RNA干扰在肝病研究中的进展

RNA干扰是利用双链RNA(dsRNA)所诱导的生物体内同源mRNA转录后的基因沉默，这种作用有高度特异性，但目前其作用机制尚不清楚。RNA干扰技术目前不断完善，并广泛应用于许多领域。在肝病研究领域中，RNA干扰技术可有效抑制肝细胞凋亡，并具有抗肝炎病毒的作用。     

RNA干扰技术在抗乙型肝炎病毒感染应用中的研究进展

RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术能够特异性地降低目的基因的表达, 是目前最有效的基因沉默技术, 体内外研究均证实了RNAi在抗乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染中的作用. 近年来, 为使RNAi更适应抗HBV感染临床应用的需要, 许多学者针对小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)靶序列、转导方法、短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)载体、各种联合策略的选择及化学修饰的应用等方面进行了大量研究. 本文综述RNAi技术, 尤其是HBV特异shRNA在抗HBV感染中应用的研究进展.     

RNA干扰技术在支气管哮喘研究中的应用

支气管哮喘(简称哮喘)是以多种炎症基因表达增加或异常表达为特征的疾病.RNA干扰技术是一种转录后水平的基因沉默技术,广泛用于肿瘤、传染病等疾病治疗的研究中.近年RNA干扰技术在哮喘的发病机制以及基因治疗中也有广泛的应用.本文就RNA干扰在哮喘研究中的应用作一综述.     

RNA干扰技术在支气管哮喘研究中的应用

支气管哮喘（简称哮喘）是以多种炎症基因表达增加或异常表达为特征的疾病。RNA干扰技术是一种转录后水平的基因沉默技术，广泛用于肿瘤、传染病等疾病治疗的研究中。近年RNA干扰技术在哮喘的发病机制以及基因治疗中也有广泛的应用。本文就RNA干扰在哮喘研究中的应用作一综述。     

抑制素对HCV复制的影响

目的研究抑制素(PHB)对HCV复制的影响。方法全长基因组HCV RNA体外转染人肝癌细胞系Huh7.5,构建HCV全基因组细胞模型,分别收集24、48、72、96 h培养上清液检测HCV拷贝数;间接免疫荧光实验检测HCV核心蛋白的表达;透射电镜观察HCV感染细胞Huh 7.5-HCV的超微结构改变,鉴定HCV全基因组细胞模型。采用实时定量PCR、Western Blotting方法研究PHB在Huh 7.5-HCV细胞中的表达情况。应用RNA干扰技术检测PHB对HCV RNA的复制情况。两组间比较采用t检验。结果鉴定结果显示,成功构建HCV全基因组细胞模型。HCV RNA转染Huh7.5细胞24和48 h后,PHB mRNA表达水平分别是13.41±1.35和16.45±1.76,与对照组(1.01±0.57和1.01±0.87)相比差异均有统计学意义(t值分别为29.540、31.361,P值均0.01);PHB蛋白表达水平亦显著高于对照组(P值均0.01)。PHB的RNA干扰质粒(shRNA-PHB)转染Huh7.5-HCV细胞24和48h后,HCV RNA的水平分别为64.32±5.49和84.45±7.06,显著高于对照组(shRNA-control组,10.52±1.57和16.34±2.97,t值分别为29.538、25.908,P值均0.01)。结论 Huh7.5-HCV细胞中PHB表达的升高可能与HCV RNA的感染有关,PHB蛋白对HCV RNA复制有一定的抑制作用。     

RNA干扰抗乙型肝炎病毒治疗新进展

RNA干扰（RNA interferencing,RNAi）是短双链RNA,即小干扰RNA（small interferencing RNA,siRNA）介导的对同源基因转录后水平或者翻译水平的抑制作用.近年来应用RNAi技术治疗病毒感染性疾病的实验研究取得了很大的进展.RNAi作为一种新型的抗乙型肝炎病毒（HBV）基因治疗技术受到广泛关注,其高效、特异的抗病毒作用,设计灵活的多靶位效应使其成为一种前景广阔的基因治疗手段.     

聚合酶链反应扩增小分子干扰RNA表达框筛选抑制HBV DNA复制的小分子干扰RNA

一些短片段的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。小分子干扰RNA（siRNA）就是这种短片段双链RNA分子，能够以序列同源互补的mRNA为靶目标，降解特定的mRNA。本研究针对HBV DNA多聚酶区的siRNA，运用PCR扩增siRNA表达框的方法筛选出对HBV DNA抑制作用最强的siRNA，观察其对HBV DNA复制及HBsAg和HBeAg分泌的抑制作用。     

靶向HBx基因shRNA载体稳定表达人肝癌细胞的建立

本研究采用整合有HBV DNA而HBsAg表达阴性的人肝癌细胞株MHCC97-H,应用免疫荧光法初步研究HBx表达,并从基因组中克隆HBx基因,采用RNA干扰(RNAi)技术,构建靶向该HBx基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达载体,通过转染和筛选,研究shRNA载体在MHCC97-H细胞中稳定表达对HBx基因表达的影响,最终构建稳定表达靶向整合HBx基因的shRNA载体的人肝癌细胞模型,为进一步研究构建平台.     

RNA干扰和病毒性肝炎

乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）及丁型肝炎病毒（HDV）引起的慢性肝病,严重影响人们的健康,虽然疫苗、干扰素（IFN）和抗病毒核苷类药物正在不断发现和应用,但其治疗效果仍有不尽人意之处.近年来基因治疗领域的不断发展,尤其是RNA干扰（RNA interference,RNAi）技术为病毒性肝炎的治疗研究提供了新思路.本文将RNAi的发展及其对肝炎病毒的研究进展作一综述.     

应用shRNA研究乙型肝炎病毒X基因表达和三氧化二砷对HepG2细胞p53表达和活性的影响

目的应用短发夹状RNA介导的RNA干扰研究乙型肝炎病毒X基因（HBX）和三氧化二砷（As2O3）对HepG2细胞p53表达和活性的影响。方法以2μmol／L As2O3处理HepG2细胞和表达HBX的HepG2-X，以未处理细胞为对照，提取细胞裂解物或胞核裂解物，采用改进的酶联免疫吸附法检测p53总量和相对活性吸光度。应用脂质体介导具有HBX序列特异性短发夹状RNA表达载体Xi-S1、Xi-S2和序列无关对照Xi-S3转染HepG2-X，再次观察As2O3处理对D53表达和活性的影响。结果As2O3作用使HepG2和HepG2-X细胞p53蛋白水平上调和p53相对活性比增强。表达HBX后As2O3诱导的p53蛋白水平有所上调，但显著抑制p53相对活性。短发夹状RNA抑制HBX的表达后其对p53的活性抑制得以解除。结论As2O3使HepG2细胞p53表达上调和活性增强。应用短发夹状RNA介导的RNA干扰有利于研究HBX的表达对p53表达和活性的影响。HBX表达上调As2O3诱导的p53蛋白水平，但显著抑制p53的结合与转录调节活性。     

RNA干扰在肝病研究中的进展

RNA干扰是利用双链RNA(dsRNA)所诱导的生物体内同源mRNA转录后的基因沉默 ,这种作用有高度特异性 ,但目前其作用机制尚不清楚。RNA干扰技术目前不断完善 ,并广泛应用于许多领域。在肝病研究领域中 ,RNA干扰技术可有效抑制肝细胞凋亡 ,并具有抗肝炎病毒的作用。     

RNAi技术及其在病毒性肝炎中的研究进展

RNAi技术被《科学》杂志评选为2002年度世界十大科技发展之首,在各种疾病的基因治疗研究中发挥出了巨大的潜力.在抗肝炎病毒领域,RNAi技术可以抑制病毒复制,阻断病毒蛋白表达,且对RNA病毒和DNA病毒均有效.     

短发夹状双链RNA抑制丙型肝炎病毒IRES介导的基因表达

目的研究载体表达的短发夹状双链RNA（shRNA）对丙型肝炎病毒（HCV）IRES介导的基因表达的特异性抑制作用。方法构建HCV IRES调控的绿色荧光蛋白表达载体（pIRES—GFP）和虫荧光索酶表达载体（p5′ UTR—Luc），以及针对HCV IRES的shRNA表达载体（pshRNA-HCV）。共转染HepG2细胞，于转染后24、48、72h观察绿色荧光的强弱，用Western blot检测绿色荧光蛋白的表达，半定量逆转录聚合酶链反应法检测GFP的mRNA水平。双荧光索酶系统检测虫荧光索酶活性。结果pshRNA-HCV作用组绿色荧光强度明显弱于未干扰组，GFP蛋白表达量及虫荧光素酶活性降低60％～70％，半定量逆转录聚合酶链反应显示pshRNA-HCV导致了GFP基因mRNA水平的降低。结论针对HCV IRES的shRNA能够显著和特异地抑制该区域调控的蛋白表达水平及mRNA水平，该研究结果为利用RNA干扰技术治疗HCV感染进行了初步探索。     

乙型肝炎病毒感染BALB/C小鼠动物模型建立的实验研究

[目的]建立小鼠急性乙型肝炎病毒(HBV)感染的动物模型,观察小干扰RNA(si RNA)在体内对HBV复制和表达的影响.[方法]通过尾静脉快速、高负荷注射含1.5倍的HBV真核表达质粒(pHBV1.5).注射后第6天,MEIA检测血清HBsAg、HBeAg的水平;RT-PCR检测肝组织HBV prec/c mRNA转录的水平.同时设立pcDNA3.1正常对照组和PBS空白对照组.[结果]pHBV1.5注射组小鼠血清HBsAg、HBeAg为阳性,且肝组织表达HBeAg;而pcDNA3.1和PBS对照组未能检测到HBsAg、HBeAg的表达.[结论]成功地建立了急性HBV感染的BALB/C小鼠动物模型,在一定程度上克服了由于HBV宿主范围极窄给人们研究带来的极大限制.     

RNA干扰技术在肺癌治疗中的应用前景

RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术是近年来发展起来的新技术,能高效特异地抑制癌基因的表达,在探查基因功能和治疗人类疾病方面有广阔的应用前景。RNAi技术被《科学》杂志评为2002年度十大科技之首,小RNA被《自然》杂志评为2002年度最重要科技发现之一。本文旨在根据现有文献探讨RNAi技术在肺癌治疗中的研究进展,以期为进一步研究提供借鉴。1 RNAi技术的作用机制RNAi是一种在生物体细胞内,由特异的内源性或外源性双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发其同源信使RNA(messenger RNA,mRNA)降解的基因沉默机制。特异的ds…     

RNAi及其与丙型肝炎基因治疗的研究进展

RNA干扰(RNAi)是通过双链RNA被核酸酶切割形成21—25nt的干扰性小RNA,即siRNA,由siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子而实现的基因沉默。最近有若干将RNAi技术应用于丙型肝炎基因治疗的研究,证实其不仅对丙型肝炎病毒RNA的复制和蛋白表达具有明显抑制作用,还能通过抑制Fas基因的表达,减轻肝细胞凋亡引起的损伤。     

基于微小RNA的乙肝病毒RNA干扰表达载体的构建

目的为优化RNA干扰研究方法，构建了基于微小RNA的乙肝病毒RNA干扰表达载体。方法利用网络工具设计针对乙型肝炎病毒S区的靶干扰序列，将单链寡核苷酸退火形成双链，克隆人pcDNA6．2-GW／EmGFP—miR表达载体。结果经酶切及测序鉴定，插入序列与靶序列一致，载体构建正确。结论成功构建了新型乙肝病毒RNA干扰表达载体，为进一步体外及体内实验奠定了基础。     

针对HBV—P基因的RNA干扰抑制乙型肝炎病毒的研究

目的构建针对乙型肝炎病毒P基因编码区、能在体内转录产生发夹状小干扰RNA（siRNA）的表达载体psiHBV／p,观察RNA干扰对HBsAg、HBeAg及乙型肝炎病毒DNA复制的抑制作用。方法针对HBV—P基因区特异序列,构建siRNA的表达载体psiHBV／p。采用脂质体介导方法将其与1．3倍HBV真核表达质粒pHBV1．3共转染HepG2细胞。分别于转染后24小时、48小时、72小时用ELISA法对HepG2细胞培养上清液进行HBsAg、HBeAg的检测;于转染后72小时通过FQ-PCR法分析RNA干扰作用对HBVDNA的抑制效果。结果成功构建了针对HBV—P基因区的siRNA的真核表达重组体psiHBV／p,并发现它能明显抑制HBsAg及HBeAg的分泌,转染后第二天抑制率达高峰,分别为84％、65％。FQ—PCR结果也证实了转染72小时后,随psiHBV／p比例的升高,其对HBV DNA的抑制作用也随之增加。结论成功构建的psiHBV／p,它能在体内持续转录产生针对P基因转录体的发夹状siRNA;在细胞水平上,体内转录产生的、针对乙型肝炎病毒P基因区特异序列的siRNA对共转染的重组载体pHBV1．3有显著和特异的抑制作用。     

siRNA在实验性急性肝衰竭中的治疗作用研究进展

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是指导入特异性针对目标基因的同源双链RNA,引起目标基因的不表达或减效表达.小干扰RNA(small interfering RNA或shortinterfering RNA,siRNA)是RNAi发挥作用的重要中间效应分子[1].siRNA具有潜在的临床治疗应用前景,目前至少有5种siRNA药物已进入临床试验[2].     

RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的体外影响

目的:通过一种能够在细胞内表达短发卡RNA的逆转录病毒载体来研究RNA干扰对乙型肝炎病毒复制的影响.方法:首先针对HBV基因组Pol基因RT区寻找RNAi的靶位,并设计相对应的寡核苷酸链.然后再将一对碱基配对寡核苷酸链退火后连接入载体形成重组的质粒,并进行鉴定.在Huh-7细胞中,将通过鉴定的干扰质粒与HBV复制型质粒pHBV3.8共转染,分别应用ELISA方法来检测HBV相关的抗原,应用Northern印迹检测HBV RNA,以及应用实时荧光定量PCR和Southern印迹检测HBV核心颗粒DNA.结果:研究通过计算机方法协助寻找了3条RNAi靶位,并且构建了相应的基于逆转录病毒载体的RNA干扰质粒154i、312i和734i.结果发现312i对pHBV3.8表达有明显的抑制,HBsAg和HBeAg分别为阴性对照组的39%和41%,差异均有显著性(P=0.001,P=0.000).定量荧光PCR结果显示312i组核心颗粒DNA水平显著低于阴性对照组(21.3%±1.1%vs 100.0%±10.6%,P=0.0046).Southern blot和Northern blot结果均显示,312i组病毒复制及mRNA转录水平最低(10.5%,12.0%).结论:在HBV基因组RT区找到了一个可用于RNAi的靶位,并且构建了相对应的干扰质粒,此质粒可成功地抑制HBV复制型质粒在细胞中的复制和表达.