Peters异常:角膜基质中角膜细胞分化及细胞外基质异常

Peters异常以角膜内皮和Descemet膜的缺陷为特征,二者与角膜中央的透明性及角膜与晶状体和虹膜的前表面粘连有关。大约50％的病例有前房角发育异常,多为双眼发病。据报道,干扰视神经嵴细胞的迁移和分化有可能导致Peters异常。这种眼部异常可联合全身发育异常,可能是由于在胚胎发育过程中神经嵴细胞机能障碍所致。     

脱细胞猪角膜基质体外支持角膜上皮和基质细胞的生长

目的:探讨脱细胞猪角膜基质体外能否支持兔角膜细胞的生长。方法:体外培养兔角膜上皮细胞和基质细胞,并接种到制备的脱细胞猪角膜基质上,倒置相差显微镜和组织学观察细胞生长情况。结果:上皮细胞能在脱细胞猪角膜基质上贴附生长,10d时可形成2~3层的复层结构。基质细胞在脱细胞猪角膜基质上贴附生长后可向材料深层迁徙。结论:制备的脱细胞猪角膜基质体外可支持兔角膜上皮细胞和基质细胞的生长。     

角膜基质细胞生物学活性与角膜病变

角膜基质细胞是位于角膜基质层中平行排列的胶原纤维板潜在空隙内的扁平细胞。在正常的角膜组织中,角膜基质细胞处于相当稳定的状态。然而,在角膜病变中,角膜基质细胞在发病机制、病理过程及疾病转归中扮演了重要的角色。     

体外培养人角膜基质细胞β1整合素的表达

目的探讨β1整合素在角膜创伤愈合中的作用。方法采用免疫荧光细胞计数仪检测法。结果体外培养的人角膜基质细胞β1整合素表达的阳性率平均为95．7％，阴性表达率为4．3％。结论在角膜创伤愈合中，角膜基质细胞β1整合素的表达可能极高，从而促进角膜基质细胞与细胞外基质的粘附。     

角膜基质细胞研究进展

角膜基质细胞,存在于角膜基质层中,在正常情况下,处于静止状态。但当角膜损伤时,不同上皮来源的因子及环境信号,将影响角膜基质细胞的应答反应,决定着角膜能否完全被修复或形成角膜瘢痕。本文就角膜基质细胞的分布、形态、受激后的应答反应情况及与角膜疾病的关系作一综述。     

角膜基质细胞对淋巴细胞活化的抑制效应

建立人、大鼠和兔角膜基质细胞的原代和传代２。在基质细胞单层上观察了淋巴细胞对丝裂原刺激的增殖反应和单向混合淋巴细胞反应，并进一步分析了基质细胞与细胞培养上清对淋巴细胞活化的影响。结果显示：不同种系来源的角膜基质细胞和细胞上清对小鼠淋巴细胞具有同样的免疫抑制效应，提示：角膜细胞以及产生的可溶怀免疫抑制介质对于角膜移植片免受免疫活性细菌识别和攻击，以及长期存活可能起关一定的作用。     

蛋白激酶Cα在人角膜基质细胞中的表达

目的 观察蛋白激酶Ca（PKCα）在原位及体外培养的人角膜基质细胞中的表达。方法标本来源于北京大学第一医院眼库。人角膜基质细胞体外原代及传代培养，应用免疫组织化学法检测PKCα在培养的人角膜基质细胞中的表达；制作人正常角膜组织冰冻切片，观察PKCα在角膜基质细胞中的表达。结果免疫组织化学法检测显示：正常人原位角膜基质细胞对PKCα无明显表达，而体外培养的人角膜基质细胞有明显阳性表达。结论特殊的角膜创伤模型——体外培养人角膜基质细胞中PKCα有明显阳性表达，提示PKC在角膜基质细胞增生过程中扮演了重要角色，抑制PKC的活性有可能成为治疗角膜瘢痕愈合的一个新途径。     

Verapamil对角膜基质细胞影响的研究

目的：观察Ｖｅｒａｐａｍｉｌ（异搏定）对体外培养角膜基质细胞的影响，为其临床应用提供基础。方法：进行兔角膜基质细胞的原代和早期传代培养，并用ＭＴＴ自动比色法检测Ｖｅｒａｐａｍｉｌ对兔角膜基质细胞增殖的影响。结果：Ｖｅｒａｐａｍｉｌ浓度１０～１０００μｇ／ｍｌ作用４８ｈ和７２ｈ对角膜基质细胞增殖有明显抑制作用（Ｐ＜０．０５）。作用７２ｈ抑制率高于作用４８ｈ。结论：Ｖｅｒａｐａｍｉｌ为剂量依赖型和时间依赖型药物，能有效地抑制角膜基质细胞增殖，可望成为调节角膜伤口愈合的新药物。     

角膜缘niche细胞与基质细胞维持角膜缘干细胞功能的对比研究

目的　比较角膜缘niche细胞（limbal niche cells，LNCs）与角膜缘基质细胞（limbal stromal cells，LSCs）在维持角膜缘干细胞功能上的不同特性。方法　将LNCs和LSCs分别从6个角膜缘组织分离，并在相同的条件下培养、传代。LNCs与LSCs经丝裂霉素C（mitomycin C,MMC）处理后分为LNCs组与LSCs组作为饲养细胞分别与角膜缘干细胞共培养，比较两组角膜缘干细胞克隆形成率（colony-forming efficiency,CFE）、上皮细胞复层化以及细胞标志物和部分基因的表达。结果　LNCs组角膜缘干细胞CFE（6.57±1.54）%高于LSCs组（1.43±0.47）%。 LNCs组细胞复层上皮数（4~5层）多于LSCs组（2~3层）。角膜缘干细胞克隆与免疫荧光染色及mRNA半定量分析结果显示，LNCs组比LSCs组表达了更多干细胞标志物ΔNp63，能更有效地维持角膜缘干细胞的细胞特性。逆转录PCR分析结果显示，LNCs组与LSCs组都分泌了一些维持角膜缘干细胞生长的生长因子，但LNCs组比LSCs组高表达上皮型钙黏蛋白（E-cadherin），低表达营养神经素3（NT3），能更好地支持角膜上皮增殖。结论　LNCs比LSCs能更好地支持角膜缘干细胞的生长及维持其干细胞特性。     

神经嵴发育异常相关眼病

神经嵴是一个动态的胚胎干细胞群体，在眼部发育中起着关键作用。神经嵴与周围的神经外胚层、表面外胚层和中胚层相互作用，发育成眼球及其附属器的多种组织结构，包括角膜基质及内皮、小梁网、虹膜基质、睫状肌、玻璃体和脉络膜血管、Müller细胞等。眼部神经嵴细胞迁移和发育异常会引起一系列复杂的眼部疾病，包括影响眼前段的疾病，如Axenfeld-Rieger综合征、Peters异常、无虹膜、原发性先天性青光眼和指甲-髌骨综合征，以及影响眼后段的缺陷性疾病，如CHARGE综合征和鳃-眼-面综合征，此外还有一些罕见的神经嵴疾病的眼部异常，如Waardenburg综合征、Treacher-Collins综合征和Char综合征等。在这里我们将神经嵴细胞发育异常导致的眼部相关疾病做一综述，探讨与神经嵴迁移和发育相关的基因，以及这些基因的突变和缺陷如何导致眼部疾病。     

猪脱细胞角膜基质组织结构特点与生物相容性研究

背景构建组织工程化角膜时,载体的选择十分重要。目前有多种载体可供选用,但脱细胞角膜基质是公认的较好载体。目的观察猪脱细胞角膜基质的组织结构特点,评价其与异种角膜基质和上皮细胞的生物相容性。方法取猪角膜组织进行组织块培养,经胰蛋白酶-EDTA酶消化角膜上皮、基质、内皮细胞,支架组织于-20℃冷冻干燥后灭菌保存。猪脱细胞角膜基质石蜡切片行常规苏木精一伊红染色,光学显微镜下观察组织的形态学特征;扫描电镜下观察其组织结构特点;并对其物理特性,如抗拉性、膨胀性、含水量和透明度进行评价。将猪脱细胞角膜基质移植到兔角膜基质层内,同时与体外培养的兔角膜上皮细胞共培养4周,分析其组织和细胞生物相容性。结果经酶消化处理后猪角膜组织中未见上皮、基质和内皮细胞,其胶原纤维直径大小、排列与正常角膜组织相同,抗拉性、膨胀性、含水量和透明度等物理特性与正常猪角膜相似。猪脱细胞角膜基质行异种兔角膜基质层间移植1周时可见轻度水肿,2周后水肿基本消退,4周时透明度较好。猪脱细胞角膜基质与兔角膜基质之间贴附良好,未见炎症反应及新生血管。兔角膜上皮细胞接种于猪脱细胞角膜基质上共培养4周后CK3表达阳性。猪脱细胞角膜基质脱水前与脱水2h、4h后及正常猪角膜基质间的抗拉性、膨胀性、含水量的差异均无统计学意义（P〉0．05）,但脱水2h、4h后及正常猪角膜基质的透明度明显好于脱水前,差异均有统计学意义（P〈0．01）。结论猪脱细胞角膜基质组织结构与正常猪角膜相似,与兔角膜基质和上皮细胞具有良好的生物相容性。     

兔角膜上皮和基质细胞共同培养模型中的相互作用

目的探讨利用细胞生物学和工程学原理在体外培养角膜上皮和基质细胞,模拟上皮和基质细胞相互作用的生存环境,了解角膜上皮细胞和基质细胞间的作用规律。方法分别进行体外兔角膜上皮细胞和基质细胞的原代培养及传代的二维平面培养,利用特殊培养装置制作上皮细胞和基质细胞共同培养的模型,达到两种细胞胞体不混合,而其分泌的成分可以相互渗透、相互作用的目的,从而更好地观察各自细胞的生长状态。描绘角膜上皮细胞和基质细胞的生长曲线及二者在相互作用模型中的生长曲线。利用激光共聚焦显微镜观察上皮细胞和基质细胞在单独培养和三维共同培养模型中上皮细胞胞间通讯的变化特点。结果角膜上皮细胞倍增时间为3．45d,共同培养的上皮细胞倍增时间为3．30d,角膜基质细胞倍增时间为2．11d,共同培养的基质细胞倍增时间为2．32d,共同培养的上皮细胞增长与单独培养的上皮细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）,共同培养的基质细胞增长与单独培养的基质细胞相比,差异有统计学意义（P〈0．01）。与角膜基质细胞共同培养的角膜上皮细胞胞间通讯明显高于单独培养的基质细胞,差异有统计学意义（U=2．691,P〈0．05）。结论共同培养的细胞模型是理想的。角膜上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下比单独培养下的增殖能力增强,而角膜基质细胞在与上皮细胞共同存在的条件下比单独培养的增殖能力减弱;而上皮细胞在与基质细胞共同存在的条件下,细胞间通讯增强。     

异种角膜基质材料的制备和体外细胞种植的实验研究

目的研究异种角膜基质生物支架材料的制备方法和体外种植兔角膜基质细胞后细胞在材料上的生长、增殖情况。方法将York猪全层角膜用去垢剂联合0．25％胰蛋白酶、DNA-RNA酶祛除猪角膜基质细胞并冻干制备成支架材料；将兔角膜组织块用胶原酶消化后，用含10％血清的DMEM培养液体外培养，并做波形丝蛋白，角蛋白免疫组织化学染色检测；将培养的兔角膜基质细胞的2～3代接种在材料上，培养5d后，做HE染色、扫描电镜观察。结果猪角膜基质片经脱细胞处理后，细胞成分祛除干净并保留了角膜组织的三维网格状结构，网状间隙明显增大，利于细胞生长；体外培养的兔角膜基质细胞波形丝蛋白染色为阳性、角蛋白染色为阴性；HE染色、扫描电镜结果显示兔角膜基质细胞在支架材料上生长、增殖良好。结论异源性角膜经祛脱细胞处理而获得的生物支架材料利于异种细胞的黏附和增殖，可进一步用于组织工程角膜的研究。     

脱细胞角膜基质为支架构建组织工程角膜上皮组织的实验研究

目的 比较氯化钠(NaCl)-十二烷基硫酸钠(SDS)-胰蛋白酶与分散酶(Dispase)-聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X-100)两种角膜组织脱细胞方法的效果,探讨以脱细胞角膜基质为支架构建组织工程化角膜上皮组织的可行性.方法 实验研究.采用完全随机化设计的方法,分别用NaCl-SDS-胰蛋白酶和Dispase-Triton-X-100处理兔角膜组织,使用裂隙灯显微镜、光学显微镜及透射电镜观察经两种方法处理后的角膜基质特性和脱细胞效果.以兔角膜缘上皮细胞为种子细胞,Dispase-Triton-X-100处理的猪角膜前弹力层与基质为支架,体外重建兔角膜上皮细胞层,并进行形态学、组织病理学及免疫组织化学检测.结果 两种方法处理过的兔角膜基质大体形态相似,灰白色不透明,水肿明显,质地柔软.组织病理学和超微形态学观察显示两种方法处理的兔角膜基质胶原排列规整,NaCl-SDS-胰蛋白酶处理的角膜组织残留了部分基质细胞碎片,而Dispase-Triton-X-100处理的角膜组织未见基质细胞碎片.兔角膜缘上皮组织块接种于脱细胞猪角膜前弹力层与基质上,24 h角膜上皮细胞开始游出,3～4 d融合呈片状,7～8 d形成单细胞层.组织工程化角膜上皮细胞表达CK3.结论 Dispase-Triton-X-100处理方法的角膜组织脱细胞效果良好.以脱细胞猪角膜前弹力层与基质为支架.可在体外构建组织工程化兔角膜上皮组织.     

细胞外基质对角膜创伤修复的作用

细胞外基质在角膜创伤修复过程中起至关重要的作用，其合成代谢受生长因子的调控，两者之间的的关系是是近年来令人感兴趣的新的研究领域，它将有助于阐明角膜创伤修复机制本文概述了细胞外基质的成分、结构、功能和在角膜创伤修复中的作用以及生长因子在务修复过程中对细胞外基质的调控。随着人们对角膜基础研究认识的不断深入，证明角细胞外基质（ＥＣＭ）并非一种被动无活性的结构支架，而是一种活泼的动态物质，它影响着细胞的分     

脱水保存角膜基质为载体培养角膜内皮细胞的实验研究

目的探讨以脱水保存角膜基质/后弹力层为载体培养角膜内皮细胞,构建组织工程化角膜内皮细胞移植膜的可行性及其机理。设计实验性研究。研究对象体外培养的兔角膜内皮细胞和脱水保存角膜基质/后弹力层。方法兔角膜经中性蛋白酶37°C孵育5min,去除内皮细胞保留后弹力层和角膜基质,无水氯化钙脱水后低温保存,使用前磷酸盐缓冲液复水。纯化的角膜内皮细胞接种于基质载体的后弹力层上进行体外培养,直至生长融合为细胞单层,倒置显微镜下观察细胞形态学变化。在不同时间点(1、2、4、6d)收集植片进行HE染色和电镜检测,分析组织结构的变化。主要指标角膜内皮细胞在脱水保存角膜基质/后弹力层载体上形成单层时间和生长特性,组织工程化角膜内皮细胞移植膜的三维结构和超微结构。结果角膜内皮细胞在载体上快速贴壁生长并增殖,体外培养6～7d即融合成单层,复合角膜内皮组织由基质/后弹力层和单层扁平内皮细胞组成,与生理状态下的角膜内皮组织相近。电镜下组织培养的兔角膜内皮细胞间连接紧密,细胞为多边形,胞核清晰,具有正常兔角膜内皮细胞的超微结构。结论角膜内皮细胞能够在干燥脱水保存基质/后弹力层载体上良好生长,并形成形态结构与正常角膜内皮组织相似的细胞单层,为角膜内皮细胞移植提供了新的载体选择。(眼科,2006,15:164-168)     

维甲酸对人角膜基质细胞增殖和移行的影响

目的 探讨维甲酸对角膜基质创伤愈合的可能的作用。方法 利用细胞计数法、ＭＴＴ法观察维甲酸对培养的人角膜基质细胞增殖的影响；利用缺损闭合实验观察维甲酸对培养的人角膜基质细胞移行的影响。结果 ＭＴＴ法和细胞计数法显示，维甲酸抑制体外培养的人角膜基质细胞增殖，抑制作用呈剂量、时间依赖性（Ｆ检验，Ｐ〈０．０５），抑制率在１１．４％～３９．２％。细胞计数法还显示，０．５％苔芬兰染色示各组活细胞均在９０％以上     

角膜基质细胞—PGA生物支架复合体外培养研究

目的 研究角膜基质细胞与PGA亲和力,为组织工程技术建构角膜提供重要的理论依据和参数。方法 体外分离获得角膜基质细胞,经培养扩增后接种于PGA,并对细胞－生物材料复合物进行体外培养,观察细胞生长代谢。应用MTT技术测定角膜基质细胞与PGA的黏附率。结果 角膜基质细胞能够在PGA中黏附、伸展和分泌基质,MTT测得细胞黏附率为71．40％。结论 角膜基质细胞与PGA具有较好的亲和力,PGA可以作为构建角膜的生物材料。     

兔角膜内皮、上皮及基质细胞体外培养扩增的研究

目的 建立角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养扩增的简单稳定的方法，为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 内皮细胞与后弹力层在培养基中孵育后消化法获原代细胞，胰酶消化去除表层上皮后取角膜缘，组织块法培养角膜缘上皮细胞，基质细胞应用胶原酶消化法获原代培养，各细胞融合后胰酶消化依次传代培养。结果 原代内皮细胞4—5d融合成单层细胞，可连续传6—7代。上皮细胞1周左右生长融合，连续传3—4代后细胞形态改变。基质细胞接种6—7d后近融合，传代后增殖明显，可连续传10代。结论依据角膜组织特征选择合适的方法体外分离、培养角膜3种细胞成分，可获连续传代扩增的角膜细胞。     

房水对培养的角膜基质细胞的影响

目的观察房水对角膜基质细胞生长的作用。方法将新西兰大白兔的角膜去除后弹力层、内皮层和上皮层后,得到基质层,用组织块培养法体外培养角膜基质细胞。在实验组的培养基中加入10％房水,对照组使用常规培养基培养。通过CCK8实验测得角膜基质细胞的吸光度（A）值以分析细胞增生的情况。分别在培养基中加入2．5％、5％、10％、15％、20％的房水,用明胶酶谱法检测基质金属蛋白酶（MMPs）的活性。结果倒置显微镜观察可见培养的角膜基质细胞呈多角形或树枝状,与对照组相比,实验组的细胞生长状态良好,培养的角膜基质细胞数量明显增加。明胶酶谱法显示实验组的条带比对照组清晰。实验第1～5天分别测角膜基质细胞的A值,实验组的检测条带明显强于对照组,〉10％的房水培养组检测的条带明显强于2．5％、5％房水培养组。CCK8检测表明,培养1～5d实验组的角膜基质细胞A值明显高于对照组,差异均有统计学意义（P〈0．05）。结论房水作用于角膜基质细胞后,可促进角膜基质细胞的生长,10％房水对体外培养角膜细胞有促细胞增生的作用。