重组腺相关病毒介导增强型绿色荧光蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:重组腺相关病毒是携带治疗目的基因的有效载体.骨髓间充质干细胞则可作为外源基因的载体和表达场所实验选择携带绿包荧光蛋白的腺相关病毒体外转染骨髓间充质干细胞,观察转染效果。方法:实验于2006-01/12在咸宁学院心血管疾病研究所和武汉大学心内科实验室完成清洁级成年SD大鼠6只.由武汉大学医学院试验动物中心提供,实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒载体由北京本元正阳基因技术公司提供,基因启动子为CMV,有效滴度4×10~(11)v.g/mL。全骨髓法分离大鼠骨髓间充质干细胞,于体积分数为0.1的胎牛血清中培养.扩增纯化至第3代。按感染复数分别为10~2.10~3.10~4,10~5 v.g/cell加入携带增强型绿色荧光蛋白的重组腺相关病毒。于4,8,24、48 h倒置相差荧光显微镜下观察腺相关病毒感染骨髓间充质干细胞的状态,随机记录200个细胞中增强型绿色荧光蛋白阳性表达率.计算感染效率。结果:①骨髓间充质干细胞转染效率:感染复数为10~3.10~4,10~5 v.g/cell时.转染8 h后骨髓间充质干细胞内可见绿色荧光蛋白的表达.其中105 v.g/cell感染效果最佳.于转染48 h时荧光强度达最高值.感染效率约28%②骨髓间充质干细胞经G418筛选后检测增强型绿色荧光蛋白阳性细胞率达98%。结论:介导绿色荧光蛋白的腺相关病毒转染骨髓间充质干细胞简便易行,感染复数为10~5v.g/cell时效果较佳,目的基因表达稳定,用于后续基因治疗具备一定的可行性。     

5和5/F35型腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞转染效率的比较

背景:在以人骨髓间充质干细胞为基础的基因治疗中,提高腺病毒载体对人骨髓间充质干细胞的转染效率尤为重要.目的:对比观察5和5/F35型腺病毒载体对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率.设计、时间及地点:对比观察,于2008-03/10在解放军北京军区总医院血液科实验室完成.材料:骨髓来源于解放军北京军区总医院血液科异基因造血干细胞移植中健康供者,均无造血系统疾病.方法:采用密度梯度离心和贴壁筛选的方法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,传至第3代后用流式细胞仪检测人骨髓间充质干细胞表型;按1×104/孔密度接种于24孔板,细胞贴壁后分别换用成骨、成脂诱导液培养,以碱性磷酸酶、油红O染色检测其分化特性.用不同滴度编码增强型绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad5/F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数转染体外培养的人骨髓间充质干细胞,荧光显微镜下观察.主要观察指标:流式细胞仪检测增强型绿色荧光蛋白阳性表达率,并用锥虫蓝拒染法检测不同病毒滴度感染后人骨髓间充质干细胞活细胞比例.结果:人骨髓间充质干细胞表面CD166、CD29、CD73、CD31、CD45、CD34和CD14阳性率分别为95.08%、99.53%、72.26%,1.50%,2.02%,3.80%和4.94%.人骨髓间充质干细胞成骨诱导后14 d碱性磷酸酶染色为阳性,成脂诱导后14 d油红O染色均为阳性.Ad5增强型绿色荧光蛋白和Ad51F35增强型绿色荧光蛋白按5,20,100,400感染复数分别感染人骨髓间充质干细胞,2 d后前者增强型绿色荧光蛋白阳性牢分别为(0.72±0.14)%,(4.97±0.46)%,(9.80±3.43)%和(45.53±6.32)%:后者增强型绿色荧光蛋白阳性率分别为(24.31±10.55)%,(55.19±13.73)%,(87.68±9.5)%和(96.57±5.64)%.在5,20,100的感染复数,各组细胞存活率均在95%以上.在400的感染复数,细胞存活率明显降低,在90%以下.结论:Ad5/F35对体外培养的人骨髓间充质干细胞的转染效率明显优于Ad5载体.     

稳定转染增强型绿色荧光蛋白大鼠骨髓间充质干细胞系的建立

背景：利用间充质干细胞或含有治疗因子的干细胞进行有选择性的杀伤肿瘤细胞是一种有前途的治疗方法。目的：建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。方法：通过脂质体介导慢病毒质粒pVector-EGFP、pHelper、Envelope共转染293T细胞完成载体病毒构建,以实时荧光定量PCR检测慢病毒滴度;取对数生长期的SD大鼠骨髓间充质干细胞,以复感染指数MOI值0,5,10,15,20加入携带报告基因增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体稀释液,72h后观察各组增强型绿色荧光蛋白的表达效率及阳性转染率。结果与结论：携带增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体系统转染293T细胞能够正确表达,滴度为1×108TU/mL。包装好的病毒颗粒转染大鼠骨髓间充质干细胞二三天后,各孔均有增强型绿色荧光蛋白的表达。MOI值从0增至10,细胞的阳性表达率逐渐提高（P〈0.05）,MOI值为10的组能获得〉70%的转染率,但MOI值从10增至20,转染率变化不明显。说明以MOI值为10的滴度将慢病毒载体可将外源基因高效转入大鼠骨髓间充质干细胞内,建立含稳定转染增强型绿色荧光蛋白的大鼠骨髓间充质干细胞系。     

碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后目的基因的表达

目的:观察碱性成纤维细胞生长因子基因转染大鼠骨髓间充质干细胞后bFGF目的基因的表达情况,并进行影响骨髓间充质干细胞的生物学特性分析。方法:实验于2005-03/2006-02在中山大学第二附属医院医学研究中心完成。①选择近交系4周龄雄性SD大鼠10只,贴壁法分离培养骨髓间充质干细胞,构建含bFGF基因的腺病毒表达载体,利用腺病毒介导转染SD大鼠骨髓间充质干细胞。②传2代后,将细胞接种12孔培养板,培养至90%融合时弃上清,调整转染病毒滴度范围为50～400。荧光显微镜下通过观察绿色荧光强度检测转染效果,以流式细胞仪检测细胞转染效率。③传2代后,胰酶消化,置于6孔板内,每孔细胞数量5×105,2d后细胞贴壁生长于盖玻片上,分别转染Ad.bFGF、Ad.GFP,同时设立空白对照。转染病毒滴度选择200。应用免疫组化和Western-Blot法鉴定碱性成纤维细胞生长因子的表达,ELISA法检测培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子的浓度。观察转染后骨髓间充质干细胞形态和生长情况的变化。结果:①pcDNA3/bFGF的鉴定结果:成功构建碱性成纤维细胞生长因子腺病毒表达载体。②Ad.GFP转染骨髓间充质干细胞的效率测定:转染48h后,绿色荧光蛋白的表达明显增强。当转染病毒滴度≤200时,腺病毒的转染效率与病毒剂量呈明显的正相关(P<0.05),当>200时转染效率趋于稳定,均在96%以上。③Ad.bFGF转染骨髓间充质干细胞的表达情况:bFGF蛋白表达免疫组化检测可见转染Ad.bFGF骨髓间充质干细胞的胞浆内充满棕褐色颗粒,阳性表达率为86%,而转染Ad.GFP及空白对照的骨髓间充质干细胞均为阴性。Western-Blot示转染Ad.bFGF的细胞裂解产物中碱性成纤维细胞生长因子含量明显高于转染Ad.GFP及空白对照。ELISA检测结果表明转染Ad.bFGF的细胞培养上清液中碱性成纤维细胞生长因子浓度第15天达高峰1467ng/L,此后逐渐下降,但至转染第28天时仍显著高于空白对照(441ng/L,128ng/L,t=4.31,P<0.01)。④转染Ad.bFGF对骨髓间充质干细胞增殖的影响:骨髓间充质干细胞的增殖分化没有明显变化。结论:采用腺病毒介导的基因转染技术可以将碱性成纤维细胞生长因子转染至骨髓间充质干细胞中,并有外源性基因和蛋白的表达。提示骨髓间充质干细胞是碱性成纤维细胞生长因子基因治疗的理想载体。     

骨髓间充质干细胞中大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒的表达

背景:研究显示,白细胞介素10在脓毒症等炎性疾病发挥了抑制炎症反应、促进疾病转归的重要作用。目的:构建大鼠白细胞介素10重组腺病毒,并以骨髓间充质干细胞为基因载体,观察外源基因在细胞中的表达情况。方法:采用反转录-聚合酶链反应方法从SD大鼠新鲜脾脏组织中提取出的总RNA中克隆大鼠白细胞介素10基因,通过AdEasy系统成功包装、扩增并纯化出含目的基因的重组腺病毒颗粒。取大鼠骨髓细胞,利用密度梯度离心法和贴壁法分离并扩增骨髓间充质干细胞,并使用流式细胞仪进行表型鉴定。以不同感染倍数的Ad.rIL-10/Ad.GFP感染骨髓间充质干细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,并用反转录-聚合酶链反应和Weaternblot方法检测目的基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达。结果与结论:成功构建了重组腺病毒Ad.rIL-10,计算病毒滴度为6.0×1010pfu/mL。重组腺病毒Ad.rIL-10对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率,当感染复数=200时为70%。提示含外源基因大鼠白细胞介素10的骨髓间充质干细胞持续高效地表达目的基因,是基因治疗的良好细胞载体。     

重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因转染兔骨髓间充质干细胞

背景:目前仍没有合适的标记方法追踪观察兔骨髓间充质干细胞组织修复及基因治疗的效果.目的:观察重组腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在兔骨髓间充质干细胞中的表达,及转染后干细胞活性的变化,以寻找稳定标记兔骨髓间充质干细胞的方法. 设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03/05在南京市第一医院骨科干细胞实验室完成. 材料:健康2月龄纯种新西兰大白兔4只,由南京医科大学实验动物基地提供.重组腺病毒Ad5/F35-EGFP为北京本元正阳基因有限公司产品. 方法:用密度梯度离心法分离纯化兔骨髓间充质干细胞,贴肇法纯化扩增.取传至第4代细胞,流式细胞仪检测细胞标志的表达,消化离心重悬后进行计数,平均分成5组,每组细胞数5.0×105个,接种于25 m2培养瓶,空白组加入50 μL的PBS液,剩余4组加入重组腺病毒Ad5/F35-EGFP进行转染,感染复数(MOI)分别为10,20,50,100,继续传代培养.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的生长状态及表面标志鉴定,转染后骨髓间充质干细胞增强型绿色荧光蛋白的表达及活性变化.结果:原代培养48 h后见细胞贴壁,8 d时细胞铺满瓶底80%以上,绝大多数呈梭形,传代后细胞增殖速度加快,三四天即可传代,第4代细胞CD29和CD44呈阳性表达,CD34与CD45呈阴性表达.转染后24 h可见绿色荧光,7 d时荧光最强,细胞转染率与感染复数值的呈线性增长关系,至49 d时仍可见绿色荧光.转染后0,7,14,28,49 d,感染复数=50组的骨髓间充质干细胞数量均与空白组基本相似(P均>0.05),即转染后细胞增殖能力无明显变化. 结论:重组腺病毒载体能高效标记骨髓间充质干细胞,感染复数为50时较为理想,增强型绿色荧光蛋白基因可持续表达49 d,且标记后不影响骨髓间充质干细胞的增殖活性.     

pIRES2-AcGFP1-CD真核表达载体构建及其在骨髓间充质干细胞中的表达

背景:骨髓间充质干细胞在体外易分离和扩增,还易于外源基因的转入及表达,在人类医学上被认为是一种理想的治疗性细胞和基因治疗中的靶细胞.目的:探讨脂质体介导胞嘧啶脱氨酶基因转染兔骨髓间充质干细胞及其基因的表达.设计:单一样本观察.单位:大连市干细胞与组织工程研发中心,大连医科大学基础医学院生化室.材料:实验于2006-03/2007-06在大连市干细胞与组织工程研发中心及大连医科大学基础医学院生化室完成.新西兰大白耳兔,5月龄,雌雄不拘,体质量2.0～2.5 kg.方法:以大肠杆菌JM109基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因片段,定向克隆至载体pMD19-T,限制性内切酶消化鉴定、基因测序后,构建pIRES2-AcGFP1-CD真核表达质粒.同时对兔骨髓间充质干细胞取材、培养、鉴定.真核表达质粒经酶切鉴定后,采用Lipofectamine 2000介导法转染经过鉴定的兔骨髓间充质干细胞.并于转染后24 h 在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达.主要观察指标:表达载体的构建及基因转染骨髓间充质干细胞鉴定.结果:实验克隆出胞嘧啶脱氨酶基因,并将其与带荧光的真核表达载体pIRES2-AcGFP1连接.经转染兔骨髓间充质干细胞24 h 后,在倒置荧光显微镜488 nm 蓝光激发下观察,pIRES2-AcGFP1-CD组和pIRES2-AcGFP1空载体组均可见细胞发出绿色荧光,未经转染的细胞未见发出绿色荧光,说明胞嘧啶脱氨酶基因成功转染了骨髓间充质干细胞.结论:骨髓间充质干细胞有望成为胞嘧啶脱氨酶基因治疗中的理想载体.     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染骨髓间充质干细胞对其成骨分化的影响

背景:在许多情况下,人体组织修复是多因子共同协调作用的结果,因而共表达多基因载体的构建能够满足多因子基因治疗的需要,是近年来基因治疗的新思路.目的:观察重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞后的表达及其对大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的影响,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础.方法:使用全骨髓培养法分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞;流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞表面标志抗原的表达;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠骨髓间充质干细胞,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测;茜素红染色检测转染后大鼠骨髓间充质干细胞的成骨分化能力.结果与结论:流式细胞仪检测显示CD90表达强阳性,CD45表达阴性;重组pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4共表达质粒成功转染至大鼠骨髓间充质干细胞中,并获得有效共表达;转染后第14天,茜素红染色阳性,能够诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础.     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景:肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用.目的:观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达.方法:培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达.结果与结论:病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109 pfu/mL.Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达.提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率.感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素.     

绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞的成骨及成脂潜能

背景:为便于进一步追踪骨髓间充质干细胞,常需对其进行标记.目的:采用绿色荧光蛋白标记兔骨髓间充质干细胞,观察标记后其诱导成骨及成脂能力.设计、时间及地点:细胞观察实验,于2007-12/2008-10在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科实验室进行.材料:4月龄健康新西兰大耳白兔6只,购自华中科技大学同济医学院动物实验中心.方法:无菌条件下取兔双侧股骨,应用密度梯度离心法及贴壁法分离纯化骨髓间充质干细胞.取传至第3代细胞,用脂质体介导法将绿色荧光蛋白质粒转入,经G418筛选得到稳定转染的细胞,分别进行成骨、成脂诱导.主要观察指标:骨髓间充质干细胞的形态、表面标志表达、绿色荧光蛋白标记情况,骨髓间充质干细胞成骨、成脂分化潜能.结果:经原代及传代培养的骨髓间充质干细胞多呈纺锤形或梭形,成纤维细胞样,流式细胞仪分析骨髓间充质干细胞CD44呈阳性表达,CD34呈阴性.经G418筛选后,镜下可见大量发出绿色荧光的骨髓间充质干细胞.骨髓间充质干细胞成骨诱导21 d后有较多的钙盐沉积,茜素红染色呈红色;成脂诱导3 d后,细胞内有小脂滴出现,2周后油红O染色示有大量脂质沉积.结论:绿色荧光蛋白标记的兔骨髓间充质干细胞经诱导培养后具有多向分化潜能.     

构建人HCN4基因重组腺病毒载体及其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率

背景:超极化激活及环化核苷酸门控阳离子通道(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated cation channel,HCN)基因由于具有不增加诱发心律失常的风险、能够接受自主神经系统调节等优势,成为目前最受关注的生物起搏备选基因.目的:构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并测定其对大鼠骨髓间充质干细胞的感染效率.设计、时间及地点:细胞-基因学体外实验,于2008-02/09在中山大学附属第二医院林百欣实验中心完成.材料:SD大鼠10只,由中山大学实验动物中心提供.携带目的基因人HCN4 cDNA的质粒pcDNA3.1-HCN4、人胚肾293细胞、大肠杆菌DH5α由中山大学附属第二医院林百欣实验中心保存.腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV、骨架质粒pAdxsi购自北京诺赛基因组研究中心有限公司.方法:质粒pcDNA3.1-HCN4用Hind Ⅲ+Xba Ⅰ双酶切后回收HCN4片段,亚克隆至pShuttle-CMV中,得到重组穿梭质粒;1-Ceu Ⅰ+1-Sce Ⅰ双酶切处理pShuttle-CMV-HCN4,回收CMV-HCN4片段,亚克隆至腺病毒骨架载体pAdxsi,得到重组腺病毒质粒;重组腺病毒质粒酶切线性化后,应用脂质体法转染293细胞进行包装扩增,得到重组腺病毒AdHCN4;应用AdHCN4转染大鼠骨髓间充质干细胞.主要观察指标:重组腺病毒质粒载体的鉴定,重组腺病毒的鉴定及滴度测定,重组腺病毒的感染效率.结果:构建的重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HCN4用Hind Ⅲ+Xho Ⅰ双酶切,得到大小为3 600 bp(HCN4)和5 100 bp(pshutIle-CMV)两个片段,DNA测序结果证实人HCN4基因的全长序列已正确插入到pShuttle-CMV穿梭质粒中;重组腺病毒质粒pAdxsi-CMV-HCN4用Xho Ⅰ酶切得到7个片段,而作为对照的空腺病毒质粒只得到6个片段;重组腺病毒质粒在293细胞中包装后产生的重组腺病毒对293细胞有致病作用;重组腺病毒AdHCN4 PCR鉴定可见657 bp的阳性扩增条带;经多次重复感染后,病毒滴度检测达2.5×10~(11) PFU/mL.成功转染AdHCN4的大鼠骨髓间充质干细胞可表达绿色荧光蛋白,当病毒感染复数值为800,转染效率最高,达90%.结论:实验成功构建携带人HCN4基因的重组腺病毒载体,并可在体外有效转染大鼠骨髓间充质干细胞.     

慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究

目的:探究慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的研究。方法:利用shRNA基因干扰技术,构建shRNA LINGO-1干扰载体,慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况分成空白对照组(未转染慢病毒的BMSCs)、空载体病毒组(转染不含shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)、干扰载体病毒组(转染shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,利用RT-PCR和Western-Blot检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、巢蛋白的表达。结果:CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2%和58.3%;CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4%和2.6%。慢病毒转染效率为90%以上。空白对照组、空载体病毒组和干扰载体病毒组的GFAP、NSE、NF和巢蛋白m RNA的相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),其中空载体病毒组和空白对照组的比较差异无统计学意义(P>0.05),干扰载体病毒组和空载体病毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点。结论:慢病毒介导shRNA LINGO-1干扰载体转染促进BMSCs可提高BMSCs向神经细胞转化的效率。     

小鼠角质细胞生长因子重组腺病毒载体的构建

目的 探讨构建表达小鼠角质细胞生长因子(KGF)基因重组腺病毒载体的方法.方法 提取小鼠肺组织RNA,经逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)获得cDNA后,PCR扩增目的基因片段.将获得的KGF基因插入载体质粒pShuttle-CMV,构建穿梭质粒pShuttle-CMV-KGF(pKGF).线性化pKGF后,转化入含AdEasy-1病毒骨架的BJ5183细菌中.筛选正确的同源重组质粒pAdEasy-1-pShuttle-CMV-KGF(pAd-KGF),转染HEK293细胞,产生病毒颗粒AdEasy-1-pShuttle-CMV-KGF(Ad-KGF).进一步大量扩增病毒,氯化铯梯度离心纯化,测定病毒滴度.制备病毒Ad-GFP为对照,显微镜下观察转染率.结果 ①经限制性内切酶酶切和基因测序鉴定,证实pKGF构建成功;②限制性内切酶酶切确定穿梭质粒重组于病毒骨架;显微镜下观察HEK293细胞形态,证实病毒包装复制成功;③病毒滴度3.0×1010 pfu/ml,达到进一步体内、外实验要求.结论 成功构建了重组腺病毒Ad-KGF,为了解KGF在肺部疾病中的作用以及进一步的基因治疗肺纤维化方法奠定了基础.     

全反式维甲酸诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化后对T细胞增殖的抑制

背景:研究表明骨髓间充质干细胞能抑制T淋巴细胞的增殖活化,发挥负性免疫调节作用.目的:利用全反式维甲酸体外定向诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化,并探讨分化细胞对T细胞增殖的作用.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-03在广东医学院完成.材料:4周龄雄性SD大鼠2只,由广东医学院动物中心提供.新鲜健康人血由广东医学院检验科提供.方法:通过贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,体外传代扩增.取传至5代的骨髓间充质干细胞,加入含0.3 mg/L全反式维甲酸、体积分数为10%胎牛血清的LG-DMEM液进行预诱导,24 h后吸去预诱导液,加入含0.6 mg/L全反式维甲酸的LG-DMEM液向神经元样细胞诱导分化.取新鲜健康人血制备反应细胞,大鼠骨髓间充质干细胞作为刺激细胞,进行单向混合淋巴细胞反应实验,设立4组:对照组,单纯反应细胞100 μL,细胞浓度1×109L-1;实验1组:1×104神经元样细胞+100 μL反应细胞:实验2组:1×105神经元样细胞+100 μL反应细胞:实验3组:1×106神经元样细胞+100 μL反应细胞.主要观察指标:诱导分化后细胞形态变化及神经细胞鉴定,单向混合淋巴细胞反应结果.结果:加入诱导液50 min后,光镜下骨髓间充质干细胞呈典型的核周体形态,3 h后大多数细胞转变为双极或多极神经元细胞样形态,出现胞体和突起.免疫细胞化学染色结果显示,大部分细胞呈神经元特异性烯醇化酶及巢蛋白阳性表达,而胶质纤维酸性蛋白呈阴性表达.与对照组比较,各实验组放射性核素每分钟闪烁数值均明显减少(P<0.05),且各实验组间比较差异亦有显著性意义(P<0.05),随着加入细胞数量的增多,抑制作用越明显.结论:全反式维甲酸可在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞,分化后的神经元样细胞能够抑制人淋巴细胞增殖,并呈剂量依赖性增加.     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景：肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用。目的：观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达。方法：培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒（Ad-ADM）,实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%～60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达。结果与结论：病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109pfu/mL。Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADMmRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11d时仍可检测其表达。提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率。感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素。     

Direct exposure of mouse spermatogenic cells to high doses of adenovirus gene therapy vector does not result in germ cell transduction

The potential for adenovirus gene therapy vectors to gain access to male germ cells was rigorously tested in the mouse by injecting high titers of the vector directly into the testis and epididymis, or by exposing sperm to the vector immediately prior to or during in vitro fertilization. The adenovirus vector carried the bacterial lacZ gene (Adbeta-Gal) driven by the Rous sarcoma virus (RSV) promoter, and infection was assessed by testing for lacZ expression, either with antibodies to LacZ protein or by staining for LacZ enzymatic activity. A total of 109 plaque-forming units (PFU) was inserted into the testis or epididymis, and in vitro fertilization was performed after sperm were exposed either to 10 or 100 PFU per sperm cell. lacZ expression was examined within testes for several weeks after injection, and in preimplantation embryos produced by in vitro fertilization with sperm exposed to the gene therapy vector. Direct injection of Adbeta-Gal into either the testis or epididymis resulted in lacZ expression only within the interstitium of the testis and not within seminiferous tubules. Despite direct exposure of spermatogenic cells or mature sperm to high titers of virus, lacZ expression was likewise not detected in embryos. These findings are consistent with the conclusion that the risk is minimal for germ line integration of adenovirus vectors exposed to male reproductive cells.     

构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体转染人骨髓基质细胞

背景：骨髓基质细胞不表达端粒酶,因而在体外传代扩增过程中端粒长度逐渐缩短,导致细胞衰老,这是限制其用于细胞治疗应用的一个重要因素。目的：构建人端粒酶催化亚单位基因慢病毒表达载体,探讨以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。方法：以pReceiver-M02-hTERT质粒为模板PCR扩增获得目的基因。用BP重组系统将目的片段重组到载体pDONR221上。然后使用LR重组系统将目的序列重组到载体pLenti6.3/V5-DEST上。将重组载体与包装质粒充分混合,利用脂质体共转染293FT细胞获得慢病毒颗粒。结果与结论：成功构建人端粒酶催化亚单位慢病毒表达载体,病毒的平均物理滴度为1.07×1012LP/L。以之转染人骨髓基质细胞,目的基因表达水平有显著提升,细胞正确表达人端粒酶反转录酶蛋白。说明以慢病毒介导的人端粒酶催化亚单位基因修饰人骨髓基质细胞能强化细胞表达人端粒酶催化亚单位。     

Wnt3a促进大鼠骨髓间充质干细胞向神经元样细胞的分化

背景:Wnt信号通路是细胞增殖分化的关键调控环节,但与骨髓间充质干细胞神经分化的联系并不十分明确.目的:寻找促进骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的Wnt信号分子.方法:首先体外分离培养大鼠骨髓间充质干细胞并传代,行形态学观察,并以流式细胞学方法检测细胞表型CD44,CD9,CD34和CD45.采用碱性成纤维细胞生长因子分别联合Wnt3a或Wnt5a的方案诱导分化,应用免疫组化和反转录-聚合酶链反应方法比较Wnt3a和Wnt5a对骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化的影响.结果与结论:骨髓间充质干细胞为长梭形,CD9,CD44高表达,CD34,CD45低表达.Wnt3a诱导组的巢蛋白和神经元特异烯醇化酶呈阳性,而胶质纤维酸性蛋白无明显表达,诱导后细胞的活力良好.Wnt5a诱导组巢蛋白呈弱阳性表达,而神经元特异烯醇化酶及胶质纤维酸性蛋白阴性.反转录-聚合酶链反应结果显示,Wnt3a诱导组巢蛋白在诱导前后均有表达,神经元特异烯醇化酶在诱导后5 d可见明显的扩增条带,10 d后更加明显.胶质纤维酸性蛋白在诱导10 d后出现较弱的扩增条带.Wnt5a组、对照组骨髓间充质干细胞在诱导后10 d巢蛋白有微弱表达,神经元特异烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白几乎无表达.提示Wnt3a分子能够促进体外培养的骨髓间充质干细胞向神经元样细胞分化.     

大鼠组织激肽释放酶8重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建大鼠组织激肽释放酶8（KLK8）的腺病毒表达载体,为进一步研究KLK8对心肌细胞的作用提供实验基础。方法采用AdEasy系统构建携带外源性KLK8编码基因的重组腺病毒载体pAd-KLK8,转染AD-293细胞包装产生重组腺病毒Ad-KLK8,TCID50法对收获病毒进行滴度鉴定,RT-PCR及Western-blot方法检测目的基因在Hela细胞的表达。结果 PCR、序列测定以及限制性酶切证实KLK8基因正确插入腺病毒表达载体,并在AD-293细胞中包装出重组腺病毒;收获病毒的滴度为3.16×1012 IU/mL。结论成功构建pAd-KLK8重组腺病毒表达载体,且重组腺病毒在Hela细胞能有效表达。     

人LIM矿化蛋白1基因腺病毒重组表达载体构建及在犬骨髓间充质干细胞中的表达

背景：研究表明LIM矿化蛋白1在体内和体外都可促使骨发生。目的：应用Adeasy-1腺病毒系统构建含人LIM矿化蛋白1基因的腺病毒重组体,并感染犬骨髓间充质干细胞,检测其体外表达及诱导成骨作用。方法：构建重组腺病毒质粒pAd-LMP-1,经人胚胎肾293细胞包装、扩增后得到复制缺陷重组腺病毒Ad-LMP-1,以最佳感染复数值体外感染犬骨髓间充质干细胞,行RT-PCR及Western Blot检测LIM矿化蛋白1、骨形态发生蛋白7基因的表达。重组Ad-LMP-1和（或）外源性重组人骨形态发生蛋白7处理犬骨髓间充质干细胞,21d后行矿化（钙）结节茜素红染色分析LIM矿化蛋白1基因的诱导成骨作用。结果与结论：①将Ad-LMP-1以感染复数值100感染犬骨髓间充质干细胞可获得最佳感染效率,感染后骨髓间充质干细胞能在基因和蛋白水平表达LIM矿化蛋白1,未引起骨形态发生蛋白7基因的表达。②Ad-LMP-1或重组人骨形态发生蛋白7均不能单独促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化,两者联合可促使骨髓间充质干细胞向成骨细胞转化。③实验成功构建重组腺病毒载体Ad-LMP-1,并实现其在犬骨髓间充质干细胞中表达,证实了LIM矿化蛋白1在诱导成骨作用中表现为与外源性重组人骨形态发生蛋白7的协同效应。