脑动静脉畸形血管内皮细胞和平滑肌细胞的体外培养

目的：探讨脑动静脉畸形（AVM）内皮细胞和平滑肌细胞的分离、培养及鉴定方法。方法：手术获得脑AVM标本后,分别采用组织块贴壁法和酶消化法对脑AVM血管内皮细胞、平滑肌细胞进行培养和形态学观察,采用免疫组化分别检测培养的内皮细胞CD31抗原和平滑肌细胞SMA抗原阳性表达。结果：相差显微镜下,培养的内皮细胞呈扁平梭形,胞核椭圆居中;平滑肌细胞呈长梭形。CD31和SMA分别在两种细胞中免疫阳性表达率超过90％。结论：AVM内皮细胞、平滑肌细胞可以获取和培养增殖,为可供研究脑血管畸形血管生物学的体外模型。     

高浓度低密度脂蛋白对血管内皮细胞NADPH氧化酶4mRNA水平、活性氧产生及细胞凋亡的影响****★◆

目的: 低密度脂蛋白进入血管内皮细胞后可刺激细胞产生活性氧,在内皮细胞的生长与损伤过程中起关键作用。实验拟进一步观察高浓度低密度脂蛋白对人脐静脉内皮细胞活性氧、NADPH氧化酶4 mRNA 水平和凋亡的影响。 方法：实验于2004-12/2006-02在卫生部老年医学重点实验室完成。①实验材料：脐带来自卫生部北京医院产科，产妇或家属签署知情同意书；低密度脂蛋白由卫生部北京医院老年医学研究所生化室经过超速离心提取。②实验过程及分组：分离人脐静脉内皮细胞。先以不同浓度的低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h以选取最佳的浓度，观察NADPH氧化酶4表达，分为：不加低密度脂蛋白的对照组；0.8 g/L 低密度脂蛋白组；1.6 g /L 低密度脂蛋白组；2.4 g/L低密度脂蛋白组。再以1.6 g/L 低密度脂蛋白浓度处理人脐静脉内皮细胞不同的时间以选取最佳的处理时间观察NADPH氧化酶4表达，分为：不加低密度脂蛋白的对照组，12 h处理组，24 h处理组，48 h处理组。以最佳浓度和最佳时间处理人脐静脉内皮细胞，并观察其NADPH氧化酶4表达、活性氧生成和凋亡。③实验评估：反转录－聚合酶链反应检测人脐静脉内皮细胞中NADPH氧化酶的表达；流式细胞仪检测胞内活性氧生成量和细胞凋亡率，Hoechst 33342染色分析细胞凋亡。 结果：①1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h后人脐静脉内皮细胞内活性氧生成量高于对照组（P < 0.05）。②1.6 g/L低密度脂蛋白处理24 h组细胞凋亡也比对照组明显增加（P < .05）。③用反转录-聚合酶链反应检测不同浓度（0.8，1.6，2.4 g/L）低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞 24 h和以1.6 g/L低密度脂蛋白处理人脐静脉内皮细胞不同时间（12，24和48 h）时NADPH氧化酶4 mRNA水平变化，结果显示与不加低密度脂蛋白的对照组相比，各组NADPH氧化酶4 mRNA表达均增强。 结论：低密度脂蛋白上调人脐静脉内皮细胞内NADPH氧化酶4 mRNA表达，并促进细胞内活性氧生成和细胞凋亡。     

血管内皮细胞和平滑肌细胞-聚羟基乙酸复合物置入裸鼠皮下构建人工血管*☆

背景：有实验表明聚羟基乙酸支架材料已成功在裸鼠及大型哺乳动物体内构建形成了组织工程化软骨、骨、肌腱等组织，将血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于聚羟基乙酸能否在裸鼠皮下形成血管样结构？ 目的：采用新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸形成的复合物移植于裸鼠皮下，验证其形成血管样结构的可行性。 设计：对比观察。 单位：原上海第二医科大学组织工程重点实验室。 材料：实验于2002-01/06在上海第二医科大学组织工程重点实验室完成。新生婴儿脐带来源于本院妇产科健康新生儿，经产妇知情同意，实验经过医院伦理委员会的批准。选用26只3~4周龄清洁级裸鼠，雌雄不拘，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。聚羟基乙酸购自Albany International Research Co.。 方法：将体外培养、扩增的新生婴儿脐静脉血管内皮细胞与平滑肌细胞接种于片状聚羟基乙酸材料上，形成细胞-材料复合物，将该复合物包绕于硅胶管使成管状结构后移植于20只裸鼠皮下为实验组，将未接种细胞的单纯聚羟基乙酸置入其余6只裸鼠皮下。 主要观察指标：分别于细胞-生物材料复合物置入后第2，6周后取出两组移植物进行大体观察，并进行苏木精-伊红染色及免疫组织化学染色，检测VIII因子及α-平滑肌肌动蛋白的表达。 结果：裸鼠26只均进入结果分析。①大体观察结果：移植物置入2周后，两组移植物均有管状结构形成；置入6周后，对照组管形结构消失，围绕硅胶管有极薄的纤维组织包裹形成，抽去硅胶管后，纤维组织失去支撑，无法维持管型结构。实验组抽去硅胶管后,新生组织仍维持管型结构。②组织学观察及免疫组化检测结果：移植物置入2周后，两组均可在镜下观察到大量未完全降解的聚羟基乙酸，对照组内少有细胞成分，实验组内可见多量细胞存在；置入6周后，两组聚羟基乙酸成分基本消失，对照组只有菲薄的纤维结缔组织形成，实验组显示有新生血管组织形成，其最内层有VIII因子阳性细胞覆盖，管壁内有大量细胞外基质及散在的α-平滑肌肌动蛋白阳性细胞存在。 结论：血管内皮细胞、平滑肌细胞-聚羟基乙酸复合物置入裸鼠皮下可形成具有与正常血管组织学结构相似的血管。     

构建内皮型一氧化氮合酶真核表达载体及在内皮细胞的表达

背景：内皮型一氧化氮合酶表达产物对内皮细胞的影响是血管外科基础研究中的重要课题，对于生物人工血管的研制有重要意义。 目的：构建内皮型一氧化氮合酶基因真核表达载体pcDNA3.1/eNOS，以脂质体为介导观察其在血管内皮细胞中的转染效率，评价表达产物内皮型一氧化氮合酶的酶学活性及其对内皮细胞生长的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察，实验于2005-07/2007-05在南京大学医学院附属鼓楼医院生物化学实验室完成。 材料：质粒PCMV-eNOS由勋阳医学院张群林教授惠赠。pcDNA3.1真核表达载体由南京大学博士后贾立军馈赠，pcDNA3.0/EGFP质粒由戚金亮博士提供。大肠杆菌DH5a和人脐静脉内皮细胞株(ECV304)为南京大学生物系保存。 方法：采用分子生物学技术，先用限制性核酸内切酶EcorⅠ酶切质粒PCMV/eNOS,电泳回收3.6 kb编码人内皮型一氧化氮合酶cDNA序列，克隆入质粒pcDNA3.1的EcorⅠ酶切位点，通过内皮型一氧化氮合酶cDNA序列中的XhoⅠ酶切位点筛选其插入载体的方向，构建pcDNA3.1/eNOS重组质粒。以Lipofec-tamine为介导将其与pcDNA3.0/EGFP共转染分离培养的人脐静脉内皮细胞(ECV304)。 主要观察指标：①观察转染后对ECV304生长的影响，在流式细胞仪和荧光显微镜下计算转染效率。②以反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测内皮型一氧化氮合酶基因的表达，测定内皮型一氧化氮合酶活性以及一氧化氮产量。③观察施加不同因素（L-精氨酸、氯化钙、乙二胺四乙酸、L-NAME）对内皮型一氧化氮合酶活性及一氧化氮合成的影响；同时检测此时ECV304生长所受影响。 结果：以脂质体为介导转染人脐静脉ECV304后，其转染效率为(32.6±2.6)%，反转录-聚合酶链反应和免疫组织化学检测到相应的内皮型一氧化氮合酶mRNA和蛋白表达，与对照组有明显差别；同时在上述不同因素影响下内皮型一氧化氮合酶活性出现明显差别；随着培养液一氧化氮浓度升高，ECV304生长曲线下降。 结论：成功构建pcDNA3.1/eNOS，在脂质体介导下能高效转染ECV304并良好表达，Ca2+是内皮型一氧化氮合酶的必要激活条件，ECV304的增生受到高浓度一氧化氮抑制。     

合并脑损伤时骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子的表达

背景：大量临床病例显示,骨折合并脑损伤患者骨痂量明显增多,骨折愈合速度明显加快。但对合并脑损伤时骨折愈合过程中血管内皮细胞生长因子的表达及作用机制缺乏前瞻性对照研究,对其潜在的机制尚未阐明。 目的：对比观察SD大鼠在骨折合并脑损伤以及单纯骨折时骨折愈合过程中骨痂内血管内皮细胞生长因子的表达变化。 方法：将SD大鼠以数字表法随机分为3组：正常对照组、单纯骨折组、骨折合并脑损伤组。脑损伤模型采用改进的Marmarou自由落体装置撞击大鼠颅骨制作弥漫性中度脑损伤模型;于左侧胫骨髁间处钻孔,插入无菌克氏钢针,在胫骨中上1/3处横向折断胫骨,制作骨折模型。术后X射线摄片观察骨折修复过程和效果;RT-PCR检及免疫组化染色观察骨痂标本血管内皮细胞生长因子表达。 结果与结论：骨折后3,7,14 d,单纯骨折组、骨折合并脑损伤组X射线表现无明显差别。与单纯骨折组相比,骨折后 24 d脑损伤合并骨折组骨折线变得模糊,形成较多骨痂量;42 d后骨折线消失,伤肢基本愈合。单纯骨折组骨痂中血管内皮细胞生长因子骨折后7 d开始出现,表达逐渐增强,约3周时达高峰,42 d已经不见血管内皮细胞生长因子表达;脑损伤合并骨折后3 d即可见血管内皮细胞生长因子表达,两三周达高峰期,其表达高峰提前且持续时间较长。说明脑损伤后大鼠骨折愈合加速,骨痂量增多,表明脑损伤对骨折愈合有促进作用,这可能与脑损伤后大鼠体内生长因子血管内皮细胞生长因子表达高峰提前且持续时间较长有关。     

兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养及相关鉴定分析

背景：从以往的文献来看，阴茎海绵体平滑肌细胞的原代培养存在着制作时间长，纯度不高以及易被成纤维细胞污染等诸多缺点。 目的: 探索兔阴茎海绵体平滑肌细胞的纯化培养技术及纯度鉴定方法。　 设计、时间及地点：对照实验，于2007-10/2008-03在上海交通大学附属第六人民医院泌尿外科，上海市组织工程研究与开发中心完成。 材料：成熟的雄性新西兰大白兔5只，体质量2.5~2.8 kg。 方法：取雄性新西兰兔新鲜的阴茎组织，利用高浓度的胶原酶消化法结合差速贴壁技术对海绵体平滑肌细胞进行纯化培养。以同期兔成纤维细胞作为对照参考。 主要观察指标：以四甲基偶氮唑盐分析细胞生长特性；以平滑肌肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白免疫荧光鉴定海绵体平滑肌细胞；以流式细胞仪检测P2及P5代细胞α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率变化情况。 结果：培养细胞四甲基偶氮唑盐显示细胞指数增长期为6 d左右，随后进入平台期。α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白均呈阳性反应，同期成纤维细胞仅α-肌动蛋白显示阳性结果。第2代细胞表达α-肌动蛋白、肌球蛋白、结蛋白阳性率分别65.3%， 42.2%, 62.3%。经过反复多次的纯化技术至第5代时，上述指标阳性表达率分别上升为92.8%，72.7%，78.1%。　 结论：通过高浓度的酶消化法及差速贴壁技术可获得高纯度的阴茎海绵体平滑肌细胞，肌球蛋白、结蛋白相对于α-肌动蛋白可以成为鉴定海绵体平滑肌细胞的特异性指标。     

异基因T淋巴细胞诱导血管内皮细胞组织因子表达的机制

目的 血管内皮细胞是移植物抗宿主病中异基因T淋巴细胞的重要靶组织，而血管内皮细胞损伤、活化后组织因子（TF）表达显著增高。因此血管内皮细胞TF表达可能在移植物抗宿主病引起的组织损伤中发挥重要作用。本研究的目的是探讨异基因T淋巴细胞能否诱导血管内皮细胞TF表达及其分子机制。方法 磁珠阳性分选异基因CD4+和CD8+T淋巴细胞。实时定量PCR和流式细胞术检测异基因T淋巴细胞作用后脐静脉内皮细胞（HUVEC）中TF在基因和蛋白水平的表达。Western blot方法检测HUVEC中MAPK的表达。观察MAPK阻滞剂对异基因T淋巴细胞诱导的HUVEC中TF表达的影响。结果 异基因CD4+ T淋巴细胞作用6、12、24h，HUVEC膜表面TF表达率分别为9.3±0.6%、34.5±1.1%、15.7±0.8%，较对照组（3.3±0.4%）显著增高（P<0.05）； HUVEC中TFmRNA表达水平亦显著增高，分别为对照组的14.4、8.9、5.3倍（P<0.05）。异基因CD8+T淋巴细胞作用12h，HUVEC膜表面TF表达率为14.6±0.7%，较对照组（2.8±0.3%）显著增高；HUVEC中TFmRNA表达水平显著增高，达对照组的5.7倍（P<0.05）。异基因T淋巴细胞作用后，HUVEC内磷酸化p38MAPK和JNK表达增强，而磷酸化ERK表达则无变化。P38MAPK阻滞剂(SB203580)和JNK阻滞剂(SP600125)可显著下调异基因T淋巴细胞诱导的TF表达。结论 异基因T淋巴细胞通过JNK和p38MAPK信号通路诱导血管内皮细胞TF表达。     

淋巴瘤细胞系Raji细胞血管内皮细胞生长因子表达及基质胶中ECV304细胞血管形成与雷公藤内酯醇的干预*☆

目的：观察雷公藤内酯醇对淋巴瘤细胞系Raji细胞血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）的表达、合成分泌以及对基质胶中ECV304细胞血管形成的影响。 方法：实验于2005-08/2006-02在华中科技大学同济医学院公共卫生学院分子生物学实验室完成。①MTT法检测3.125，6.25，12.5，25，50 nmol/L的雷公藤内酯醇在作用12，24，36，48，60，72 h对Raji细胞增殖的影响。②RT-PCR法检测12.5，25，50 nmol/L雷公藤内酯醇处理Raji细胞24 h后，细胞VEGFmRNA表达的变化。③ELISA法检测25 nmol/L雷公藤内酯醇处理Raji细胞24 h后，细胞培养上清VEGF的分泌量。④采用血管形成实验检测雷公藤内酯醇对ECV304细胞在基质胶中血管形成的影响。 结果：①雷公藤内酯醇以时间和剂量依赖方式抑制Raji细胞增殖，24 h半数抑制浓度为25 nmol/L。②Raji细胞内VEGFmRNA主要为VEGF165和VEGF121，雷公藤内酯醇明显抑制其表达，呈剂量依赖方式。③雷公藤内酯醇明显抑制Raji细胞VEGF的分泌量(P < 0.01)。④Raji细胞培养上清、10 μg/L VEGF处理的Raji细胞培养上清可促进ECV304细胞在基质胶中形成血管，而25 nmol/L雷公藤内酯醇处理的Raji细胞培养上清加入基质胶则未见血管形成。 结论：雷公藤内酯醇以时间和剂量依赖性方式抑制淋巴瘤细胞增殖、VEGF的表达分泌及血管形成。     

人脐静脉血管内皮细胞缺氧复氧损伤时黏结合蛋白多糖1及细胞外信号调节酶表达与肝素酶Ⅰ的调节

背景：研究发现肝素酶可以促使肿瘤细胞的syndecan-1脱落,而且低氧增加的巨噬细胞运动也可能与硫酸已酰肝素蛋白多糖的生物合成调节相关。 目的：观察肝素酶Ⅰ对缺氧复氧损伤人脐静脉血管内皮细胞黏结合蛋白多糖1及细胞外信号调节酶的调节作用。 方法：采用缺氧复氧处理肝素酶Ⅰ预培养的人脐静脉血管内皮细胞,用免疫组织化学、RT-PCR及western blot检测人脐静脉血管内皮细胞细胞黏结合蛋白多糖1、ERK2的表达。 结果与结论：单纯缺氧复氧后人脐静脉血管内皮细胞的黏结合蛋白多糖1和ERK2表达轻度上调。缺氧复氧处理肝素酶Ⅰ预培养人脐静脉血管内皮细胞的黏结合蛋白多糖1和ERK2明显上调,与单纯缺氧复氧处理人脐静脉血管内皮细胞相比差异有显著性意义。黏结合蛋白多糖1与ERK2上调表达成正相关。结果表明,黏结合蛋白多糖1和细胞外信号调节酶参与了人脐静脉血管内皮细胞缺氧复氧损伤的病理生理过程,肝素酶Ⅰ可能通过调节黏结合蛋白多糖1来影响细胞外信号调节酶的表达。     

大鼠骨髓间充质干细胞与成骨细胞共育环境下Ⅰ型胶原的表达

背景：骨髓间充质干细胞在不同条件下可以分别分化为成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞、脂肪细胞、神经胶质细胞、血管内皮细胞等。 目的：与成骨细胞共培养的条件下，观察大鼠骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-01/08在广州中医药大学附属骨伤科医院细胞室完成。 材料：3月龄SPF级SD大鼠6只用于骨髓间充质干细胞的分离与扩增，1 d龄以内清洁级SD乳鼠10只用于成骨细胞的分离与扩增。 方法：贴壁法分离骨髓间充质干细胞，扩增后以流式细胞仪检测其均一性及细胞表型。采用酶消化法分离培养成骨细胞，以磷酸酶染色观察细胞分泌情况。利用Transwell培养板将成骨细胞和骨髓间充质干细胞在培养液以及其中的大分子蛋白可以相互交流而细胞间不相互接触的培养板内培养，以采用普通培养板单独培养的骨髓间充质干细胞为对照。 主要观察指标：观察骨髓间充质干细胞的形态学变化及矿化能力，20 d后半定量RT-PCR方法检测骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达，茜素红染色后显微镜下计数钙化结节。 结果：流式细胞仪检测结果显示细胞均一性较好，2代细胞均一性在90%以上，CD34、CD45表达为阴性，CD44表达阳性。成骨细胞原代培养20 d时出现不透光的钙化结节，生长期细胞分裂相多见，细胞突起相互连接，汇合时呈铺路石状。茜素红染色矿化结节呈现酒红色，骨碱性磷酸酶染色可见胞质内出现黑色颗粒或块状沉淀。共培养的骨髓间充质干细胞形成的钙化结节数高于对照组(P < 0.05)；与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原表达量明显高于对照组(P < 0.01)。 结论：与成骨细胞共培养的骨髓间充质干细胞Ⅰ型胶原的表达量高，成骨能力强。     

Detection of up-regulated genes in thrombin-stimulated human umbilical vein endothelial cells

INTRODUCTION: Thrombin, a serine protease, plays an important role in such actions as coagulation, cell proliferation and inflammation. It has been sporadically reported that endothelial cells, when stimulated by thrombin via protease-activated receptors (PAR), express various mediators and proteins including cytokines, chemokines, growth factors, and adhesion molecules. However, the pleiotropic effect of thrombin on endothelial cells has not yet been fully elucidated. MATERIALS AND METHODS: We newly searched for the up-regulated genes in the thrombin-stimulated endothelial cells by thorough screening using a microarray chip, printed with 22,575 human genes, followed by verification using real-time PCR (n=3). RESULTS AND CONCLUSIONS: Twelve genes, which were 4.8 times or more up-regulated in a microarray analysis, were selected and further analyzed. In real-time PCR, ICAM-1, IL-8, BIRC3, COL3A1, CXCL3, and CXCL1 were significantly up-regulated in the thrombin-stimulated cells: 16.0-, 8.81-, 5.92-, 3.74-, 1.74-, and 1.66-fold, respectively. VCAM-1, CXCL2, CCL20, CSF2, CD69, and CCL2 were up-regulated in the thrombin-stimulated cells: 12.2-, 2.44-, 1.90-, 1.82-, 1.62-, and 1.06-fold, respectively, without attaining statistical significance. We demonstrated, for the first time, that BIRC3 (anti-apoptotic protein), COL3A1 (matrix protein synthesis), and CXCL3 (chemokine) were up-regulated in the thrombin-stimulated HUVECs.     

细胞外基质凝胶支架混合人脐静脉来源内皮细胞构建组织工程化的内皮细胞片层

背景：由于血管内皮细胞是形成血管网络的主要功能细胞，因此通过在支架复合体中复合血管内皮细胞的方式促进再造心肌的血管化是目前研究的热点。 目的：以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞，观察内皮细胞在细胞外基质凝胶中的生长过程及发育情况。 设计、时间及地点：观察实验，于2006-11/2008-01在解放军军事医学科学院基础医学研究所组织工程研究室实验室完成。 材料：取健康剖腹产孕妇的脐带分离培养人脐静脉内皮细胞。取新生SD大鼠鼠尾制备Ⅰ型液态胶原溶液。 方法：将2.4 g/L液态Ⅰ型胶原与2×M199培养基等比例混合，用0.1 mol/L NaOH 调为中性，加入分离培养3 d的人脐静脉内皮细胞，使其终浓度为4×109 L-1，再加入200 g/L的Matrigel基质凝胶。最后加入有静态拉伸力的组织工程化片层所需的模具中，构建组织工程化内皮细胞片层。 主要观察指标：体外培养20 d后光学显微镜、常规苏木精-伊红染色、免疫组织化学染色和透射电镜观察。 结果：显微镜下观察可见内皮细胞在细胞外基质凝胶中形成明显的管腔样、分支样、类似血管样结构。通过组织学和免疫组织化学的检测，证实其确为来源于人脐静脉中分离培养的内皮细胞。电镜观察可见随着时间的延长，在组织工程化内皮细胞片层中，内皮细胞可形成管腔，细胞间有紧密连接。 结论：以细胞外基质凝胶为支架混合人脐静脉内皮细胞构建的组织工程化内皮细胞片层中具有类似血管样结构。     

Expression of vascular endothelial growth factor in human umbilical vein endothelial cells stimulated with interleukin-1alpha--an autocrine regulation of angiogenesis and inflammatory reactions

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is a specific mitogen for endothelial cells. We studied the production of VEGF by human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and smooth muscle cells (SMC) in response to the stimulation with interleukin-1alpha (IL-1alpha). HUVEC expressed VEGF mRNA in response to IL-1alpha in dose- and time-dependent manners. In HUVEC VEGF protein was detected only in cell lysates whereas in SMC most of the VEGF protein was detected in the conditioned medium. Immunofluorescent staining also confirmed the cell-associated VEGF in HUVEC. IL-1alpha also induced the expression of mRNA for IL-1alpha itself in HUVEC. Cycloheximide treatment of HUVEC slightly inhibited the IL-1alpha-induced expression of VEGF mRNA, and IL-1alpha may mediate, at least in part, VEGF expression in response to IL-1alpha. The growth of HUVEC stimulated with IL-1alpha was inhibited by a neutralizing antibody against VEGF. We conclude that IL-1alpha and VEGF may play an important role in autocrine growth regulation of HUVEC.     

The proliferation of human umbilical vein endothelial cells in serum-free medium

Experimental conditions have been defined to allow human umbilical vein endothelial cells to grow in the complete absence of serum. Endothelial cells maintained in fibronectin-precoated plastic dishes could be grown in medium RPMI-1640 supplemented with transferrin, insulin, human serum albumin (HSA) and epidermal growth factor (EGF) or fibroblast growth factor (FGF). Endothelial cell growth supplement (ECGS) stimulated the proliferation in the presence of EGF or FGF, but its presence is not absolutely required to obtain growth of endothelial cells in serum-free medium. Serum was only required for a short period to allow attachment and spreading of the cells after trypsinization. Endothelial cells grown to confluence in serum-free medium exhibited morphological characteristics comparable to cells cultured in the presence of human serum, secreted normal quantities of factor VIII-related antigen into the culture medium, and synthesize prostacyclin.     

红花黄色素可促进人脐静脉内皮细胞的增殖*

背景：心血管疾病的发生、发展与内皮细胞增生及凋亡有关。 目的：观察红花黄色素对血管内皮细胞模型的保护作用。 方法：体外培养人脐静脉内皮细胞,先采用红花黄色素进行干预,随后采用溶血卵磷脂体外诱导建立人脐静脉内皮细胞损伤模型,并设置对照组。 结果与结论：与对照组比较,溶血卵磷脂干预的人脐静脉内皮细胞增殖减弱(P < 0.05),细胞凋亡增加(P < 0.05),一氧化氮浓度降低(P < 0.01),而经红花黄色素干预后上述现象均可被逆转(P < 0.05)。结果证实,红花黄色素可通过促进内皮细胞增殖,抑制其凋亡并增加一氧化氮浓度对溶血卵磷脂诱导的内皮细胞损伤起保护作用。     

Binding of tissue plasminogen activator to human umbilical vein endothelial cells

Binding of purified recombinant human tissue plasminogen activator to cultures of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) was studied in vitro. 125I-tPA was shown to bind to HUVEC in a specific, saturable, and dissociable manner. Scatchard analysis revealed a low affinity binding site with Keq = 4.2 X 10(6) M-1 and 1.2 X 10(7) sites per cell. Binding of tPA was inhibited by L-lysine, e-aminocaproic acid, and D-phenylalanyl-L-prolyl-L-arginine chloromethyl ketone but not by carbohydrates including mannose, galactose, N-acetyl glucosamine and N-acetyl galactosamine. Neat human plasma abrogates but does not totally inhibit binding of tPA to HUVEC. These results may indicate a role for endothelial cells in the removal of tPA from the circulation in vivo.     

Localized activation of m-calpain in human umbilical vein endothelial cells upon hypoxia

Bleb formation is an early event of cellular damage observed in a variety of cell types upon hypoxia. Although we previously found the appearance of the localized cytoplasmic ionized Ca(2+) concentration ([Ca(2+)](i)) rise before bleb formation at the same loci of human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) upon hypoxia, the mode of [Ca(2+)](i)-rise-induced cytoskeletal alteration remains ill-defined. The aim of this study is to clarify the mechanisms causing bleb formation after localized [Ca(2+)](i) rise. We studied the activation of m-calpain associated with the alteration of cytoskeleton-related proteins, F-actin, mu-actin, or ezrin by employing specific antibodies in conjunction with a confocal laser scanning microscopy (CLSM). Specific antibodies against 80-kDa-preactivated and 78-kDa-activated m-calpain clearly demonstrated redistribution of 80-kDa m-calpain followed by autoproteolytic activation of m-calpain to the 78-kDa form at the same loci of [Ca(2+)](i) rise in hypoxia-treated HUVECs, which was associated with the decrease of ezrin and the localized appearance of beta-actin at the same loci. In conclusion, hypoxia-induced localized [Ca(2+)](i) rise causes bleb formation at the same loci through m-calpain-catalyzed destruction of cross-linking between plasma membrane and actin filaments.     

Interaction of 3H-defibrotide with cultured human umbilical vein endothelial cells

Defibrotide is a profibrinolytic and antithrombotic drug which seems to modulate endothelial cell function. In this study, a method for radioactive labeling of the drug and its interaction with cultured endothelial cells is proposed. 3H-Acetic anhydride was used to label defibrotide. Endothelial cells obtained by collagenase treatment of human umbilical cord veins were cultured in 24-welled plastic culture dishes. Binding experiments were carried out by incubating cell cultures with media containing various concentrations of labeled defibrotide. Our results showed that labeled defibrotide has a KL value of 4.2 micrograms/ml for endothelial cells. Although the presence of a specific transporter is possible, the high molecular weight of the fraction used suggests that the interaction is binding to a specific receptor.