水平,可用于AML的疗效监测.     

外周血miR-125b-5p和miR-155相对表达量对冠状动脉狭窄程度的预测价值

目的探讨冠心病患者外周血miR-125b-5p与miR-155相对表达量与冠状动脉病变程度的相关性及其对冠状动脉狭窄程度的预测价值。方法冠心病患者57例为冠心病组,体检健康者57例为对照组,采用实时荧光定量PCR法检测2组血浆miR-125b-5p和miR-155相对表达量,分析冠心病患者血浆miR-125b-5p和miR-155相对表达量与冠状动脉病变支数及最大狭窄程度的相关性;绘制ROC曲线,评估血浆miR-125b-5p和miR-155相对表达量对冠心病患者冠状动脉狭窄50%的预测价值。结果冠心病组患者血浆miR-125b-5p(0.81±0.10)和miR-155(0.64±0.09)相对表达量低于对照组(0.98±0.12、0.82±0.13)(P0.05);冠状动脉狭窄≥50%冠心病患者血浆miR-125b-5p(0.74±0.11)和miR-155(0.59±0.10)相对表达量低于狭窄50%冠心病患者(0.87±0.08、0.72±0.09)(P0.05)。冠心病患者血浆miR-125b-5p、miR-155相对表达量与冠状动脉病变支数(r=—0.643,P0.001;r=—0.669,P0.001)及最大狭窄程度(r=—0.718,P0.001;r=—0.728,P0.001)均呈负相关。当血浆miR-125b-5p相对表达量0.776、miR-155相对表达量0.641为最佳截断值时,预测冠心病患者冠状动脉狭窄≥50%的AUC分别为0.949(95%CI:0.892～0.982,P0.001)、0.907(95%CI:0.839～0.954,P0.001),敏感度分别为91.2%、79.4%,特异度分别为92.5%和92.5%。结论血浆miR-125b-5p和miR-155相对表达量与冠心病病变程度具有负相关性,对冠状动脉狭窄≥50%具有较好预测价值。     

竞争抑制0610009E02Rik长链非编码RNA重组腺病毒穿梭载体的构建与鉴定

目的 构建可竞争抑制肝细胞内0610009E02Rik长链非编码RNA(lncRNA)的重组腺病毒穿梭载体,为探索0610009E02Rik/Notch1在肝静脉闭塞病(HVOD)肝细胞损伤修复中的作用提供有效实验方法.方法 采用基因组DNA提取试剂盒对截取的C57BL/6小鼠尾进行基因组DNA的提取,通过PCR扩增出0610009E02Rik与Notch1基因第34个外显子重叠的1 000 bp基因序列,并连接入经BamHⅠ/Nhe Ⅰ双酶切后的腺病毒穿梭载体GV359;竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体与辅助包装质粒pBHG共转染HEK293细胞,并对竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒进行包装、扩增,采用氯化铯(CsCl)不连续密度梯度离心与连续密度梯度离心2个步骤对重组腺病毒进行浓缩纯化,并对重组腺病毒滴度进行测定;测定不同感染复数(MOI)竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染肝细胞株H2.35的感染效率,并采用实时聚合酶链反应(RT-PCR)与Western blotting对竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染肝细胞株H2.35与同步培养的对照肝细胞中竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段、Notch1 mRNA及0610009E02Rik lncRNA相对表达水平及其蛋白表达水平,并进行统计学分析.结果 ①经基因序列比对分析发现0610009E02Rik与Notch1的第34个外显子存在分子量为1 000 bp的重叠序列,依据0610009E02Rik与Notch1基因序列设计含BamH Ⅰ/Nhe Ⅰ酶切位点特异性引物,通过PCR扩增出片段长度为1 000 bp的0610009E02Rik与Notch1基因第34个外显子重叠序列的竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段,DNA测序结果显示竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体与理论预期序列构建成功.②将竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体转染HEK293细胞后第12天,约90％细胞出现细胞病变(CPE),收集细胞获取病毒液.浓缩纯化病毒液经梯度稀释在感染HEK293细胞后第10天,于显微镜下观察稀释梯度1∶ (10～1010)均出现CPE,病毒滴度约为5.01×109 PFU/mL.③当竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒MOI为80,感染肝细胞株H2.35 48 h后感染效率高达95％.收集经竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒感染后肝细胞,通过RT-PCR检测竞争抑制0610009E02Rik lncRNA片段相对表达水平为同步培养肝细胞株H2.35对照的3.13±0.83倍,且差异有统计学意义(P=0.047);Notch1 mRNA相对表达水平为对照细胞的(0.38±0.08)倍,且差异亦有统计学意义(P=0.010);0610009E02Rik lncRNA相对表达水平为对照细胞的(1.04±0.26)倍,但差异无统计学意义(P＞0.05).经Western blotting检测发现,重组腺病毒感染后肝细胞Notch1蛋白表达水平较对照肝细胞减低,与Notch1 mRNA相对表达水平检测结果相一致.结论 成功构建竞争抑制0610009E02Rik lncRNA重组腺病毒穿梭载体,重组腺病毒感染肝细胞H2.35后,可下调肝细胞内Notch1 mRNA表达水平及其蛋白表达水平,这为HVOD肝细胞损伤修复的深层机制研究奠定实验数据基础.     

141例儿童急性髓系白血病的疗效及预后相关因素分析

目的评价初治儿童急性髓系白血病(AML)的疗效及探讨除急性早幼粒细胞白血病(APL)外的 AML 的预后相关因素。方法 141例18岁以下 AML 患者分成 APL 组(A 组,51例)和除APL 外的 AML 组(B 组,90例)进行回顾性研究分析。采用 Kaplan-Meier 曲线评估患者的无事件生存(EFS)率、无病生存(DFS)率和总生存(OS)率,Cox 回归模型评估预后因素。结果 B 组1个疗程完全缓解(CR)率为54.4%(49例),总缓解率为76.7%。5年累积 EFS 率、DFS 率和 OS 率分别为(28.4±9.0)%、(28.39±8.96)%和(35.5±6.3)%;A 组5年累积 EFS 率、DFS 率和 OS 率分别为(81.5±5.7)%、(94.3±4.0)%和(81.4±5.7)%:全部141例 AML 患儿5年累积 DFS 率和5年累积OS 率分别为(56.9±6.3)%和(53.3±4.8)%。B 组病例经多因素分析表明,初诊时骨髓白血病细胞比例较高和≥2个疗程达 CR 以及巩固治疗6个疗程以下是影响患者预后的危险因素(P 值均<0.05)。结论儿童 APL 预后良好。其他儿童 AML 中,初诊时骨髓原始细胞比例低和1个疗程达CR 以及巩固治疗6个疗程以上者预后较优;儿童 M_(2h)/t(8;21)与除 APL 以外的其他亚型相比没有显示预后良好的趋势;降低复发是改善儿童 AML 预后的关键。