犬黑素皮质素受体-2基因的分子克隆及序列分析

目的分离犬MC2R基因cDNA5′末端，分析其启动区域特点。方法采用了RNA连接酶介导的RACE（RLM-RACE）技术分离了犬MC2R基因和局部序列比对工具（Basic Local Alignment Search Tool，BLAST）对CDS区进行了初步验证。结果新分离了犬MC2RcDNA的5′末端，并对其启动区序列作了初步分析。序列分析显示，该基因至少由两个外显子（exon1和exon2）组成，exon1和exon2的一部分编码5′非翻译区（5′-UTR），exon2其余的部分编码整个编码区。结论克隆了犬MC2R基因的5′末端，在其启动区发现了inr、SF-1、SP1、CRE、PPRE、AP-1等多个顺式作用元件，为犬MC2R表达调控研究奠定基础。     

犬MC1R基因多态性的研究

目的 利用PCR—RFLP和PCR—SSCP技术分别检测犬MC1R基因中两个序列T105A和R306Ter的基因多态性，为遗传育种、培育出更加优良的实验用犬奠定基础。方法 以224只犬为实验材料，对犬MC1R基因T105A片段和R306Ter片段分别进行PCR-RFLP和PCR—SSCP分析，并且分别对具有RFLP和SSCP多态性的片段进行克隆测序，找出等位基因的差异位点。结果 经对犬MClR基因的PCR-RFLP分析，发现犬MC1R基因的T105A序列具有多态性，表现为三种基因型：AA、AB和BB。通过对具有RFLP多态性的片段进行克隆测序发现MC1R基因在编码第105位氨基酸的密码子处存在由G到A的单碱基突变，该突变导致第105位氨基酸发生由精氨酸向苏氨酸的改变，此外在第207位氨基酸的密码子处还发现由A到G的单碱基突变，并产生了一个HhαI限制性内切酶位点。同时，经过犬MC1R基因的PCR—SSCP分析，发现犬MC1R基因的R306Ter序列具有多态性，表现为三种基因型：CC、CD、DD.通过对具有SSCP多态性的片段进行了克隆测序发现，MC1R基因在编码第306位氨基酸的密码子处存在一个由CGA到TGA的终止突变，而使翻译终止。结论 利用PCR—RFLP和PCR—SSCP分析技术证实犬MC1R基因具有明显的多态性。     

犬MC1R基因R306ter与毛色性状相关性研究

目的　分析犬MC1R基因中R30 6ter位点多态性与犬毛色表型的相关性 ,为遗传育种 ,培育出更加优良的实验用犬奠定基础。方法　采用PCR SSCP技术 ,对MC1R基因R30 6ter位点进行基因多态性检测 ,分析位点多态性与毛色性状之间的相关性 ,并对该位点进行克隆测序。结果　PCR SSCP分析结果表明 ,R30 6ter位点序列具有多态性 ,表现为C、D二个等位基因和CC、CD及DD三种基因型。对R30 6ter多态性片段克隆测序发现 ,MC1R基因在编码第 30 6位氨基酸的密码子处存在一个由CGA到TGA的终止突变。结论　经统计分析结果表明在杂种犬中MC1R基因多态性与毛色性状不存在显著的相关性 ,这可能是由于外科手术学教学用犬是杂种犬 ,其遗传背景不同所致。由于MC1R基因的R30 6ter位点内存在碱基变异 ,因此在杂种犬中表现出明显的PCR SSCP多态性     

犬MC1R基因多态性与毛色表型相关性的研究

目的利用PCR—RFLP技术检测犬MC1R基因中T105A位点的多态性,分析该多态性与犬毛色表型的相关性。方法抽取36只比格犬血液并提取DNA,记录毛色表型。采用PCR—RFLP技术,对MC1R基因T105A位点进行基因多态性分析。用相关分析的统计学方法分析位点多态性与毛色性状之间的相关性。结果PCR—RFLP分析结果表明,T105A位点序列具有多态性,表现为A、B二个等位基因和AA、AB及BB三种基因型。A、B等位基因频率分别为58．33％和41．67％,基因杂合度（H）为0．59。基因型从频率为33．33％,BB为16．67％,AB为50．00％。经统计分析结果表明MC1R基因多态性与毛色性状不存在显著的相关性,这可能与Agouti蛋白对毛色的影响有关。结论在比格犬中MC1R基因的T105A位点表现出明显多态性并与毛色性状无相关性。     

SCN5A基因启动区+495bp～+584bp片段的克隆与功能分析

目的 为了研究大鼠心肌SCN5A基因启动区 495bp～ 584bp区域内的顺式作用元件对转录调控的影响.方法 应用聚合酶链反应扩增大鼠心肌SCN5A基因启动区 495bp～ 584bp片段,与荧光素酶报告基因载体pGL3-promoter重组,以pGL3-promoter空载体为对照,瞬时转染人胚肾母细胞(HEK293)和小鼠胚胎心肌细胞(H9C2),检测荧光素酶活性.结果 成功构建的pGL3-P1重组载体的荧光素酶活性与pGL3-promoter对照载体相比,在HEK293细胞无明显差别(P＞0.05),在H9C2细胞荧光活性增高(22.5±5.4)倍(P＜0.01).结论 大鼠心肌SCN5A基因启动区 495bp～ 584bp区域存在对基因的转录调控活性具有增强作用的组织特异性顺式作用元件.     

hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列的克隆及生物信息学分析

目的扩增人纤维蛋白原样蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶基因5′端调控序列,构建荧光素酶报告基因表达载体,对hfgl2基因5′侧翼启动子序列进行生物信息学分析,预测可能的调控区域及顺式作用元件。方法用聚合酶链反应(PCR)法从人外周血单个核细胞基因组DNA中扩增hfgl2凝血酶原酶基因5′端调控序列,PCR产物酶切后克隆至pGL3-Basic载体,重组质粒行酶切及测序鉴定,使用在线分析软件对5′端调控序列中的转录因子结合位点及启动子序列进行预测。结果扩增了长度为1 567bp的hfgl2凝血酶原酶基因5′端序列,酶切及测序鉴定证实构建的pGL3-hfgl2质粒插入片段正确无误,分析显示该基因序列共含有138个、31种顺式作用元件。结论构建hfgl2基因近端启动子转录调控序列荧光素酶报告基因的表达载体为研究hfgl2的转录调控奠定了基础。     

人CYB5R2基因真核表达载体的构建

目的构建人CYB5R2基因真核表达载体,并观察其在人鼻咽癌细胞HONE1中的表达。方法根据表达载体pCMV-Tag3A上的多克隆位点和CYB5R2基因CDS序列设计引物,应用RT-PCR从人睾丸cDNA中克隆出CYB5R2的CDS,并进行TA克隆。对经PER、双酶切和双向测序验证正确的质粒,进行CDS目的片段的回收,将其连接于pCMV-Tag3A载体的多克隆位点内构建真核载体,然后进行PCR、双酶切和双向测序验证。脂质体法转染鼻咽癌细胞HONE1细胞,荧光显微镜观察和RT—PCR验证该基因的表达。结果PCR、双酶切和双向测序结果显示pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体构建成功,荧光显微镜和RT—PER的结果显示该重组质粒在HONE1细胞中正确表达。结论成功构建了pCMV-Tag3-CYB5R2-CDS真核表达载体,并在鼻咽癌细胞HONE1中表达,为进一步验证其抑癌作用及探索其抑癌机制做准备。     

结核分枝杆菌phoS2基因的克隆及序列分析

目的 扩增结核分枝杆菌phoS2基因,并将其克隆至质粒pGEMT中进行核苷酸序列特性分析.方法 以结核菌标准菌株H3TRv为模板,通过PCR技术扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因,将其重组到pGEM-T载体后进行酶切鉴定及序列测定和生物信息学分析.结果 成功扩增出结核分枝杆菌phoS2抗原基因,测序表明该片段开放阅读框为927bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为81%,推导编码氨基酸序列同源性为87%.结论 成功克隆phoS2基因,为结核病原核表达及相关研究奠定了基础.     

PIK3R2基因错义变异所致MPPH综合征I型患儿遗传学分析

目的：总结1例罕见的巨脑畸形-多小脑回-多指（趾）畸形-脑积水（MPPH）综合征Ⅰ型患儿的临床特点及基因检测结果。方法：回顾性总结2021 年1月在温州医科大学附属第一医院新生儿科确诊的1例MPPH I型患儿的临床表现、影像学检查和基因检测结果等病例资料。并通过文献复习,分析和总结国内外已报道的MPPH I型综合征病例的临床特征及遗传学特点。同时对患儿进行全外显子组检测,对候选变异用Sanger测序进行家系验证。结果：先证者携带PIK3R2 基因c.1117（p.Gly373Arg）杂合错义变异,国内既往未见报道,其父母未携带相同变异。相关文献报道的16例MPPH I型患儿主要表现为不同程度的脑积水、巨脑畸形、癫痫发作、多指（趾）畸形、发育迟缓及智力发育障碍。共报道了3个基因突变位点,其中p.Gly373Arg杂合变异最多（14例）,罕见变异包括p.Leu401Pro变异1例和p.Asp557His变异1例。结论：PIK3R2 基因c.1117G＞A（p.Gly373Arg）杂合错义变异可能是该患儿发生MPPH I的原因,脑积水考虑与该综合征相关,其母亲再次怀孕时需接受产前诊断。     

爱泼斯坦-巴尔病毒潜伏期膜蛋白2A cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆爱泼斯坦－巴尔病毒（EBV）潜伏期膜蛋白2A（LMP2A）基因，研究其基因工程疫苗，方法：用逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）扩增出EBV B95．8株LMP2A全部编码蛋白的基因，并克隆至载体pGEM-T中，通过α－插入失活，PCR及EcoRⅠ、SmaⅠ限制性内切酶双酶切等鉴定重组质粒，采用Sanger双脱氧终止法测定cDNA片段的核苷酸 序列。结果：克隆出LMP2A第1个外显子到第8个外显子的全部编码蛋白的cDNA，测序结果与EB病毒B95．8原型株LMP2AcDNA作同源比较，完全一致，结论：本实验克隆了LMP2A基因的全部编码蛋白的cDNA全长片段。     

人CD4分子cDNA的克隆及序列分析

目的：克隆人的CD4基因，为进一步研究病毒感染CD4^ 细胞的分子机制奠定基础。方法：用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增出SupT1细胞株的编码CD4蛋白分子全长的基因，克隆至质粒pAS2—1中，并转入大肠杆菌DF15α。通过Amp抗性筛选、PCR及限制性内切酶EcoRⅠ，BamH Ⅰ双酶切等鉴定重组质粒并测定其中编码CD4片段的核苷酸序列。结果：克隆出编码CD4蛋白分子全长的cDNA，测序结果与文献报道进行同源比较，序列基本一致。结论：本实验成功克隆了编码人CD4蛋白全长的cDNA片段。     

小鼠GITRL基因的克隆和序列分析

目的：克隆小鼠GITRL基因全长编码区的cDNA,同时对其序列分析。方法：采用RT-PCR方法,从小鼠树突状细胞获得GITRL基因的cDNA,克隆至pMD18-T载体,选择阳性克隆并进行序列测定。结果：扩增得到的GITRL基因编码区cDNA的全长519hp,编码173个氨基酸残基,与GeneBank中发表的序列完全一致。结论：获得小鼠GITRL基因的克隆,为进一步研究其生物学功能提供基础。     

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的：克隆恶性疟原虫海南株(FCC1／HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因，并进行序列分析。方法：根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物，用PCR技术从FCC1／HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因，并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序，用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果：PCR扩增得到特异的FCC1／HN株PfSSP2基因序列，酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明，所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp，编码559个氨基酸残基。序列分析表明，我国恶性疟原虫FCC1／HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代，1处氨基酸序列增加；各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7％以上。结论：克隆了恶性疟原虫FCC1／HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明，恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。     

人hole基因的克隆和序列分析

目的 克隆人的hole基因,并进行生物信息学分析.方法 以胚胎心脏cDNA文库为模板,进行PCR扩增得到hole基因的ORF.并进行亚克隆入PMD18-T载体,转化大肠杆菌DH5α,用Xho1进行酶切和测序鉴定阳性克隆.利用Internet和GeneBank数据库对测序结果正确的hole基因进行生物信息学分析. 结果克隆了hole基因,测序结果正确;生物信息学分析表明, hole基因开放读码为960 bp,编码319个氨基酸;同源性分析表明,人的hole与鼠、鸡hole蛋白具有高度同源性.多种组织的半定量RT-PCR研究表明,该基因在心脏、肝脏、肺、脑、肾脏、脾脏、胰脏均有表达,其心脏表达最高. 结论成功克隆hole基因,对其功能进行了初步预测,为进一步的功能研究打下基础.     

阴道毛滴虫衰老相关基因Tv-Sir2-like克隆与序列分析

目的：克隆单细胞模式生物阴道毛滴虫(Tv)Sir2基因，以便探讨其功能。方法：构建Tv cDNA表达文库，筛选出Tv-Sir2-like基因，并对该基因进行序列分析。结果：成功克隆Tv-Sir2-1ike基因。测序及序列分析显示，Tv-Sir2-1ike如基因开放读码框长1116bp，编码371个氨基酸残基的蛋白质。该氨基酸序列与SIR2的同源性最高，并具有SIR2 3个特征性的高度保守结构域。结论：推测Tv-Sir2-like是Sir2的同源基因，其表达产物可能参与Tv转录沉默，并调节Tv的细胞周期。     

Cloning and Sequence Analysis of the Promoter of LePS-2 Gene in Lithospermum erythrorhizon

目的 克隆紫草LePS-2基因的启动子,分析该启动子的调控元件,为研究LePS-2基因的表达调控机制奠定基础.方法 以紫草愈伤组织基因组DNA为模板,利用Genome walking技术扩增LePS-2基因上游启动子序列,将序列提交至PLACE网站对该启动子进行调控元件预测.结果 获得LePS-2基因启动子区域序列1164bp,PLACE软件分析表明,该启动子中存在根特异性元件、暗诱导性元件、激素应答与调节相关元件以及一些转录因子结合位点等.结论 启动子元件ATATT和YTCANTYY可能分别赋予LePS-2表达的根特异性和暗诱导性;另外在LePS-2基因启动区域还发现MJ应答元件TGACG,表明MJ有可能参与对LePS-2的表达调控.     

单纯疱疹病毒Ⅱ型糖蛋白D基因Sav株及野生株的克隆和序列分析

探讨我国单纯疱疹病毒Ⅱ型（ＨＳＶ－２）糖蛋白Ｄ（ｇＤ）基因结构和功能及与国外的病毒株之间的差异，为研制我国生殖器疱疹疫苗提供理论依据。方法利用聚合酶链反应从ＨＳＶ－２Ｓａｖ国际标准毒株及我国１例生殖器疱疹复发型野生株中扩增、克隆出糖蛋白Ｄ基因序列。结果将野生株和Ｓａｖ株ＤＮＡ序列及氨基酸序列同ＨＳＶ－２Ｇ株比较，发现其ＤＮＡ同源性为９９．２％，氨基酸同源性为９９．１％。结论我国ＨＳＶ－２野生株同国外的Ｓａｖ株及Ｇ株ｇＤ基因存在高度的同源性，同时也存在一定变异。