突变的大肠癌线粒体DNA转染NIH3T3及LST细胞的研究

目的了解大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）线粒体DNA的突变，克隆突变的大肠癌线粒体DNA（mtDNA）基因，构建peDNA3．1（＋）-mtDNA真核表达重组体，并导入NIH3T3及LST细胞，以探讨线粒体基因突变与肿瘤发生的关系。方法提取大肠癌细胞株（SW480，LOVO，HT29）mtDNA，扩增D—LOOP区，产物用DNA自动测序法进行序列分析。利用DNA重组技术将其定向插入真核表达质粒peDNA3．1（＋），并用脂质体法导人NIH3T3及LST细胞。用MitoCa．ptureMitochondrialApoptosisDetectionKit试剂盒染色后用流式细胞仪及荧光显微镜检测转染细胞的凋亡情况。扩增并测序分析转染细胞的D—LOOP区突变特点。结果检测出大肠癌细胞株SW480，LOVO，HT29细胞mtDNAD—LOOP分别有10，9，8个突变位点。转染前后，各组间细胞凋亡无明显变化。转染细胞的核基因组可扩增出目的基因及Neo基因。4株NIH3T3转染细胞mtDNAD-环区分别检测到9，11，8，4个突变点，并相应有3，4，3，2个多态性变化。结论（1）转染突变的大肠癌细胞mtDNA后转染细胞的mtDNA均可发生多处的突变位点。（2）通过转染后突变的外源性的mtDNA可以整合到核基因组内。（3）突变的mtDNA转染LST细胞及NIH3T3细胞后，不影响转染细胞的凋亡改变。（4）mtDNA的突变可能通过影响体细胞mtDNA的突变和通过外源性mtDNA在核内的整合从而影响癌基因或抑癌基因的表达异常，从而参与肿瘤的发生发展。     

前列腺癌特异突变DNA聚合酶β表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化

目的观察前列腺癌(CPa)特异突变DNA聚合酶β(polβ)表达载体转染NIH3T3的细胞生物学行为变化。方法采用业已成功构建的2例特异突变polβ表达载体(pCDNA3.1-M1和pCDNA3.1-M2),采用脂质体包裹转染NIH3T3细胞,观察比较这些突变对细胞polβ基因mRNA和蛋白表达的影响以及引发的相应的细胞周期和细胞自发突变率等细胞生物学行为的变化。结果筛选得到高表达PCa特异突变polβ的NIH3T3细胞株(NIH3T3-M1,NIH3T3-M2)和高表达野生型polβ的NIH3T3细胞株(NIH3T3-W)。RT-PCR和Western印迹结果显示,外源DNApolβ在转化的NIH3T3细胞中呈现高表达。与转染空载体和未转染的NIH3T3细胞相比,转染PCa特异突变polβ的2个细胞株和转染野生型polβ的细胞株的细胞周期的S期比例及转染细胞的HGPRT(次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因的自发突变率均显著增加,且转染野生型polβ的细胞株亦显著高于转染PCa特异突变DNApolβ的细胞株。结论 DNApolβ高表达介导了肿瘤发生的分子机制。     

Survivin靶向RNA干扰对人结肠癌HCT116细胞生长影响的研究

目的设计和构建survivin特异性的siRNA真核表达载体,观察survivin siRNA重组体对人大肠癌HCT116细胞株生长的影响,为大肠癌的基因治疗提供理论依据。方法针对survivin mRNA序列设计合成编码siRNA的DNA模板,构建2个survivin RNAi真核表达载体;实验分为survivin siRNA重组质粒转染组、空载体组和HCT116组,转染大肠癌细胞HCT116细胞,采用RT-PCR法检测survivin mRNA的表达,观察重组质粒对转染的HCT116细胞survivin基因表达的影响;用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测量细胞生长情况;用流式细胞术检测细胞凋亡情况。结果测序表明survivin干扰序列完全正确,RT-PCR结果显示2条survivin siRNA真核表达质粒均能有效抑制survivin mRNA的转录表达。MTT比色法检测显示,与阴性对照组及未转染组细胞比较,干扰组细胞增殖率明显下降（P〈0．05）。流式细胞术检测的转染重组质粒组细胞凋亡率高于脂质体对照组和空质粒对照组（P〈0．05）。结论成功构建了survivin干扰真核表达载体,siRNA重组体能有效抑制人大肠癌细胞survivin mRNA表达,并抑制结肠癌细胞生长,促进其凋亡。     

凋亡素基因对人结肠癌细胞作用的研究

目的探讨凋亡素基因的导人对人结肠癌细胞的影响。方法将凋亡素基因VP3克隆人真核表达载体pEGFP-C2，构建成重组质粒pEGFP-VP3。用脂质体转染法将pEGFP-C2和pEGFP—VP3分组分别转染人类结肠癌细胞（Lovo）和小鼠胚胎成纤维细胞（NIH3T3），通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白在不同组细胞中的定位、表达及细胞的生长、凋亡情况，MTT法测定不同组细胞的生长曲线，并用AnnexinV—FITC流式细胞技术检测细胞的凋亡率。结果在Lovo／EGFP组和3T3／EGFP—VP3组细胞中，EGFP均匀分布于细胞中，细胞形态无明显变化，细胞凋亡率较非转染细胞组亦无明显增加。而在Lovo／EGFP-VP3组细胞中，EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核，并逐渐变粗，最后细胞碎裂成片状，流式细胞技术检测Lov0／EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于其他对照组（P〈0．01）。结论pEGFP-VP3可诱导人类结肠癌细胞凋亡。     

霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达

目的 构建霍乱肠毒素A亚单位基因（ctxA）真核表达重组质粒，并在NIH3T3细胞中进行表达。方法 用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a—ctxA上切下ctxA基因，导入真核表达载体peDNA3．1（＋）．重组子pcDNA3．1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后，用脂质体法将重组质粒pcDNA3．1-ctxA转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法和Westernblot对peDNA3．1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果 重组质粒peD—NA3．1-ctxA成功转入NIH3T3细胞。利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达，用Westernblot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29ku的蛋白。结论 成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒peDNA3．1-ctxA，并在NIH3T3细胞中表达出29ku的CTA蛋白。     

太白楤木抗肝纤维化的实验研究

目的：探讨太白槐木对成纤维细胞增殖及超微结构的影响，研究太白槐木抗肝纤维化的作用机制。方法：采用体外培养的NIH3T3（小鼠胚胎成纤维细胞）作为肝星状细胞（HSC）的替代模型，常规培养，秋水仙碱、齐墩果酸及太白槐木中药血清作用于细胞，用MTT（四唑盐比色）法检测各组药物血清对NIH3T3细胞增殖的影响；用放射免疫法测定培养上清液中透明质酸（HA）的生成；电镜下观察药物血清对NIH3T3细胞超微结构的影响。结果：太白槌木、齐墩果酸、秋水仙碱血清组细胞均可抑制细胞增殖（P〈0．05）；显著抑制HA的合成，降低NIH3T3细胞培养上清中HA水平，与对照组比较差异有显著性意义（P〈0．01），而3组之间差异无显著性意义（P〉0．05）。结论：太白格木中药血清可显著抑制NIH3T3细胞增殖和细胞外HA的合成，并可通过诱导HSC细胞凋亡来达到减少细胞数目、促进纤维化的逆转，从而达到抗肝纤维化的作用。     

杜氏利什曼原虫四川分离株无鞭毛体蛋白基因的克隆及真核表达

目的 克隆、真核表达杜氏利什曼原虫四川株的无鞭毛体蛋白（amastin）编码基因。 方法 PCR扩增杜氏利什曼原虫四川汶川人株L.d.SC10H2与四川南坪犬株L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因，将该基因导入pcDNA3.1（+），构建真核表达重组质粒，转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光法鉴定重组质粒的瞬时表达；RT-PCR和Western blotting鉴定稳定表达。 结果 2株杜氏利什曼原虫均扩增出552 bp的无鞭毛体蛋白基因，同源性为86％。转染后在NIH3T3细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞中获得短暂表达。细胞裂解产物经Western blotting，在相对分子质量（Mr）约20 000处检测到阳性杂交信号，表明无鞭毛体蛋白基因在NIH3T3细胞内获得了稳定表达。 结论 获得了我国杜氏利什曼原虫四川分离株L.d.SC10H2和L.d.SC7的无鞭毛体蛋白基因序列，并在NIH3T3细胞中稳定表达。     

人垂体瘤转化基因1对NIH3T3细胞无直接肿瘤转化作用

目的 克隆人垂体瘤转化基因1（hpTTG1)cDNA并确定其在不同细胞内的分布和其在体外是否具有直接的肿瘤转化作用。方法 （1）用快速扩增（RACE）克隆hPTTG1 cDNA；（2）用Northern印迹检测hPTTG1 mRNA在肿瘤细胞的表达水平；（3）构建pCMX-GFP-hPTTG1表达质粒并转染HeLa等6种细胞，用荧光共聚焦显微镜观察GFP－hPTTG1的细胞内分布；（4）构建pIRESneo-hPTTG1表达质粒并转染NIH3T3细胞，经G418选择后检测hPTTG1是否有直接的致肿瘤作用。结果 （1）hPTTG1与大鼠PTTG的同源性为79％。开放可读框架由609bp组成，编码202个氨基酸；（2）hPTTG1在血液系统肿瘤细胞表达水平较其它肿瘤细胞为高，其表达水平由强到弱依次为THP－1，Raji,CEM,AR230,DLD-1,H1299,HeLa,HepG2和A549肿瘤细胞；（3）hPTTG1的细胞内分布在HeLa、Cos-7和DU145细胞主要位于细胞核，在A549、DLD－1和NIH3T3细胞则呈胞浆和胞核的弥漫性分布；（4）hPTTG1明显抑制NIH3T3细胞的生长，降低[^3H]胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入率。hPTTG1单独不具有细胞肿瘤转化作用。结论 （1）hPTTG1在血液系统肿瘤细胞表达水平较其它肿瘤细胞为高；（2）hPTTG1的细胞内分布与细胞类型有关；（3）hPTTG1单独不具有细胞肿瘤转化作用。     

突变型HBV前C-C基因疫苗的构建及真核细胞表达

目的采用点突变技术对HBV前C—C基因中的蛋白酶切位点进行4处点突变,构建突变型HBV前C—C／ENHⅡ重组基因疫苗,转染HepG2细胞,研究其存真核细胞内的表达情况。方法采用单引物二次PCR法对质粒VEC依次进行基因点突变,得到151＋154（VE2）、151＋154＋164＋167点突变（VE4）2种突变型疫苗,转染HepG2细胞,通过细胞免疫化学、酶联免疫分析、免疫印迹等方法检测其在HepG2细胞内的表达情况及表达产物的分子量。结果VEC、VE2、VE4转染HepG2细胞均胞浆表达目的蛋白,产物分子量分别为18、20、22kD,细胞裂解液的HBeAg含量VE4、VE2高于VEC,上清中则反之。结诊安蛮刭HRV前C—C基因疫苗VE2、VE4构建成功并表达预期病毒前C蛋白前体。     

肝细胞核因子3结合位点的突变及对抑制乙型肝炎病毒复制的影响

目的 研究肝细胞核因子(HNF)3结合位点HNF3β对HBV转录和复制调节作用的机制.方法 通过分别位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和sp区上的HNF3结合位点,构建HBV基因组2个或3个位点的复合突变,获得4个复合突变型重组质粒;分别转染非肝源性细胞小鼠成纤维细胞株(NIH3T3),Northern印迹法检测3.5 kb、2.4 kb/2.1 kb、0.7 kb HBV RNA的转录水平,Southern印迹法检测HBV DNA复制中间体水平,观察上述突变是否会影响HNF3β对HBV转录和复制的抑制作用.结果 在被转染的非肝源性细胞3T3中,HNF3β仍能降低4个复合突变型HBV重组质粒3.5 kb HBV RNA的转录水平,抑制HBV DNA的复制;与未共转染HNF3β相比,转录水平下降50%～75%、复制水平下降80%～96%.结论 在位于HBV基因组的多聚酶编码区Pp、PS1p和Sp区上的3个HNF3结合位点中,即使其中2个或3个结合位点同时联合突变,HNF3β仍能抑制HBV的转录和复制.Pp、PS1p和Sp区HNF3结合位点的突变不能阻断HNF3β对HBV复制的抑制作用.